Aula de Bioqumica II

Tema:

DNA:
Replicao, Reparo e Recombinao

Prof. Dr. Jlio Csar Borges

Depto. de Qumica e Fsica Molecular DQFM
Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
 Ciclo Celular
A sntese de DNA celular ocorre numa fase especfica do ciclo celular
 Replicao do DNA
Replicao do DNA semi-conservativa: Meselson & Stahl (1958)

1) Crescimento em meio
mnimo na presena de
Radioistopos 15N
2) Aps marcao 14N
 Replicao do DNA
Sntese dirigida por complementaridade DNA-polimerase DNA-dependente
- dirigido pelo pareamento de bases complementares livres com a fita molde parental
Requer a separao das fitas parentais

Sntese ocorre no sentido 5 3

Coordenada da Reao
 Replicao do DNA
Sntese do DNA obedece direcionamento 5 3
Forquilha de replicao abertura da fita-dupla parental para a sntese das fitas filhas
- Sntese a partir do molde 3 5 envolve o empecilho da forquilha devido natureza
antiparalela do DNA Sentido do crescimento 5 3 da fita filha

?
No catalisa o crescimento em cabea no sentido
3 5 nucleotdeo adicionado no est ativado
 Replicao do DNA
Estrutura em Y contendo dois aparatos multi-enzimticos com a DNApol
Natureza antiparalela do DNA fita dupla impe empecilhos
- uma das fitas deve ser sintetizada no sentido 3 5
- na fita molde 3 5 exposta a sntese contnua fita lder ou contnua
- na fita molde 5 3 exposta a sntese descontnua fita descontnua

Replicao semi-descontnua
A medida que ocorre a exposio da fita molde
5 3 ocorre a polimerizao na direo
antiparalela

- sntese descontnua pois ocorre em fragmentos

Fragmentos de Okasaki
- tais fragmentos so unidos posteriormente pela
DNA ligase
 Replicao do DNA
Bolha de replicao
Origem de replicao;
Direo da replicao (uni ou bi)
 Replicao do DNA
Replicao comea em um stio oriC desenrolado
Ligao de protenas DnaA dispara sinais que desenrolam o DNA e a sntese do primer
 Enzimas e Protenas da Replicao
1) Helicases separao das cadeias
2) Protenas que previnem o re-anelamento antes da replicao SSB
3) DNA topoisomerase (DNA-girase)
4) RNA-polimerase DNA-dependente Primase
5) DNA-polimerases DNA-dependentes
6) Enzima removedora dos primers de RNA
7) DNA ligase
 mais complicado do que parece!!!!!
 DNA-Helicase
- Catalisam a separao da dupla hlice frente da forquilha de replicao

- Disponibiliza as fitas parentais em fitas simples para a sntese da fita filha

- A DNA helicase age sobre a fita 5 3 envolvida na replicao descontnua

 DNA-Helicase - DnaB
- Hexmero que forma um anel entorno da fita de DNA simples
- Catalisam a separao da dupla hlice frente da forquilha de replicao
- Disponibiliza as fitas parentais em fitas simples para a sntese da fita filha
- A DNA helicase age sobre a fita 5 3 envolvida na replicao descontnua
- A helicase fornece um suporte adicional para a DNApol
Protenas SSB (single stranded binding protein) previnem re-anelamento
 DNA-topoisomerase Dna girase
Linearizao do DNA um obstculo topolgico

A replicao do DNA criam o problema do

enrolamento do eixo da dupla hlice pelo
avano do Primossomo

A topoisomerase um nuclease reversvel

que tira o enrolamento adicional da dupla-
hlice
 DNA-topoisomerase Dna girase
A topoisomerase um nuclease reversvel que tira o enrolamento adicional da dupla-
hlice
1) ele insere um Pi na ligao fosfodiester, clivando uma das fitas que permanece ligada
enzima
2) permite que uma fita gire livremente entorno da outra a fita no clivada serve de
suporte
3) Regenera a ligao fosfodiester
- A tenso da dupla-hlice dita o giro
 DNA-topoisomerase Dna girase
- As Topoisomerases I no necessitam de incremento de energia ligam-se a apenas uma
das fitas
Ataque nucleofilico de uma Tyr em um atomo de P
 DNA-topoisomerase Dna girase
As Topoisomerases II gastam ATP e se ligam a ambas as fitas da hlice
quebra temporria na hlice
- evitam a formao de laos ou ns nas longas fitas de DNA cromossomal

