Profesor Patrocinante

Dr. Patricio Godoy Martnez

Instituto Microbiologa Clnica
Facultad de Medicina

ACTIVIDAD ANTIFNGICA DE ACEITES ESENCIALES AISLADOS DE PLANTAS

NATIVAS DEL SUR DE CHILE CONTRA HONGOS FILAMENTOSOS DE

IMPORTANCIA CLNICA.

Tesis de Grado presentada como

parte de los requisitos para optar al
grado de licenciado en Bioqumica
y al ttulo profesional Bioqumico

SEBASTIN ISRAEL GONZLEZ MERA

VALDIVIA-CHILE

2014
 AGRADECIMIENTOS

Agradezco el apoyo incondicional de mi mujer frente a todas las dificultades que se

presentaron al realizar esta tesis, Pame te doy las gracias por siempre creer en m y

darme la fuerza para realizar cualquier cosa. Deseo expresar mi agradecimiento al

Dr. Patricio Godoy por la oportunidad de trabajar en su laboratorio, su tiempo,

dedicacin y paciencia, al profesor Ociel Muoz, que siempre fue un apoyo tanto para

concretar mi tesis y trabajo. Tambin agradezco a todos los funcionarios del Instituto

de Microbiologa Clnica, a la seora Isolde, seora Patricia, don Francisco, cada uno

de ustedes aport al desarrollo de esta tesis. Tambin quiero dar mis agradecimientos

a todos mis amigos y perdnenme si no los nombro a todos, a Ivn Montenegro por

ser mi formador en el laboratorio y aportar con sus ideas para consolidar esta tesis,

a Miguel (Miki) salinas por entregarme su apoyo y tiempo en la recoleccin de

muestra, a mis amigos Oscar Daz, Andrea Bello, Pamela Brle, Lissette Yez,

Gabriel Martnez, Jaime Herrera, Sebastian Delgado, Alberto Brito, Alberto Param,

Rub, Nano, Sergio, Willy de verdad amigos, ustedes siempre me ayudaron a seguir

adelante, ya sea con una palabra de aliento o con su compaa, tambin quiero

agradecer a mi gran amigo y maestro Hernn Hernndez (R.R), que a la distancia

siempre fue un apoyo para seguir luchando frente a cualquier dificultad que se

presentaba para completar mi trabajo, de corazn gracias Hernn. A mis padres, y a

mi hermana Francy y a la pequea Emilia. Por ltimo dar gracias al Instituto de

Microbiologa Clnica que facilit sus laboratorios para realizar esta tesis.
 NDICE GENERAL

1. RESUMEN 1

1.1 SUMARY 2

2. INTRODUCCIN 3

2.1 Generalidades 3

2.2 Molculas con actividad antifngica y sus mecanismos de accin 7

2.2.1 Polienos 7

2.2.2 Los azoles 8

2.2.3 Las equinocandinas 8

2.2.4 APAN 9

2.3 Productos naturales que reportan actividad biolgica 10

2.4 Hiptesis 19

2.5 Objetivos generales 19

2.6 Objetivos especficos 20

3. MATERIALES Y MTODOS 20

3.1 Material biolgico 20

3.1.1 Especies vegetales 20

3.1.2 Laurelia sempervirens 20

3.1.3 Laureliopsis philippiana 23

3.2 Especies fngicas 25

3.2.1 Aspergillus 26

3.2.2 Fusarium 31

3.3 Reactivos 37

3.4 Equipos 37

3.5 Medios de cultivo 37

3.6. MTODOS 37

3.6.1 Preparacin de placas agar sabouraud 37

3.6.2 Preparacin de cepas fngicas en estudio 38

3.6.3 Cultivo e incubacin 38

3.6.4 Macromorfologa de colonias 38

3.6.5 Pureza de la colonia 39

3.7 Obtencin de aceites esenciales 39

3.8 Test de susceptibilidad con aceites esenciales 40

4 RESULTADOS 42

4.1 Anlisis cromatogrficos de los aceites esenciales de Laurelia sempervirens y 42

Laureliopsis philippiana
4.2 Resultados de los ensayos de actividad antifngica con Ac. Esencial de 52

Tepa y laurel contra cepas de Fusarium y Aspergillus.

