Micropropagacin de Stevia rebaudiana Bertoni, un Cultivo

Promisorio para Mxico

Dumas Oviedo-Pereira1, Silvana Alvarenga Venutolo2, Silvia Evangelista Lozano3,

Gabriela Seplveda Jimnez3 y Mario Rodrguez-Monroy 3*

1. Institucin Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Carrera 78 No

65-46 Robledo, Medelln, Colombia.

2. Escuela de Biologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica. Cartago,

Costa Rica.

3. Centro de Desarrollo de Productos Biticos del Instituto Politcnico

Nacional. Calle CEPROBI 8. Col. San Isidro. Yautepec, Morelos. Mxico CP.
62730. mrmonroy@ipn.mx

RESUMEN
Stevia rebaudiana Bertoni (stevia) es una planta con potencial industrial, debido a que contiene
glucsidos diterpenos, que le confieren propiedades edulcorantes. Adems, la planta tiene
propiedades medicinales y es usada como anticancergena, antidepresiva, antiviral, antimicrobiana,
y el control de la hipertensin y la obesidad, que son motivo de estudios recientes. Industrialmente,
los glucsidos de stevia se usan para la preparacin de alimentos y es un ingrediente de jugos,
nctares, bebidas carbonatadas, pastelera, confitera, yogurt, chicles, entre otros. Sin embargo, el
porcentaje bajo de germinacin de las semillas limita la propagacin de la planta por esta va.
Como una alternativa se realiza la propagacin por mtodos asexuales, a travs de esquejes o
brotes laterales; pero el nmero de propgulos es limitado y hay problemas de transmisin de
enfermedades, lo que probablemente afecta la concentracin de los compuestos de mayor inters.
Por ello se realizan estudios usando nuevas estrategias de propagacin de esta especie. En esta
revisin se presenta una descripcin de las caractersticas del cultivo de S. rebaudiana y del
estado del arte del uso de herramientas biotecnolgicas basadas en la micropropagacin para la
obtencin de plntulas sanas de S. rebaudiana.

BioTecnologa, Ao 2015, Vol. 19 No. 2 14

Palabras clave:, Stevia rebaudiana Bertoni, sistemas de micropropagacin, biorreactores de
inmersin temporal.

ABSTRACT
Stevia rebaudiana Bertoni is a plant with industrial potential, due the presence of diterpenes
glycosides with sweetener properties. Additionally, the plant have medicinal properties and used as:
anticancer, antidepressant, antiviral, antimicrobial, and control of hypertension and obesity; which
are subject of studies. Industrially, stevia glycosides are used in the food preparation as ingredient
of juices, fruits nectars, soft drinks, pastries, confectionery, yogurt, and chewing gum. However, the
low percentage of seed germination limits the propagation of the plant by this pathway.
Alternatively, plant propagation is realized by asexual methods, using cuttings or side-shoots; but
the production of propagules number is limited and there is problems of diseases transmission that
probably affect the compounds concentration of high interest. Therefore, studies using new
strategies of vegetative propagation of this species are realized. This review shows a description of
the crop characteristics of S. rebaudiana and the art state of the use of biotechnology tools based
on micropropagation for obtaining healthy seedlings of S. rebaudiana.
Key words: Stevia rebaudiana Bertoni, micropropagation systems, temporary inmersion
bioreactors.