Topoisomerase II bacteriana alvo de antibiticos que

inibem a enzima procaritica muito mais do que a
enzima eucaritica

Novobiocina cido Nalidxico

Ciprofloxacina
 DNA-topoisomerase Dna girase
1) clivagem reversvel da dupla hlice criam uma abertura no DNA
2) passam outra dupla-hlice pela abertura
3) religa as fitas da abertura

G: gate; T: transported
 DNA-Primase RNA-pol DNA-dependente
Enzima responsvel pela sntese de primers de RNA na forquilha de replicao
- Primers de 10 nucleotdeos necessrios DNApol no inicia a sntese sem uma OH 3
disponvel
A replicao da fita descontnua sempre precisa de um novo primer a cada 100-
200 bases
- a autocorreo da DNApol no permite que ela inicie a sntese de novo da fita
complementar
- preservar mecanismo de autocorreo eficiente
 DNA-Polimerases
Catalisa o ataque nucleoflico da OH 3 ao Pi alfa do dNTP livre liberao de
pirofosfato dirige a termodinmica da reao
Cadeias de DNA so alongadas somente no sentido 5 3
Dependente de primers fornece uma OH 3 confivel para o incio da replicao - Reduz erros

- adio contnua de dNTPs livres na extremidade 3 da fita

crescente nucleotdeo livre est ativado
 DNA-Polimerases
Tem atividade 3 5 exonuclease mecanismo de autocorreo
- tem atividade 5 3 exonuclease remove primers dos fragmentos de Okasaki

A fidelidade da replicao 1 erro a cada 1 Bilho de bases incorporadas

- maior do que esperado pela preciso do pareamento
- mecanismos de correo de nucleotdeos mal pareados
 DNA-Polimerase
Estrutura de DNA-Pol I

DNA polimerase I
(E. coli):

-1957, Arthur Kornberg

-928 resduos

-DNA liga na palma e mudanas

Conformacionais fazem com que o
dedo se feche sobre ele
 DNA-Polimerase
1) O pareamento adequado checado pela DNApol
- apenas o nucleotdeo correto se liga com alta afinidade ao complexo
DNA-molde-DNApol
- A DNApol I verifica a geometria exata do pareamento antes de catalisar a reao

DNA polimerase I:

Especificidade requer pareamento

Watson-Crick

Envolve dois ons metlicos, usualmente

Mg2+;

-Um deles ativa o grupo 3OH do primer

para o ataque nucleoflico ao grupo fosfato
do dNTP que entra;

- O outro orienta e eletrostaticamente

estabiliza o grupo trifosfato
 DNA-Polimerase
1) O pareamento adequado checado pela DNApol
- apenas o nucleotdeo correto se liga com alta afinidade ao complexo
DNA-molde-DNApol
- A DNApol I verifica a geometria exata do pareamento antes de catalisar a reao
 DNA-Polimerases
Correo exonucleotdica 3 5
- Se o nucleotdeo incorreto adicionado ele pode ser retirado pela ao 3 5 exonuclease
da DNApol

DNApol dependente de um primer

- nucleotdeos mal pareados no fornecem uma boa OH 3 para o ataque nucleoflico da
reao

DNApol executa uma ao de autocorreo

 DNA-Polimerases
Correo exonucleotdica 3 5
 DNA-Polimerases

Correo exonucleotdica da DNA-Pol I

3 exonuclease: atua onde

Funo 5
5 falha, reconhece um nucleotdeo
3
no-pareado e cliva alem (at 10 resduos),
simultaneamente completando a
polimerizao sistemas de reparo

Retira os primers de RNA nos

fragmentos de Okazaki e substitui por
DNA
 DNA-Ligases

DNA ligase: fechar os buracos (nicks) oriundos

de fragmentos de Okasaki e reparo

Energia: NAD+ a NMN+ procariotos;