4.2.1 Susceptibilidad antifngica mediante tcnica de difusin en agar 52

5 DISCUSIN 58

7. BIBLIOGRAFA 61
 NDICE FIGURAS

Figura 1. Estructura del Poligodial. 11

Figura 2. Prdida de la capacidad antifngica del poligodial. 13

Figura 3. Estructura molecular del Safrol. 15

Figura 4. Estructura del Eugenol. 17

Figura 5. Estructura del Metileugenol. 18

Figura 6. Hoja de laurel a la izquierda, rbol de laurel derecha. 23

Figura 7. Izquierda hojas de Tepa, derecha rbol de Tepa. 25

Figura 8. Estructura microscpica de Aspergillus. 29

Figura 9. Macroestructura de Aspergillus. 30

Figura 10. Microestructura de Aspergillus. 31

Figura 11. Microestructura de Fusarium. 33

Figura 12. Macroestructura de Fusarium solani y Fusarium oxysporum. 34

Figura13. Microestructura de Fusarium oxysporum y Fusarium solani. 35

Figura 14. Esquema de ensayos de susceptibilidad. 40

Figura 15. Estructura molecular del Safrol. 44

Figura 16. Estructura molecular del Eugenol. 50

Figura 17. Actividad de aceite esencial de Laurelia sempervirens. 53

Figura 18. Actividad de aceite esencial de Laureliopsis philippiana. 55

Figura 19. Cepas control. Aspergillus y Fusarium. 57

 NDICE DE TABLAS

Tabla I. Resultado entregado por el cromatgrafo de gases para el aceite 43

esencial de Laurelia sempervirens.

Tabla II. Resultados entregados por el equipo Cromatgrafo de gases para el 47

aceite esencial de Laureliopsis philippiana.

Tabla III. Actividad antifngica de Aspergillus y Fusarium, frente a aceite esencial 54

de L. sempervirens.

Tabla IV. Actividad antifngica de Aspergillus y Fusarium, frente a aceite esencial 56

de L. philippiana.
 LISTA ABREVIATURAS

Aceite (Ac)

Anlogos Precursores de cidos Nucleicos (APAN)

Anfotericina B (AnB)

American tipe colecction culture (ATCC)

Concentracin mnima inhibitoria (CMI)

Control positivo (CN)

Crecimiento fngico (CF)

Sensibilidad fngica (SC)

Sobre nivel del mar (s.n.m)

 1

1. RESUMEN

En esta investigacin se estudiaron dos especies vegetales nativas de nuestro

pas, Laurel (Laurelia sempervirens), y Tepa (Laureliopsis philippiana), estas dos

especies se encuentran en la regin de los ros, a las cuales se le han atribuido usos

medicinales por los pueblos nativos. Para esto, se obtuvo el aceite esencial de ambas

especies por medio de la tcnica de extraccin de arrastre de vapor, posteriormente

se evalu la actividad antifngica contra hongos filamentosos de inters clnico tales

como Fusarium y Aspergillus, de los cuales se utilizaron 4 cepas de Aspergillus y dos

cepas de Fusarium.

Los anlisis por espectroscopia de masas hechos a los aceites esenciales en

estudio, nos entregan compuestos derivados del Eugenol y el Safrol, los cuales

presentan una fuerte actividad antifngica. El aceite esencial de Tepa present la

mayor actividad contra todas las cepas de Aspergillus y Fusarium, mientras tanto el

aceite esencia de laurel present una menor actividad en contra de las cepas de

Fusarium.

Segn nuestros resultados, estas especies vegetales son una excelente fuente

para obtener fitofrmacos con actividad antifngica, y corroboran su potencial para

eliminar enfermedades fngicas que afectan a la industria alimenticia, as como el

grave problema de la resistencia antifngica que se presenta en pacientes

inmunodeprimidos y trasplantados.
 2

1.1 SUMARY

In this investigation, it ware studied two native vegetables species of our country,

laurel(Laurelia sempervirens), and Tepa (Laureliopsis philippiana), this two species

can be found in los ros regin, and they possessed medical uses atribbuted by the

native towns. For this, it was obtained the essential oil of both species, by the use of

steam distillation extraction method, then the antifungal activity against filamentous

fungus was measured, such as Fusarium and Aspergillus.

The mass spectroscopy analysis made to the essential oils studied, results on

compunds derived from Eugenol and Safrole, they present an strong antifungical

activity. The Tepa essential oil shown the greatest activity against all the aspergillus

and fusarium strains. Meanwhile, the laurel essential oil shown a minor activity against

the Fusarium strains.

Considering our results, these vegatable species are an excellant source to

obtain . with antifungal activity, and useful to elimiate fungic illness that affect th food

industry, treat the serious problema related with the antifungical ressistan common in

inmunocompromised patients and transplanted.

 3

2. INTRODUCCIN

2.1 Generalidades

La mayora de las infecciones hospitalarias tienen como agente causal las

bacterias, no obstante el nmero de infecciones por hongos en pacientes hospitalizados

tambin ha aumentado considerablemente en los ltimos aos. Los avances de la

medicina en las dos ltimas dcadas llevaron al surgimiento de drogas eficaces en la

induccin de inmunosupresin en pacientes trasplantados. Esta inmunosupresin est

asociada a un aumento del nmero de infecciones fngicas. Varios trabajos publicados

relatan casos de infecciones por hongos oportunistas en pacientes trasplantados,

portadores de leucemia, linfoma y pacientes en quimioterapia. De la misma forma,

pacientes internados en unidades de quemados, unidades de terapia intensiva, como

aquellos en post-operatorio de grandes cirugas tambin son susceptibles a desarrollar

infecciones por hongos oportunistas (Gerson et al., 1984; Rotstein et al., 1985; Mousa et

al., 1999 Tvora et al., 2003).