Stevia rebaudiana Bertoni. arcilloso, con una porcin regular de humus,

Stevia rebaudiana es un arbusto adems se adapta a pH entre 6.5 y 7.5
ramificado nativo de Paraguay y conocido por (Goyal & Goyal, 2010; Jarma-Orozco, 2010;
los indgenas guaranes como Kaa he-he, Jimnez-Quesada, 2011; Ramrez-Jaramillo,
que se traduce como Hierba dulce. Las 2011).
hojas de la planta se han usado S. rebaudiana se distribuye en Paraguay
tradicionalmente como edulcorante y como y zonas vecinas de Brasil y Argentina.
un potencializador del sabor (Pande & Gupta, Actualmente el cultivo se ha extendido a
2013). La planta se desarrolla Japn, China, Taiwn, Tailandia, Indonesia,
preferentemente en climas con lluvias que Filipinas, Australia, Rusia, Ucrania,
van desde los 1400 a 1800 mm anuales y Kazajstn, Malasia, Indonesia y Amrica
temperaturas entre los 15 y los 30 C. La Latina. Los principales pases productores de
intensidad de luz alta y los fotoperiodos stevia son: China, Paraguay, Colombia,
largos favorecen el desarrollo y crecimiento Argentina, Brasil, Israel, Tailandia, y Japn.
de los entrenudos y del rea foliar. El suelo Actualmente el consumo de hoja seca se
adecuado para el desarrollo de la planta es estima en aproximadamente 200 millones de
de tipo areno-arcilloso, franco y franco- dlares. Japn es el pas que controla el

BioTecnologa, Ao 2015, Vol. 19 No. 2 15

mercado de ventas de compuestos calricos, lo que los hace apropiados para
purificados con ventas cercanas a los 130 aquellas personas que deben controlar la
millones de dlares. En Sudamrica los concentracin de azcar en la sangre.
pases productores principales de hoja son Actualmente, la industria alimentaria y
Paraguay y Brasil (Ramirez-Jaramillo et al., farmacutica tiene gran inters en la
2011). produccin de esta planta; adems debe
En Mxico, no se han encontrado resaltarse que tambin se le atribuyen
estadsticas oficiales sobre la produccin de propiedades medicinales, como:
stevia. El cultivo se introdujo y promovi por anticancergena, antidepresiva, antiviral,
la Secretaria de Agricultura, Ganadera, antimicrobiana, controla la hipertensin y la
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin, obesidad, entre otras (Barba et al., 2015;
SAGARPA (Das et al., 2011; Jarma-Orozco, Carbonell-Capella et al., 2015; Holvoet et al.,
2010; Pande & Gupta, 2013; Ramrez- 2015; Langle et al., 2015; Ramya et al., 2014;
Jaramillo et al., 2011). El reporte del Instituto Shivanna et al. 2013; Thiyagarajan &
Nacional de Investigaciones Forestales, Venkatachalam, 2012). Hoy en da se le
Agrcolas y Pecuarias, INIFAP (2011) utiliza industrialmente como aditivo para
propone que en Mxico las zonas de alto alimentos como, jugos, nctares, bebidas
potencial para el cultivo de stevia, se carbonatadas, pastelera, confitera, yogurt y
distribuyen principalmente en los estados del chicles, entre otros (Lemus-Mondaca et al.,
Pacfico como: Sinaloa, Nayarit, Jalisco, 2012).
Colima, Michoacn, Guerrero, Oaxaca y Wlwer-Rieck (2012) reporta que los
Chipas. Tambin se describen algunas reas grupos qumicos mayoritarios son los esteviol
importantes en el Golfo de Mxico en los glucsidos, los diterpenos no glucosilados,
estados de Tamaulipas, Veracruz y en menor los polifenoles y las vitaminas solubles en
medida Tabasco, Campeche, Yucatn y agua. El estudio tambin destaca que existen
Quintana Roo.En los estados de Quintana por lo menos treinta esteviol glucsidos en
Roo y Chiapas hay reportes de su diferentes concentraciones, que varan en
introduccin a campo con rendimiento de proporcin segn el genotipo y las
siete toneladas de hoja seca por hectrea al condiciones de cultivo. Se reporta que la
ao. En el mercado Mexicano se pueden produccin de esteviol glucsidos vara en un
encontrar diversos productos a base de rango del 5 al 22 % del peso seco de la hoja.
stevia como edulcorantes, en presentaciones El estevisido y el rebaudisido A
lquidas y granuladas (Ramrez-Jaramillo et (Figura 1) son compuestos que puede tener
al., 2011). un poder edulcorante de 100 a 400 veces
Los compuestos endulzantes naturales mayor a la de la sacarosa (Lemus-Mondaca
de S. rebaudiana no son compuestos et al, 2012; Wlwer-Rieck, 2012). La