ATP em eucariotos
- T4 DNA ligase vrus
 DNA-Polimerases
Diferentes tipos de DNA-Pol em E. coli
DNApol I: Substitui os fragmentos de Okazaki e trabalha em sistemas de reparo
DNApol II: Trabalha em sistemas de reparo
DNApol III: a Replicase alta taxa de polimerizao e processividade
 DNA-Polimerases III
DNA-Pol III
Possui alta processividade a replicase
- complexo multienzimtico
- sem atividade 5 3 exonuclease
 DNA-Polimerases III
DNA-Pol III

O complexo multienzimtico
A sntese de DNA funciona pela ao
conjunta das diversas protenas
Formao da ala de replicao

- Em bactrias primossomo
- Fora propulsora do complexo
hidrlise de ATP
 Replicao do DNA
Complexo multi-enzimtico na forquilha de replicao
 DNA-Polimerase III
Cinta deslizante
A DNApol III por si s apresenta baixa afinidade pela fita simples e capaz de sintetizar
apenas pequenos trechos
Uma protena mvel age como uma cinta reguladora que prende a DNApol na fita de
DNA molde
- aumenta a eficincia da polimerizao
- libera a DNApol quando encontra DNA fita dupla
Subunidade beta (dmero) forma um anel em torno no DNA
 Replicao do DNA
Complexo multi-enzimtico na forquilha de replicao
Replicao do DNA
DNA-Pol III
Replicao do DNA
DNA-Pol III
Replicao do DNA
DNA-Pol III
Replicao do DNA
DNA-Pol III
Replicao do DNA
DNA-Pol III
Fidelidade da Replicao

Vrios fatores influentes

1) Nveis de dNTPs balanceado
2) DNApol
3) Ao exonuclease
4) Vrias enzimas
5) Incio por primer (chance de
pareamento errado no incio maior)
6) Presena do co-fator Mg2+
 Transcriptase Reversa
Vrus de RNA
Aplicaes na Tecnologia do DNA Recombinante
 Evoluo Molecular

O DNA no to inerte quanto parece.

- Sofre modificaes

A fidelidade do processo de replicao do DNA realizada pelas DNA-pol e suas funes de

correo de leitura so essenciais para a transmisso e estabilidade da informao gentica
durante a diviso celular.

Existem sistemas de reparo e controle de qualidade para manter a estabilidade de um

genoma proporcionando ao mesmo tempo sua evoluo

A evoluo ocorre em saltos pequenas mutaes no DNA grandes passos

evolucionrios

A evoluo depende, principalmente, de acidentes e erros

- Falhas nos mecanismos de replicao e de reparo dos genomas

- Falhas na replicao, recombinao ou no reparo de DNA podem ocasionar diversos tipos

de alteraes
 Evoluo Molecular

Tipos de falhas

- Falhas simples substituio, insero ou deleo de um par de bases

- Falhas com rearranjos genmicos delees, duplicaes, inverses e translocaes de

seqncias

- As taxas de erros esto em equilbrio aceitvel entre estabilidade e alteraes.

 Danos ao DNA
Causas de danos ao DNA:
1) Meio reativo celular; 2) Substncias txicas;
3) Danos por radiaoUV; 4) Radiao ionizante;
5) Erros na polimerizao que no so corrigidos pela maquinaria;

Mutaes de ponto (+ Comuns) troca de bases podem ser silenciosas ou

semiconservativas
Tipo transies (A
G ou C
T)
Tipo transverses (Purinas por pirimidinas)

Os nucleotdeos formam tautmeros que permitem

pareamentos no Watson-Crick
- Taxa do tautmero 1.10-4

Mutaes de inseres/delees mudam a fase de leitura

 Danos ao DNA
Mutgenos

Carcingenos
- danificam diretamente o DNA ou indiretamente por interferir no sistema de reparo

Progresso do dano depende da linhagem celular

- Em linhagens germinativas alteraes hereditrias na progne
- Em linhagens somticas perda de funo, apoptose, cncer.
 Danos ao DNA

Tipos e stios de danos qumicos aos nucleotdeos:

Ataque oxidativo

Hidrlise espontnea

Metilao
no-enzimtica por
S-adenosil Met
 Danos ao DNA

Radiao UV (200-300nm)

Dmero de Pirimidina (T/C) causa distoro na dupla-hlice que bloqueia a transcrio e

a replicao
 Mecanismos de Reparo do DNA

Reparo importante para manter integridade da informao (celular e/ou herdada)

Taxa de mutaes aumentam quando um mecanismo de reparo desativado Doenas

humanas cnceres

Apenas 1 em 1.1010 eventos de danos ao DNA no evitado os mecanismos de reparo

so eficientes

- Grande variedade de mecanismos sugere a sua importncia investimento celular alto

proporcional importncia do processo

- O DNA possui cpia para o reparo imediato dupla hlice a fita complementar o
molde para o reparo

- Vrus de DNA simples e RNA so mais susceptveis mutaes sucesso evolutivo pela
quantidade e adaptalidade
 Mecanismos de Reparo do DNA
Tipos de Vias de Reparo
1) Reparo por Remoo de Bases

2) Reparo Direto
- DNA fotoliases revertem a dimerizao de Timinas

3) Reparo por Remoo do Nucleotdeo

 Mecanismos de Reparo do DNA
Tipos de Vias de Reparo
1) Reparo por Remoo de Bases

Glicosidases reconhece uma base danificada e a extirpa da

dupla-hlice clivando a ligao glicosdica
- Gera um ponto AP (Apurnico ou apirimdico)
- Endonuclease AP reconhece este stio e cliva a fosfodeoxiribose
- A DNA-pol I preenche a lacuna
- DNA-ligase funde os fragmentos
 Mecanismos de Reparo do DNA
Tipos de Vias de Reparo
1) Reparo por Remoo de Bases
- Uracil no DNA e altamente mutagnico
- pois C pode deaminar a U o par seria GC ou AT?
Uracil-DNA glicosidase puxa uracil para for a do DNA
 Mecanismos de Reparo do DNA
Tipos de Vias de Reparo
3) Reparo por Remoo do Nucleotdeo

Complexo multi-enzimtico reconhece

alteraes e distores na estrutura da
dupla hlice do DNA

- Dmeros de pirimidinas podem ser

reparados por exciso e a lacuna preenchida
pela DNA-Pol I e DNA-ligase

- clivagem por um complexo dependente de

ATP na stima e quarta base na extremidade
5 e 3 do dano

Defeito neste sistema de reparo gera a

Xerodermia pigmentosa
- doena autossmica recessiva luz solar
 Mecanismos de Reparo do DNA
Tipos de Vias de Reparo
3) Reparo por Remoo do Nucleotdeo

- Mutaes pontuais devido falhas de

pareamento na replicao e/ou devido
eventos de tautomerizao podem ser
corrigidos por um sistemas de reparo

- Falhas nestes sistemas aumentam a

freqncia de cncer
 Recombinao Homloga ou geral
Recombinao Geral ocorre entre segmentos de DNA com extensa identidade
Mecanismo envolvido no reparo de DNA em clulas em replicao
Mecanismo envolvido na segregao cromossmica crossing-over entrecruzamento
- formao de cromossomas recombinantes

Recombinao
Recombinao Homloga ou geral
Sistema de Recombinao homloga

Juno Holliday
 Recombinao Homloga ou geral
1) 4 fitas de DNA se pareiam e so cortadas para formarem um novo pareamento

2) As fitas quase complementares no duplo-homlogo formam um segmento de DNA

heterlogo
3) O segmento heterlogo
selado Formao do
crossing-over de 4 fitas
de DNA Juno
Holliday fitas
entrecruzadas de
heteroduplex

4) migrao de
ramificaes em ambas as
direes

5) Resoluo ou Quebra
da juno Holliday
 Recombinao Homloga ou geral
1) Responsvel pela diversidade gentica da populao
2) Responsvel pela gerao de anticorpos
3) Estratgia usada por vrus para a sua integrao ao genoma do hospedeiro
4) Importante metodologia biotecnologia para a gerao de organismos transgnicos

Muitas enzimas/protenas envolvidas na replicao atuam na recombinao