Las infecciones fngicas invasivas producidas por hongos filamentosos como

Fusarium y Aspergillus tiene una mortalidad elevada que va de un 60 a 90% y las

producidas por especies del gnero Candida una mortalidad de un 40% a 50% lo que

demuestra la gravedad de estos cuadros clnicos y la importancia de su tratamiento con

drogas antifngicas adecuadas (Colombo et al 2006; Nucci 2007; Liu et al., 2011; Carneiro

et al., 2011; Van der Linden et al., 2011). El problema que existe en la actualidad consiste

en que las especies de Fusarium, especialmente Fusarium solani, presenta una alta

resistencia a todas las drogas antifngicas disponibles en el mercado, algunas especies

 4

del gnero Aspergillus presentan resistencia a los azoles y polienos y las especies del

gnero Candida, especialmente Candida glabrata y Candida krusei, presentan resistencia

intrnseca al fluconazol, por esto la necesidad de buscar nuevas alternativas de

tratamiento (Godoy et al 2003: Lewis et al., 2005; Da Matta et al., 2007). Otro antecedente

que observamos es que las especies del gnero Fusarium y Aspergillus que producen

cuadros clnicos tambin son fitopatgenos. Fusarium, aparte de ser un importante

productor de micotoxinas, produce grandes prdidas en la agricultura al daar vegetales

como pltanos, tomates, maz, papas, etc. Una de las principales enfermedades en

vegetales causadas por Fusarium es llamada la enfermedad de Panam, trmino utilizado

para designar esta enfermedad que causa pudricin del tallo y frutos de una especie de

pltano (Musa acuminata) y que est diseminada en todas las regiones productoras de

pltano del mundo, esta enfermedad, cuando se presenta, causa prdidas de hasta un

100% de la produccin (ODonnell et al., 1998; ODonnell, 2000).

A pesar de la sntesis de nuevos agentes antimicrobianos, cepas de

microorganismos resistentes o sper resistentes estn surgiendo y creando la necesidad

de investigar el desarrollo de nuevas drogas. En este sentido, investigaciones recientes

involucran el screening de extractos vegetales para de esta forma conocer los

metabolitos secundarios que presenten relevante actividad biolgica (Alves et al., 2000;

Hoareau et al., 1999; Montanari et. al, 2001; Saito et. al, 1990; Silver & Bostian, 1993;

Yunes et al., 2001; Zhang, 2002).

El reino vegetal nos ha entregado a los largo de la historia gran cantidad de

medicamentos de uso popular. Desde las dcadas pasadas hasta la actualidad se han
 5

realizado numerosos estudios que nos han mostrado la capacidad antimicrobiana

derivada de las plantas. Recientemente, se ha incrementado el inters por el estudio de

extractos naturales y una gran porcin de la comunidad cientfica est dedicada a la

investigacin de productos naturales con propiedades medicinales, inclusive se han

determinado algunos compuestos con actividad biolgica tales como: alcaloides,

flavonoides, lactonas sesquiterpenicas, triterpenos, naftoquinonas, etc. (Ros, 2005;

Webster, 2008).

Las estrategias para desarrollar nuevos frmacos antimicrobianos estn en las

siguientes lneas de trabajo: modificacin sinttica de los productos ya conocidos, terapias

gnicas, uso de vacunas y validacin de molculas bioactivas derivadas de plantas. Se

sabe que durante muchos siglos antes del uso de productos sintticos, se utilizaban los

aceites esenciales e infusiones para los tratamientos de enfermedades, en estos

momentos se est acabando la dependencia ciega hacia los productos sintticos y los

estudios se estn volcando hacia los productos naturales, con la esperanza de obtener

nuevos frmacos ms seguros y con mayor efectividad (Gurinder y Daljit, 2010).

Los productos naturales se han convertido en un gran inters econmico e

investigativo ya que poseen aplicaciones muy verstiles, de acuerdo con los ltimos

estudios alrededor del 25% de los frmacos utilizados en la actualidad son derivados de

plantas superiores (Farooqi y Seeramu, 2001). Esto demuestra la necesidad de

reemplazar los xenobiticos sintticos como los antifngicos por molculas naturales que

tengan una actividad parecida o mejorada, de ah la gran importancia en determinar los

metabolitos secundarios de plantas que posean actividad antifngica, adems de las

 6

ventajas de utilizar compuestos naturales que generalmente poseen una baja toxicidad

para el paciente (Bittner, 2009).

Frente a la imperiosa necesidad de encontrar nuevos antifngicos, que posean

actividad a bajas concentraciones, nos hemos enfocado en el estudio de aceites

esenciales basados en las siguientes publicaciones.

