Purificacin de linfocitos a partir de sangre

perifrica
Miguel Criollo 1

1 Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Sangolqu,
Ecuador

Palabras clave: linfocitos, sangre perifrica, gradiente de densidad

Key words: Lymphocytes, peripheral blood, density gradient

Resumen
Los linfocitos son las clulas de la sangre que intervienen en los mecanismos de defensa y en las
reacciones inmunitarias del organismo, participan en la lucha contra los microorganismos extraos
y los tumores. Se utilizan para estudiar los estados de inmunodeficiencia, en ensayos de
histocompatibilidad. Para esto se requieren linfocitos puros, los cuales se obtienen principalmente
por centrifugacin en gradiente de densidad. El presente trabajo tuvo como objetivo aislar linfocitos
a partir de sangre entera mediante el mtodo de centrifugacin con gradiente de densidad y realizar
la cuantificacin de estas clulas. Despus de extraer sangre de estudiantes se utiliz el histopaque-
1077 para separar los linfocitos y realizar el conteo en cmara de Neubauer. Se determin una
concentracin de 5641 /, que determina una posible infeccin viral, infeccin bacteriana
crnica, entre otros, del paciente del cual se extrajo la sangre.

Abstract
Lymphocytes are the blood cells involved in defense mechanisms and in the immune reactions of the
body, involved in the fight against foreign microorganisms and tumors. They are used to study
immunodeficiency states in histocompatibility assays. For this, pure lymphocytes are required,
which are mainly obtained by density gradient centrifugation. The objective of the present work was
to isolate lymphocytes from whole blood by the density gradient centrifugation method and to
quantify these cells. After extracting blood from students, histopaque-1077 was used to separate the
lymphocytes and perform the Neubauer chamber count. A concentration of 5641 / was
determined, which determines a possible viral infection, chronic bacterial infection, among others,
of the patient from whom blood was drawn.

Introduccin
Los linfocitos son clulas del sistema inmune que derivan de la lnea linfoide diferenciada a partir de
la clula madre pluripotencial de la mdula sea (Alvarez, 2009). Despus de los neutrfilos, los
linfocitos son los leucocitos ms numerosos en la circulacin. En nmeros absolutos se encuentran
de 1,000 a 3,000 por mm3 de sangre y en nmeros relativos entre 20 y 30 por ciento de la cuenta
total. El 75% de los que circulan son T y el mayor nmero de ellos corresponde a los T de ayuda (Th,
CD4); el 25% restante corresponde a los linfocitos B y NK (Vega, 2009). Segn su morfologa se
distinguen dos tipos de linfocitos: linfocitos relativamente pequeos, sin granulaciones, con un
ncleo grande en relacin al citoplasma llamados linfocitos B y T; y linfocitos ms grandes y
granulares, con un ncleo ms pequeo en relacin al citoplasma denominados clulas asesinas
naturales (NK) (Alvarez, 2009).
Para estudiar los estados de inmunodeficiencia, es necesario conocer el porcentaje y nmero
absoluto de linfocitos T. Para esto, se realiza un aislamiento por centrifugacin en gradiente de
densidad. Con esta tcnica se puede obtener de forma separada las clulas mononucleares (linfocitos
y monocitos) de los granulocitos (Garcia & Rubio, 2016).

Dentro de las soluciones de gradiente de densidad ms utilizadas estn Ficoll-Paque PLUS e

Histopaque-1077. Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como
son sacarosa, percol, cloruro de cesio, y el Ficoll. En la centrifugacin por gradiente de densidad, la
separacin de una muestra se logra por sedimentacin a travs de un gradiente de densidad, esto es,
una solucin que incrementa en densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de
centrifuga (Morales, 2013).