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 dulcsido A estar presentes en cantidades
proporcin de estos dos esteviosidos puede del 1 al 2 % del total de los glucsidos
variar del 5-22 % y para el rebaudisido A del (Pande & Gupta, 2013). Adems se reporta
25 al 54 % de los glucsidos totales. En la la presencia de otros compuestos como;
variedad Morita, que es una variedad vitamina A, B2, B6, carotenos, aminocidos,
mejorada la proporcin de rebaudisido es carbohidratos, enzimas, cidos orgnicos,
de 9.2% y la del rebaudisido A del 61.6% polisacridos y microelementos (Goyal &
(Herrera et al., 2012, Ohta et al., 2010; Goyal, 2010; Lemus-Mondaca et al, 2012;
Wlwer-Riecker, 2012). La presencia de Pande & Gupta, 2013; Ramirez-Jaramillo et
otros glucsidos minoritarios como los al., 2011).
rebaudisidos C, D, E y F y el

Nombre R1 R2

Esteviol H H

Etevisido Glu Glu-1, 2-Glu

Rebaudisido A Glu Glu-1, 2-Glu

l
1, 3-Glu
Rebaudiosido B H Glu-1, 2-Glu
l
1, 3 Glu
Rebaudisido C Glu Glu-1, 2- Ram
l
1, 3-Glu
Rebaudiosido D Glu-1, 2-Glu Glu1,2-Glu
l
1,3-Glu
Rebaudisido E Glu-1, 2-Glu Glu-1, 2-Glu

Rebaudisido F Glu Glu-1, 2-Xil

l
1,3-Glu
Dulcsido A Glu Glu-1, 2-Ram

Fig. 1. Estructura qumica de los principales estevisidos presentes en Stevia rebaudiana Bertoni,
Glc Glucosa, Ram Ramnosa, Xil Xilosa (Adaptado de Woelwer-Rieck et al., 2010).

17
 El rendimiento de los compuesto y forestales (Orellana, 1998; Evans et al,
edulcorantes de Stevia depende del 2003). Arriaga & Larqu (2001), sealan que
genotipo, del mtodo de propagacin de la para Mxico, el 52 % de las empresas
planta y de las tcnicas agronmicas biotecnolgicas en el sector agropecuario,
empleadas (Wlwer-Riecker, 2012; Pande & utilizan tecnologas de cultivo de tejidos
Gupta, 2013). La planta se puede propagar vegetales. Las caractersticas que presenta
naturalmente mediante esquejes y por el cultivo de in vitro para la multiplicacin de
semillas. En el primero de los casos, se corre plantas son: a) el uso de pequeos
el riego fitosanitario de propagar plantas segmentos de la planta (explantes), que son
contaminadas con enfermedades. En el caso el punto de partida para el inicio del cultivo,
de propagacin por semillas, stas presentan manteniendo condiciones de asepsia, b) se
una baja viabilidad y un bajo porcentaje de obtiene un gran nmero de plntulas en corto
germinacin, entre el 10 y el 38 % (Shahid et tiempo, en comparacin con la propagacin

al., 2014). En este sentido, es indispensable por esquejes, c) el crecimiento es continuo a

desarrollar programas de seleccin de lo largo del ao, sin hacer diferenciacin por

plantas con mejores caractersticas las estaciones climticas al crecer en cuartos

fenolgicas y con un perfil qumico deseable controlados, d) se requiere menos espacio y

para satisfacer las necesidades de los mantenimiento para la propagacin que en

productores. Las herramientas los mtodos tradicionales, e) se asegura la

biotecnolgicas basadas en la calidad sanitaria de las plantas (Orellana,

micropropagacin de la planta por cultivo de 1998; Evans et al., 2003).

tejidos vegetales, representan una S. rebaudiana es una planta que ha sido

herramienta potencial para la propagacin y estudiada para su multiplicacin por sistemas

mejoramiento de la planta de S. rebaudiana in vitro. En la Tabla 1, se muestra una

(Osman et al., 2013). sntesis de los trabajos sobre la

micropropagacin y aclimatacin con S.