Soliman y Badeaa (2002) en Egipto, analizaron los aceites esenciales obtenidos de

12 plantas medicinales contra Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. ochraceus y Fusarium

moniliforme, los resultados demostraron que los aceites esenciales de tomillo, canela,

calndula, albahaca y menta verde a 500 ppm inhibieron totalmente el desarrollo micelial

de todos los hongos testeados. Velluti et al., (2003) en Espaa, testearon los aceites

esenciales de clavo, canela y organo contra cepas de Fusarium proliferatum que se

encontraban en la superficie de maz contaminado, este estudio concluy que los

extractos de canela y organo presentaron un poder inhibitorio en el crecimiento del hongo

siendo determinante el factor temperatura para este evento. Singh et al (2004) en India,

analizaron los aceites esenciales obtenidos de Foeniculum vulgare (Hinojo), estos

compuestos fueron utilizados contra cepas de Aspergillus niger (AN), Aspergillus flavus

(AF), Aspergillus oryzae (AO), Aspergillus ochraceus (AO0), Fusarium graminearum (FG),

Fusarium moniliforme (FM), Penicillium citrium (PC), Penicillium viridicatum (PV),

Penicillium madriti (PM) y Curvularia lunata. Los resultados demostraron un elevado poder

inhibitorio de los aceites contra las cepas A. niger, A. flavus, F. graminearum and F.

monoliforme. Barrera & Garca (2008) en la ciudad de Mxico, comprobaron la efectividad

de los aceites de Thymus vulgaris, Cinnamomum zeylanicum, Syzygium aromaticum,

 7

Teloxys ambrosioides, Allium sativum, Citrus aurantifolia, Ruta chalepensis, Mentha

piperita y Eucalyptus globulus contra el hongo filamentoso Fusarium spp aislado del fruto

de la Papaya, de todos los aceites testeados el que present un mejor rendimiento fue

Thymus vulgaris. Pinto et al (2009) en Portugal, analizaron el eugenol obtenido del aceite

esencial de Syzygium aromaticum contra cepas del gnero Candida, Aspergillus y

especies de Dermatfitos, en este estudio comprobaron la disminucin de la

concentracin de ergosterol en la membrana de las levaduras e hifas de los hongos

filamentosos lo que demostr el alto poder fungicida de este compuesto. Campaniello et

al (2010) en Italia, utilizaron el compuesto eugenol obtenido de extractos de clavo de olor

contra especies de los gneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium, los resultados

mostraron que este compuesto presenta una actividad fungisttica para algunas cepas de

Aspergillus y Fusarium.

2.2 Molculas con actividad antifngica y sus mecanismos de accin

2.2.1 Polienos

Los polienos pertenecen a un tipo de antifngicos naturales descubierto a

principios de los aos cincuenta del siglo XX. Uno de los derivados de esta familia

ms eficaces es la anfotericina B (AnB) producida por Streptomyces nodosus. La AnB

puede formar sales solubles en entornos tanto bsicos como cidos, no se absorbe

ni por va oral ni por va intramuscular y es prcticamente insoluble en agua. El

principal mecanismo de accin de la Anfotericina B consiste en unirse al ergosterol

de la bicapa de la membrana en los microorganismos sensibles a l. Se cree que esta

interaccin tiene como resultado la formacin de poros hidrfilos compuestos por

 8

molculas polinicas unidas a los esteroles de la membrana. Esta configuracin da

origen a una estructura similar a un poro a travs de la cual se escapan componentes

citoplasmticos vitales (cationes mono o divalentes) y debido a ello produce la muerte

del microorganismo (Sanglard et al., 2003).

2.2.2 Los azoles

Descubiertos a finales de los aos sesenta del siglo XX, son compuestos

sintticos y constituyen el mayor grupo de agentes antifngicos. Los azoles utilizados

en medicina se clasifican en imidazoles con sustitucin en N-1 (ketoconazol,

miconazol, clotrimazol) y triazoles (fluconazol,itraconazol). Los compuestos de la

nueva generacin de antifngicos azlicos (posaconazol, ravuconazol, voriconazol)

tambin pertenecen al grupo de los triazoles. En levaduras y hongos, los azoles

tienen como diana celular comn un citocromo P450. Este citocromo P450,

actualmente denominado Erg11p, es el producto del gen ERG11. El nitrgeno libre

del anillo imidazol o triazol de los antifngicos azlicos se une al hierro del grupo

hemo del Erg11p como un sexto ligando y de este modo inhibe la reaccin enzimtica.

La afinidad de los derivados imidazlicos y triazlicos no slo depende de esta

interaccin, sino que tambin viene determinada por la sustitucin en N-1, la cual es,

de hecho, la responsable de la elevada afinidad de los antifngicos azlicos para su

diana. Cada uno de estos compuestos tiene su farmacocintica caracterstica y su

eficacia antifngica es bastante diferente entre las distintas especies de levaduras y

hongos con relevancia clnica (Heeres, 2010).