La tcnica de Ficoll hypaque es una tcnica de centrifugacin por gradiente de densidad para separar
Clulas Mononucleares de Sangre Perifrica (CMSP) de otras clulas de la sangre. Durante la
centrifugacin se van formando varias capas, el sedimento que est formado principalmente por
granulocitos y eritrocitos ha migrado a travs de la gradiente de densidad que es mayor al del ficoll
hypaque, encima estara otra capa que sera el ficoll hypaque que es menos denso, y encima estara
otra capa fina opalescente que seran las CMSP, finalmente sobre esa capa estara las plaquetas y el
plasma que con futuros lavados se estaran removiendo para tratar de obtener solo los linfocitos (GE
Healthcare Life Science, 2017).

El Histopaque-1077 tiene una densidad entre 1.076 y 1.078 g/mL, un pH 8.8-9.0 y endotoxinas 0.3
EU/mL. Al centrifugar a baja velocidad durante un corto tiempo en un tubo con la sangre junto con
la solucin con densidad y fuerza osmtica adecuados permite que las eritrocitos y granulocitos
sedimenten al fondo del tubo. Mientras que los linfocitos por su menor densidad quedan en la
interface entre el plasma y el Ficoll con otras partculas de sedimentacin lenta (Aldrich, 2016).

El presente trabajo tiene como objetivo aislar linfocitos a partir de sangre entera mediante el mtodo
de centrifugacin con gradiente de densidad y realizar la cuantificacin de estas clulas.

Protocolos
Protocolo obtenido de la gua de prcticas de laboratorio de Purificacin de linfocitos a partir de
sangre perifrica, realizado por Torres (2016).

1. Separacin de linfocitos
1. Se recogen 20 ml de sangre
2. La sangre recolectada se transfiere a cuatro tubos de 7 ml heparinizados (Total: 20 ml).
3. Se reuni toda la sangre de los tubos heparinizados en un tubo de tapa azul de 50 ml.
4. Realizar una dilucin 1: 1 de sangre entera con 1X PBS
5. Cuidadosamente subyacente 10 ml de histopaque-1077. Y 20 ml de sangre diluida se transfiere a
un tubo de 50 ml.
6. Centrifugar inmediatamente a 1800 rpm [700 g] durante 20 min en una centrfuga de enfriamiento
(4C).
7. Retire cuidadosamente el tubo de la centrfuga, observando las tres capas: la parte superior es
sobrenadante claro, el medio es lquido opaco que contiene las PBMC, y el fondo es RBC.
8. Eliminar cuidadosamente y descartar el sobrenadante dentro de 15 ml de la capa opaca de las
PBMC. Rpidamente transfiera la capa de capa blanda de PBMC (alrededor de 5 ml) en un nuevo tubo
de 50 ml.
9. Aadir 1x PBS a la suspensin de PBMC para obtener un volumen final de 45 ml. Mezclar bien y
centrifugar a 1800 rpm durante 10 min en una centrfuga de enfriamiento (4 C).
10. Se vierte y se desecha el sobrenadante,
11. Conteo de linfocito en cmara de Neubaeur con una dilucin de trypan Blue para verificar
viabilidad celular
 Resultados representativos
El recuento de linfocitos se realiz en una cmara de Neubauer, en cada uno de los cuatro cuadrantes,
adems se us trypan BLUE para verificar la viabilidad celular de la muestra de sangre perifrica
(Figura 1).

a b

c d

Figura 1. Recuento de linfocitos en cmara de Neubauer. (a) Primer cuadrante, observado a 10X. (b) Segundo
cuadrante, observado a 10X. (c) Tercer cuadrante observado a 10X. (d) Cuarto cuadrante, observado a 10X

Para el clculo del porcentaje de clulas viables, se tiene a siguiente ecuacin:

#
% = 100
#

El numero promedio de clulas por cuadrante es igual a:

Para el primer cuadrante: 503 clulas viables, 13 clulas muertas
Para el segundo cuadrante: 507 clulas viables, 15 clulas muertas
Para el tercer cuadrante: 524 clulas viables, 16 clulas muertas
Para el cuarto cuadrante: 497 clulas viables, 12 clulas muertas
Se tiene: 2031 clulas viables, 56 clulas muertas. Con un total de 2087 clulas.