PROPAGACIN IN VITRO DE Stevia rebaudiana en los ltimos cinco aos. De la

rebaudiana Bertoni. revisin de los reportes destaca el uso de la

La multiplicacin masiva de las plantas variedad criolla, adems de que el medio de

in vitro permite la reproduccin de un cultivo utilizado es el de Murashige & Skoog

genotipo especfico, sin que se presente (1962), con el empleo de reguladores de

segregacin de caracteres genticos, lo que crecimiento del tipo auxinas y citocininas. La

se observa inevitablemente durante la organognesis es la va de propagacin

propagacin sexual por semillas. En la reportada en todos los casos, utilizando

actualidad, la micropropagacin se est preferentemente como fuente de explante

aplicando con gran xito en una gran gama segmentos nodales, si bien tambin se

de cultivos hortcolas, ornamentales, frutales reporta el uso de yemas apicales y hojas

18
 Tabla 1. Micropropagacin de Stevia rebaudiana Bertoni en diferentes sistemas.

Explantes Medio Reguladores Sistema Tasa de multiplicacin Sustrato de Sobrevivencia Referencias

del (Brotes/explante) aclimatacin de plantas (%)
crecimiento*
Segmento nodal y yema MS BA, AIB, KIN, Frascos Gerber 11 Tierra, abono, arena. 82 Das et al., 2011
axilar AIA.

Yema axilar MS BA, AIB, AIA, Tubos de 21.6 Tierra, vermiculita. No reportado Preethi et al., 2011
ANA. ensayo

Hoja MS BA, AIB, KIN, Tubos de No reportado Tierra, soilrite. 92.3 Dey et al., 2013
cotiledonar CCO. ensayo
Segmento nodal MS BA, AIB, KIN, Frascos Gerber 17.5 Tierra, arena, 94.8 Verma et al., 2011
AIA, ANA. vermiculita.
Segmento nodal MS BA, KIN, TDZ, Frascos Gerber 9.48 Tierra, Peat moss, 97.0 Soliman, 2013
AIA, ANA. vermiculita.

Segmentos nodales MS BA, AIB, AIA. Tubos de 4.25 Tierra, abono. 67.0 Laribi et al., 2012
ensayo
Segmento nodal MS BA, AIB, KIN, Tubos de 15.7 Tierra. 65.8 Thiyagarajan &
AIA, NAA. ensayo Venkatachalam, 2012
Segmento nodal y apicales MS BA, ANA. Frascos Gerber 6 Peat moss, agrolita. 75.0 Vargas Gutirrez,
2012
Segmentos nodales MS AG3 RITA y BIT 14.2 No realizado No realizado Jimnez Quesada,
2011
Segmentos nodales MS BA, KIN, AIB Tubos de 3.42 Tierra, arena, Peat 90 Jitendra et al., 2012
ensayo moss
Segmentos nodales MS AIA, BA, KIN Frascos Gerber 2.68 Turba Ms del 80 Vsquez-Baxcajay et
al., 2014