 9

2.2.3 Las equinocandinas

Las equinocandinas tales como la caspofungina, micafungina y anidulafungina,

son polipptidos cclicos que bloquean la sntesis de glucano, un polmero que

constituye el principal componente de la pared fngica, su mecanismo de accin es

inhibir de forma irreversible la enzima (1,3)-b-D-glucano sintasa, esta enzima no se

encuentra en las clulas de los mamferos, por lo cual indica que es una buena diana

de accin. Pueden actuar como fungicidas frente a muchas especies de cndida, y

en general se comportan como fungistticos frente a hongos filamentosos. Las tres

equinocandinas presentan una excelente actividad in vitro frente a Candida spp.,

Aspergillus spp., Pneumocystis carinii y los hongos dimrficos. Se ha descrito un

descenso de actividad in vitro frente a Candida parapsilosis y Candida guilliermondii,

aunque no est clara su trascendencia clnica. Son inactivas frente a las especies

que tienen 1,6-beta glucano en su pared como Cryptococcus spp., otros

Basidiomycetos y los Mucorales, tambin frente a Fusarium spp. y Scedosporium

spp.(Cuenca-estrella et al., 2009). Se han detectado cepas de Candida spp. Con

mutaciones en el gen que codifica la beta-glucano sintasa, que genera resistencia

cruzada a toda la familia farmacolgica (Rogers et al 2009).

2.2.4 APAN

(Anlogos Precursores de cidos Nucleicos) tenemos como representante a la

fluorocitosina o 5-fluorocitosina, es el nico antifngico disponible que pertenece a la

clase de las pirimidinas. Fue comercializado en los aos sesenta del siglo XX como

un antifngico de amplio espectro, aunque su limitada actividad fue reduciendo su

uso en la prctica clnica y en la actualidad apenas se utiliza. El mecanismo de accin

que posee este frmaco es fungisttico, se acopla a la enzima de membrana llamada

 10

citosina permeasa. Ya en el interior de la clula, la fluorocitosina es desaminada a 5-

flurouracilo, tras lo que se producen varias fosforilaciones que acaban por generar

cido fluorardilico, que se incorpora a la cadena de ARN, lo que ocasiona la

produccin de ARN aberrante y la posterior inhibicin de la sntesis proteica (Gavalda

et al., 2003, Pappas et al., 2009).

2.3 Productos naturales que reportan actividad biolgica

Existen varios reportes de actividad biolgica de molculas extradas del rbol

nativo chileno Drimys winteri Forst, la caracterstica principal es que posee derivados

del drimano, en los cuales destaca el Poligodial, Drimenol, Confortifolina. Estudios

previos han mostrado que poligodial posee actividad antifngica contra Candida

albicans y Saccharomyces cerevisiae (Mc Callion et al., 1982; Taniguchi et al., 1984;

Lee et al., 1998; De Almeida Alves et al., 2001). Existen patrones estructurales de los

compuestos sesquiterpnicos aislados de Drimys winteri Forst, los cuales estn

asociados a determinados efectos antifngicos y antimicrobianos, que tambin se

han observado en otros compuestos drimnicos presentes en otros vegetales, que

exhiben un amplio rango de actividad biolgica, destacando las asociadas a

molculas dialdehdicas tales como el Poligodial que se aprecia en la figura 1. (Anke

et al., 1991; Derita et al., 2013).

 11

Figura 1. Estructura del Poligodial.

 12

Diferentes estudios indican que Poligodial posee actividad antifngica en

Saccharomyces cerevisiae tal como fue mencionado anteriormente (Mc Callion et al.,

1982; De Almeida et al., 2001; Taniguchi et al., 1984; Lee et al., 1998) pero existen

contradicciones ya que el anlogo natural Isotadeonal o Isopoligodial ha sido

informado como activo en algunos casos o inactivo en otros. Basados en esta

informacin, se producen posiciones contrarias acerca de las principales

caractersticas estructurales requeridas para la actividad antimictica de drimanos.

Fujita y Kubo (2005) plantearon que la orientacin del grupo carbonilo en C-9 era

indispensable para la actividad antifngica. Por el contrario, Anke et al., (1991)

encontraron que Isotadeonal posee actividad antifngica, aunque inferior a la de

Poligodial, lo que fue corroborado por Derita y colaboradores (2009) y posteriormente

por el mismo grupo en el ao 2011. Otra caracterstica estructural a la cual se le ha

asignado un rol importante en la actividad antifngica es el fragmento aldehdico-

insaturado en C-8, el cual es esencial para la actividad de acuerdo a lo reportado por

Taniguchi et al., en 1988. Por otro lado, Fujita y Kubo (2005) informaron que poligodial

pierde actividad antifngica frente a Saccharomyces cerevisiae en algunos medios

de cultivo, debido a la formacin de compuestos pirrlicos entre sus aldehdos y las

aminas presentes en el medio. En la figura 2, se aprecia la reaccin que ocurre en

los medios de cultivo y la posterior inhibicin de la actividad del Poligodial.