2031
% = 100 = 97.31 %
2087
El numero promedio de clulas por cuadrante es:

#
# / =

2031
# / = = 507.75
4

El factor de dilucin se calcula mediante:

=

Se us en la prctica 10 uL de trypan BLUE y 90 uL de muestra (volumen de clulas)

100 10
= =
90 9

Finalmente, la concentracin (clulas viables por/mL) es:

= # / 104

10
= 507.75 104
9

= 5641666.667 [ ]

= 5641.67 [ ] 5641 [ ]

Discusin
Segn el Medical and Nursing Professional Education (2017), los valores normales de linfocitos en
adultos van de 1000-4000 (clulas/uL), valores mayores a estos aparece en: Infecciones bacterianas
crnicas, Infecciones virales, Leucemias, Mononucleosis infecciosa, Hepatitis, entre otros (Medical
and Nursing Professional Education, 2017) . La concentracin obtenida de 5614 (clulas/uL) indica
entonces que el estudiante del que se extrajo sangre puede tener algunas de estas patologas.

Existen varios mtodos de purificacin de linfocitos T y B y cada uno es ms adecuado para

determinados tipos de experimentos, entre ellos tenemos: Panning, Citotoxicidad por anticuerpo y
complemento, separacin magntica, Roseteo con eritrocitos de carnero, con tcnicas de citometra
de flujo, y por centrifugacin en gradiente de densidad (Percoll) (Arnaiz, Regueiro, & Lpez, 2005).
El roseteo con eritrocitos de carnero se basa en la unin de los linfocitos T humanos a eritrocitos de
carnero formndose rosetas de 1 linfocito T humano rodeado de varios eritrocitos de carnero (EC).
La unin se produce entre la molcula CD2 de la superficie de los linfocitos T humanos y una molcula
de la superficie de los EC. El proceso consiste en incubar los linfocitos totales con los EC durante 30
y centrifugar la mezcla sobre un gradiente de densidad (Lymphoprep). Los linfocitos T caen al
fondo del tubo al ser ms densos por tener unidos los EC, y los linfocitos B quedan sobre el
Lymphoprep. Los EC unidos a los linfocitos T humanos son lisados posteriormente y se recupera la
poblacin de linfocitos T (Lomonte, 2009).

En el mercado hay varios productos para la separacin de linfocitos. Un mtodo rpido, simple y
fiable de aislar linfocitos, separndolos de los leucocitos polimorfonucleares circulantes en sangre
perifrica. Mono-PolyTM Resolution Media garantiza la separacin eficiente de las clulas
sanguneas. La solucin compuesta de Polisacrido (Ficoll 400) y un medio de contraste radiopaco
(Hypaque), permite la resolucin de mononucleares y polimorfonucleares en dos bandas distintas en
un slo paso con un 99% de pureza (Quimiolab, 2017). LYMPHODEX es una solucin acuosa
estril adecuada para aislar las clulas mononucleares perifricas de la sangre desfibrinada o
heparinizada, que servirn para la determinacin serolgica de HLA. Su PH (7,1-7,4) y su presin
osmtica permiten la supervivencia celular (90-95%) tras la separacin (DIAGNOSTICA
LONGWOOD, 2017).

Para lograr separaciones de mayor resolucin, se han desarrollado dos tipos de centrifugaciones. En
la primera, las partculas se separan en zonas en funcin de las diferencias en la velocidad de
sedimentacin (centrifugacin zonal), y en la segunda, la separacin se basa nicamente en las
diferencias de densidad flotante o de bandas (centrifugacin isopcnica) (Garcia & Rubio, 2016). En
la centrifugacin zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de
densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrfuga las partculas se mueven a
velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La densidad
mxima del gradiente no ha de exceder a la de las partculas a separar (Universitat de Barcelona,
2013). La centrifugacin isopcnica separa les partculas en un gradiente de densidades en funcin
de la densidad de las mismas. Las partculas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto
donde la densidad de stas i la del gradiente son idnticas (de aqu el nombre de isopcnico). En este
caso, es condicin fundamental que la densidad mxima del gradiente final ha de exceder siempre a
la densidad de las partculas. Por este motivo la sedimentacin final no se produce si se controlan las
condiciones de centrifugacin, ya que las partculas flotan sobre un "colchn" de material que posee
una densidad superior a la de stas. Esta tcnica se utiliza, por ejemplo, para separar partculas
similares en tamao, pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugacin isopcnica es un
mtodo adecuado para separar cidos nucleicos o diferentes orgnulos celulares (Universitat de
Barcelona, 2013).