19
 Segmentos nodales MS BA, KIN, ANA Tubos de 9.31 Tierra, arena , 80 Chotikadachanarong &
ensayo vermicompost Dheeranupattana, 2013
Yema axilar y apical MS BA, KIN, ANA, Tubos de 8.6 Arena, tierra, turba 90 Ali et al., 2010
AIA ensayo
Microtallos MS BA, Zeatin, Matraz 8.9 Turba, perlita 90 Shatnawi et al., 2011
AIB, AIA, ANA
Brotes apicales y MS BA, KN, IBA Frascos 9.56 No reportado Ms 80 Modi et al., 2012
Segmentos Nodales Gerber, matraz,
frasco de
plstico
Segmentos Nodales MS BA, KIN, AIB Frascos Gerber 5.28 Coco picado, arena 80 Autade et al ., 2014

Segmentos Nodales MS BA, KIN, AIB, Tubos de 36.9 Peat moss, Arena 75 Mohamed, 2011
ANA ensayo, frascos
Gerber
Segmentos nodales, MS BA, KIN, AIB, Tubos de 3.0 Tierra y arena No reportado Singh et al., 2013
brotes apicales y AG3, 2,4-D, ensayo, matraz
segmentos internodales. ANA. AIA
* BA: benciladenina; AIB: cido-3-indolbutrico; KIN: cinetina; CCO: cloruro de clorocolina; AIA: cido indolcetico; ANA: cido naftalenactico; TDZ: tidiazurn; AG3: cido giberlico;
Zeatin: zeatina; 2,4-D: cido 2,4 diclofenoxiactico.

20
cotiledonares. El cultivo en medio semislido 14.1 y 14.2 brotes/explante, respectivamente.
es la condicin de mayor uso, empleando La adaptacin de las plantas se en diferentes
para ello frascos tipo Gerber y tubos de ensa- sustratos, con un porcentaje de
yo como recipientes. Solamente Jimnez- sobrevivencia superior al 60%.
Quezada (2011) y Alvarenga-Venutolo y La tasa de multiplicacin de plantas de
Salazar-Aguilar (2015), reportaron el uso de stevia obtenida con el medio semislido
medios lquidos en sistemas de inmersin puede ser ms alta que la obtenida con los
temporal (SIT) empleando biorreactores del SIT y la calidad de las plantas resulta
tipo RITA y BIT. La tasa de multiplicacin diferente (Figura 2). El cultivo de
ms altas obtenidas en los sistemas microestacas de S. rebaudiana en un sistema
semislidos son las reportadas por Mohamed SIT con 10 minutos de inmersin cada 12
(2011), Preethi et al. (2011), Verma et al. horas, regener plantas de vigor elevado,
(2011) y Thiyagarajan & Venkatachalam con mayor incremento en longitud, masa
(2012), con valores de 36.9, 21.6, 17.5 y 15.7 fresca y masa seca promedio y con baja
brotes/explante, respectivamente. Mientras hiperhidricidad, lo que favoreci la
que en los sistemas lquidos (SIT), Jimnez- aclimatacin (Alvarenga-Venutolo y Salazar-
Quesada (2011) y Alvarenga-Venutolo y Aguilar, 2015).
Salazar-Aguilar (2015), reportan un valor de

A B B
A

C D

Fig. 2. Aspecto de las plntulas cultivadas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni. A. Propagacin
mediante medio semislido en frascos tipo Gerber. (B) Propagacin mediante sistema de
biorreactores de inmersin temporal (SIT). C. Comparacin del desarrollo de las plantas en medio
semislido (izquierda) y en SIT (derecha). D. Plntula aclimatada.