 13

H+ R
R
HO
O H R N
N
:

CHO N

CHO
NH2R
H

OH
H2O

Figura 2. Prdida de la capacidad antifngica de poligodial frente a pptidos en

medios de cultivo de Saccharomyces cerevisiae.
 14

Tambin podemos mencionar la molcula Safrol, se puede apreciar su

estructura en la figura 3, se puede obtener de laurceas tales como el rbol nativo

laurel (Laurelia sempervirens). Bittner et al (2009) en su estudio de aceites esenciales

con posible actividad antifngica, descubri a travs de cromatografa de gases

acoplada a detector de masa, que el aceite esencial de laurel posee altas

concentraciones de Safrol y presenta una fuerte actividad antifngica en contra de

hongos filamentosos tales como Fusarium oxysporum y Penicillium spp. Por otra

parte se sabe que derivados del Safrol poseen actividad antineoplsica y adems

inhibe la angiognesis (Zhao et a.,l 2005).

 15

Figura 3. Estructura molecular del Safrol.

 16

En nuestro estudio encontramos que la Tepa (Laureliopsis philippiana) posee

como uno de sus compuestos mayoritarios el Eugenol, este compuesto es un fenil

propanoide, dbilmente cido, ligeramente soluble en agua y soluble en disolventes

orgnicos. El Eugenol es utilizado en detergentes, perfumes y jabones debido a su

aroma (Barceloux, (2008), Bedoukian (1986). El Eugenol tiene varias propiedades

farmacolgicas tales como antioxidante, antibacterial, antihelmntica y antifngica la

cual es la base de nuestro trabajo. Est reportado que la candidiasis es una de las

enfermedades que est causando varios problemas debido a la resistencia que

presentan algunas cepas de Candida, est demostrado que in vitro la actividad

antifngica del eugenol (figura 4) y el metil eugenol ( figura 5) y en combinacin con

fluconazol (una droga antifngica) frente a 64 cepas sensibles a fluconazol y 34

cepas resistentes al fluconazol de Candida albicans, todas las cepas testeadas fueron

susceptibles a la combinacin eugenol/metileugenol ya sea con fluconazol o

anfotericina B (AnB), esto indica que existe un sinergismo entre los frmacos

convencionales y la combinacin con Eugenol y sus derivados, pueden ser un

tratamiento alternativo para combatir las infecciones por cepas de Candida albicans

resistentes a drogas antifngicas (Ahmad, A et al 2010, Khan, M.S.A 2012).

 17

Figura 4. Estructura del Eugenol.

 18

Figura 5.Estructura del Metileugenol.

 19

Unos de los mecanismos demostrado de actividad antifngica del Eugenol es

la capacidad que posee para interferir con la estructura celular de Candida albicans,

las cepas de Candida se expusieron a 0,5mg/ml de Eugenol, se encontr que a estas

concentraciones existe un dramtico cambio en la conformacin de la clula fngica

y esto interfiere con su adhesividad y la formacin de las hifas, reduciendo

drsticamente la capacidad de colonizar los tejidos del husped (Braga, P.C 2007).

En el estudio reportado por De Oliveira et al.(2013), se determin que Eugenol

posee una fuerte actividad en contra de Trichophyton rubrum, en este estudio se

utiliz como control positivo el ketoconazol, un antifngico que es comnmente

utilizado para las infecciones por T. rubrum, se concluy que Eugenol es ms potente

que ketoconazol y adems los mecanismos presentados por Eugenol, es que induce

anomalas morfolgicas las cuales son muy importantes para el crecimiento y

virulencia del hongo, este trabajo demuestra que Eugenol es activo contra la

membrana y pared celular de T. rubrum, y adems interrumpe la biosntesis de

ergosterol.

2.4 Hiptesis

Los extractos de aceites esenciales de Laurel (Laurelia sempervirens) y Tepa

(Laureliopsis philippiana), poseen actividad antifngica.

2.5 Objetivos generales

Determinar el grupo farmacolgico (fungicida o fungisttico) al que pertenecen los

aceites esenciales y Fitoconstituyentes de Laurelia sempervirens, Laureliopsis philippiana,

contra especies de los gneros Fusarium y Aspergillus.

 20

2.6 Objetivos especficos

1- Determinacin de la composicin qumica de los extractos y sus molculas.

2- Determinar actividad antifngica contra cepas del gnero Aspergillus y gnero

Fusarium.
 21

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Material biolgico

3.1.1 Especies vegetales

Las especies vegetales utilizadas en el estudios pertenecen a la familia de

las monimiceas, Las monimiceas (Monimiaceae) es una familia

de Angiospermas del Orden Laurales. Consta de 23 gneros con unas 150 especies,

que se distribuyen por los trpicos del viejo y nuevo mundo, y las zonas templadas

de Chile, Argentina, Nueva Zelanda, Australia y Tasmania. (Philipson, W.R. (1993)).

3.1.2 Laurelia sempervirens

Sinnimos: Pavonia sempervirens Ruiz et Pav.; Thiga chilensis Mol.; Laurelia

aromatica Juss. ex Poir; Laurelia serrata Bertero; Atherosperma sempervirens (Ruiz

et Pav.) Baill.