Al tomar muestras de sangre se deben seguir normas de bioseguridad ya que puede ser una fuente
de riesgo biolgico. Para esto se debe utilizar elementos de proteccin personal como gafas,
mascarilla, guantes. Adems, el personal debe pasar por un esquema de vacunacin, asumir que todo
material con el que se trabaja es potencialmente infectante, utilizar contenedores para especmenes
a prueba de fugas y de fcil sellamiento, manejar adecuadamente elementos corto punzantes
evitando reenfundar agujas, disponer contenedor adecuado, no transportar jeringas con agujas
(Rodriguez, 2012).

Para el transporte de muestras se deben utilizar envases secundarios equipados con gradillas para
que las muestras contenidas se mantengan en posicin vertical. El recipiente que contenga la muestra
debe estar bien cerrado y rotulado, se debe controlar la temperatura de envo de las muestras para
guardar la cadena de frio en caso de ser necesario y se debe establecer una relacin entre los
involucrados en el manejo y transporte seguro de materiales peligrosos (OMS, 2005).

En los ltimos 45 aos se han desarrollado tcnicas de criobiologa y de control de calidad, que
permiten la utilizacin de un mtodo estandarizado para la criopreservacin de clulas progenitoras
hematopoyticas. Desde 1955, Barnes y Loutit, demostraron la capacidad de mantener la viabilidad
de precursores hematopoyticos de mdula sea, con la misma tcnica utilizada por Palge y col, en
1949, para la criopreservacin de espermatozoides con glicerol como crioprotector. Adems, el
desarrollo de tcnicas de cultivo de precursores granulocitomacrfago han permitido el control in
vitro de los fenmenos de recuperacin de mdula sea y clulas hematopoyticas perifricas
criopreservadas (Cruz & Cruz, 2000).
Generalmente la muestra biolgica de clulas hematopoyticas es mezclada con un agente
crioprotector y colocada en una bolsa de criopreservacin. El crioprotector ms utilizado es el
dimetilsulfxido (DMSO) en diferentes concentraciones (2.2-10%); otros que tambin se han
utilizado son el glicerol, el hidroxietilalmidn (HES), polivinilpirrolidona (PVP), etc. El crioprotector
al penetrar a la clula aumenta la concentracin del medio intracelular evitando la formacin de
cristales y as la prdida de viabilidad. De este modo, la adicin de una sustancia crioprotectora
permite que durante el enfriamiento no se pierda tanto liquido intracelular y mantiene al mismo
tiempo suficiente concentracin de solutos para disminuir la aparicin de cristales intracelulares
(Cruz & Cruz, 2000).
 Conclusiones
Se extrajo satisfactoriamente los linfocitos mediante la tcnica de centrifugacin por gradiente de
densidad con Histopaque-1077 y se determin un porcentaje de 97.31% de clulas viables con ayuda
del trypan BLUE.

La concentracin de linfocitos en el estudiante del cual se extrajo la sangre dio un valor de

5641 (clulas viables/uL), determinando un caso elevado de linfocitos producto de una infeccin
viral, bacteriana crnica, entre otras.

Recomendaciones
Se recomienda usar sangre extrada de 2-6 horas antes de la separacin de la sangre. La sangre
extrada mayor a 24 horas ser ms difcil de separar, y el porcentaje de recuperacin y viabilidad
sern ms bajos.

Tener cuidado del manejo de muestras de sangre y su respectivo desecho biolgico.

Se recomienda realizar el aislamiento de linfocitos en una cmara de flujo laminar para evitar
contaminacin de la muestra.

Referencias

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