21
 Los sistemas de inmersin temporal otro sirve como contenedor del medio de
(SIT) basan su funcionamiento en el contacto cultivo lquido. Los dos recipientes se
del medio de cultivo con los explantes por conectan mediante mangueras de silicona, el
intervalos de tiempos regulares, por medio flujo aire pasa a travs de microfiltros de 0.2
del bombeo de aire limpio a travs de un m. La presin que ejerce el aire permite que
filtro. Este mtodo permite que el exceso de el medio lquido pase de un recipiente a otro,
lquido en los explantes se drenen por sumergiendo totalmente las plntulas.
gravedad al finalizar el bombeo y stos se Posteriormente el flujo de aire se invierte
mantengas hmedos (Santos Pino et al., para devolver el medio lquido a su recipiente
2011; Steinmach et al., 2011). Este tipo de de origen, este proceso es controlado
sistemas reduce los costos de la propagacin mediante vlvulas de solenoide y
in vitro hasta en un 46% con respecto al temporizadores, que facilitan establecer el
medio semislido. Adems, es importante tiempo de contacto o inmersin de las
resaltar que el uso de este mtodo reduce la plntulas con el medio lquido.
mano de obra, al igual que el espacio, lo que Este sistema BIT ha demostrado
facilita la propagacin a gran escala, solucionar algunos problemas habituales que
generando un aumento en la productividad y se presentan en la micropropagacin
calidad del material propagado. Los SIT tradicional en medio lquido y semi-slido,
pueden constituirse como una alternativa de tales como la hiperhidricidad, baja calidad de
micropropagacin a corto plazo, mientras que los propgulos y se evita transplantar o
a largo plazo se logran vencer obstculos multiplicar las plntulas. En la figura 3 se
biolgicos que permitan la obtencin eficiente muestra el ciclo de operacin del biorreactor
de plntulas; tambin se logra prevenir la de inmersin temporal BIT ( Escalona et al,
anoxia o falta de oxgeno en el medio, 2003).
controla el ambiente gaseoso en cada
inmersin y facilita la renovacin de medio. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Como se mencion anteriormente, los Stevia rebaudiana es una planta con inters
SIT comprenden los biorreactores de industrial gracias al contenido de
inmersin temporal o twin flasks system edulcorantes. Existe el potencial inters para
(BIT) y el recipiente de inmersin temporal el cultivo de esta planta en Mxico. El uso de
automatizado o recipient for automated sistemas de micropropagacin representa
temporary inmersion system (RITA). una alternativa viable para la propagacin
(Jimnez Quesada, 2011; Santos Pino et al., masiva de plantas libres de patgenos y que
2011). El sistema BIT es diseado con dos conserven la produccin de los glucsidos de
recipientes transparentes de vidrio o plstico inters. Sin embargo, se necesita mejorar
de un litro de capacidad, uno de los cuales protocolos para la micropropagacin de S.
contiene el material vegetal de inters y el rebaudiana, que permitan aumentar la tasa

22
Fig. 3. Sistema y operacin de un biorreactor de inmersin temporal BIT. 1. Inicio del ciclo de inmersin de
los explantes. 2. Inmersin o paso del medio de cultivo del frasco reservorio al frasco donde estn los
explantes. 3. Retorno del medio de cultivo al frasco reservorio luego de cumplir el tiempo de inmersin
establecido.

de multiplicacin. El empleo de sistemas de aire en el cual las plntulas presenten un

biorreactores de inmersin temporal es un mejor comportamiento. As mismo, es
proceso automatizado que provee necesario realizar las pruebas de identidad
condiciones de cultivo uniformes y molecular de las plantas y cuantificar la
controladas para la planta, se requiere de produccin de los esteviosidados en las
menos recipientes y se siembra una mayor plantas micropropagadas.
cantidad de explantes por envase de cultivo
que en los frascos usados en los sistemas
semislidos. Por lo que los SIT representan AGRADECIMIENTOS
una alternativa que puede potenciar la Al Programa de Cooperacin Tcnica y
generacin de plantas ms vigorosas, con Cientfica entre Mxico y Costa Rica 2013-
incremento en el tamao, mayor nmero de 2015. Incremento de las capacidades
hojas y formacin de raz. Sin embargo biotecnolgicas de Mxico y Costa Rica, para
existen algunos retos por superar, como el Desarrollo de Cultivos Vegetales". El
determinar la densidad apropiada de proyecto est apoyado por la SIP-IPN
explantes, el volumen de medio adecuado 20150061
para una propagacin exitosa, y el flujo de

23
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