Distribucin y Hbitat: Laurel se distribuye entre Colchagua y Puerto Montt (VI

a X regin) hasta los 700m s.n.m. Habita en suelos profundos y hmedos formando

parte de los Tipos Forestales; Roble-Raul-Coihue, Roble-Hualo, Ciprs de la

Cordillera y Siempre verde. Descripcin: rbol siempre verde de hasta 30m de alto

2m de dimetro; corteza delgada, madera maloliente. Especie muy parecida a Tepa.

Hojas opuestas, olorosas, oblongas, atenuadas en la base, pecolos pubescentes de

1cm de largo. Lminas de 5-10 x 2,5-3,5cm, coriceas, lustrosas, con nervio medio

algo pubescente en el envs, bordes aserrados en los dos tercios superiores, cada

diente esconde un pequeo mucrn que no se encuentra exactamente en la punta

 22

como es el caso de la Tepa. Flores hermafroditas o unisexuales por aborto, pequeas

de 5-8mm de largo, color rojizo-verdosas, dispuestas en racimos, pednculos 1-2cm

de largo, flores con perianto campanulado de tubo muy corto partido en 6-9 tpalos

desiguales, 6-12 estambres y 4 estaminodios en las unisexuales; varios carpelos,

estilo plumoso con el estigma terminal. El fruto es un aquenio, casi oval, coronado

por el perianto, de 2,5cm de largo, formado por el perigonio de color caf oscuro;

semillas fusiformes de cuerpo aovado, de 1,5-1,8cm de largo, con el estilo cubierto

de pelos de 7mm de largo que se esparcen horizontalmente o hacia abajo (Ruiz y

Pavn, 1798). En la figura 6 se puede apreciar esta especie vegetal.

 23

Figura 6. Hoja de laurel a la izquierda, rbol de laurel derecha.

 24

3.1.3 Laureliopsis philippiana

Sinnimos: Laurelia philippiana Looser; Laurelia serrata sensu Phil.

Distribucin y Hbitat: Gnero monotpico y endmico de Chile y Argentina. Se

distribuye desde el Maule hasta Aisn (VII a XI regin). Habita en suelos profundos y

hmedos formando parte de los Tipos Forestales; Roble-Raul-Coihue, Coihue-Raul-

Tepa y Siempre verde. Descripcin: rbol siempre verde de hasta 30m de alto 1,4m

de dimetro; corteza delgada, madera maloliente. Especie muy parecida a Laurel.

Hojas opuestas, olorosas, oblongas, atenuadas en la base, pecolos pubescentes o

no de 5-8mm de largo. Lminas de 4-9 x 1,5-4cm, coriceas, lustrosas, con nervio

medio pubescente de pelos amarillos, igual que el envs de la lmina, bordes muy

aserrados en los dos tercios superiores, cada diente termina con un pequeo mucrn.

Flores hermafroditas o unisexuales por aborto, pequeas de 5-6mm de largo, color

rojizo-verdosas, dispuestas en racimos; los pednculos vellosos de 2-3mm de largo,

flores con perianto campanulado partido en 7-9 tpalos ms o menos iguales,

vellosos por fuera, 4 estambres y 8-20 estaminodios; varios carpelos, estilo plumoso

con el estigma terminal. El fruto es un aquenio, casi oval, coronado por el perianto,

de 1-1,3cm de largo, formado por el perigonio que envuelve varios carpelos, velloso,

de color caf oscuro; semillas fusiformes de cuerpo aovado, de 0,8-1,2cm de largo,

con el estilo cubierto de pelos de 5-6mm de largo que se esparcen horizontalmente o

hacia abajo. (Looser 1934) En la figura 7 se pude observar la hoja de Tepa y la

estructura de su rbol.
 25

Figura 7. Izquierda hojas de Tepa, derecha rbol de Tepa.

 26

3.2 Especies fngicas

3.2.1 Aspergillus

El gnero Aspergillus fue descrito por primera vez en 1729 por P. A. Micheli, que

marc el punto de partida de la micologa como ciencia en su obra Nova Plantarum

Genera. La denominacin del gnero se debe a la similitud morfolgica de la cabeza

conidial con un aspergillum (instrumento religioso utilizado para dispersar el agua

bendita). Posteriormente, el trmino fue validado por Link en 1809. Este gnero est

encuadrado dentro del orden Eurotiales, y pertenece a la familia Trichocomaceae. En

la clasificacin de los hongos filamentosos, el tipo de reproduccin es un factor

importante. Tradicionalmente, el gnero Aspergillus se inclua dentro de los

deuteromicetos (subd. Deuteromycotina) u hongos imperfectos, porque en ellos no

se haba podido encontrar la forma sexual o teleomrfica, es decir, slo se les conoca

la forma asexual o anamrfica y por ello no podan clasificarse como ascomicetos,

basidiomicetos o zigomicetos. Los deuteromicetos se clasifican en base a su

morfologa asexual aunque en la actualidad se les conozca la forma teleomrfica

(sexual) (Carlile et al., 2001), hecho que slo ocurre en el 5% de las especies

descritas (Seifert y Gams, 2001). En el caso de Aspergillus, aproximadamente un

tercio de las especies descritas poseen forma sexual conocida (Geiser, 2008). Los

principales gneros en los que se agrupan las formas teleomrficas de Aspergillus

son Eurotium y Emericella. La seccin Circumdati, a la que pertenece Aspergillus

ochraceus, posee el gnero teleomorfo Neopetromyces (Frisvad y Samson, 2000),

mientras que la seccin Flavi (Aspergillus flavus) se asocia a miembros del gnero
 27

teleomorfo Petromyces (Subramanian, 1972). En la produccin industrial de

enzimas, esta especie tambin ha sido utilizada como productora de catalasa (Hjort,

2003; Wsten et al., 2007).

Los hongos del gnero Aspergillus se multiplican rpidamente sobre materia

vegetal almacenada o en descomposicin de inters agro-alimentario (cereales,

frutas, semillas, etc.), y en un amplio rango de temperatura, humedad y aerobiosis,

contaminando as muchos sustratos (Pointing y Hyde, 2001; Perrone et al., 2007).

Algunas de sus especies son fitopatgenas, destacando nuevamente A. niger,

que produce, entre otras enfermedades, la antracnosis del algodonero y el carbn

(Oelofse et al., 2006). Sin embargo, es por su capacidad de producir diversas

enfermedades de distribucin universal en el ser humano y animales por lo que su

estudio y conocimiento en los ltimos aos ha aumentado en gran medida (Denning,

2006).

La primera descripcin de una patologa provocada por Aspergillus la hacen

Meyer y Emmert en 1815, que descubrieron la enfermedad pulmonar en el grajo. En

1847, Sluyter publica la primera descripcin de neumomicosis humana causada por

Aspergillus, y tres aos ms tarde, Fresenius cultiva el hongo a partir de las lesiones

del tracto respiratorio en pjaros y denomina a la especie aislada Aspergillus

fumigatus, introduciendo adems el trmino Aspergilosis. En un sentido amplio, las

Aspergilosis se definen como el dao a los tejidos provocados por hongos del gnero

Aspergillus (Vanden Bossche, 1988). De las ya mencionadas 250 especies de

Aspergillus descritas, solamente 8 son responsables de la mayora de infecciones en

 28

humanos. Aspergillus fumigatus es el patgeno ms comn, seguido de A. niger, A.

nidulans, A. terreus, A. clavatus, A. flavus, A. niveus y, finalmente, A. ustus (Kradin y

Mark, 2008). Los sntomas de las Aspergilosis engloban manifestaciones de cuatro

tipos: micotoxicosis, enfermedades alrgicas, colonizaciones saprofticas o crnicas

y enfermedades invasoras o sistmicas (Denning, 2006). La gravedad de la

Aspergilosis depende de varios factores, aunque uno de los ms determinantes es el

estado del sistema inmune del enfermo (Vonberg y Gastmeier, 2006). As, se

comportan como patgenos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos

(pacientes con Virus de la Inmunodeficiencia Humana VIH, trasplantados, pacientes

oncolgicos,etc). Una caracterstica importante de ciertos hongos del gnero

Aspergillus es su capacidad de producir toxinas. Si stas se producen sobre

alimentos de consumo, su presencia representa un riesgo para la salud. Las

principales micotoxinas producidas por Aspergillus son las aflatoxinas y las

ocratoxinas (Perrone et al., 2007). Otras micotoxinas, como la patulina,

esterigmatocistina, citrinina y el cido peniclico, tambin pueden ser producidas por

algunos hongos de este gnero. En esta investigacin, utilizamos 4 especies de

Aspergillus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus

terreus, en la figura 8 se puede apreciar la microestructura del gnero Aspergillus,

en la figura 9 macroestructura de las cuatro especies en estudio y en la figura 10

microestructura de las especies en estudio.

 29

Figura 8. Estructura microscpica de Aspergillus.

 30

Figura 9. Macroestructura de Aspergillus. (A) A.flavus, (B) A.niger, (C) A.terreus, (D)

A. fumigatus.
 31

Figura 10. Microestructura de Aspergillus. (A) A.flavus, (B) A.niger, (C) A.terreus,

(D) A. fumigatus.
 32

3.2.2 Fusarium

Fusarium comprende un gran nmero de especies que son comnmente

fitoptogeno y patgeno en algunos casos puntuales en humanos. Pertenece al reino

Fungi, divisin eumycota, subdivisin Deuteromycotina clase hyphomycetes, orden

moniliales Familia Moniliaceae, (Lacaz et al 1998). Recientemente, otros autores han

sugerido la sustitucin de la subdivisin Deuteromycotina por Ascomycotina y

Basidiomycotina por la capacidad que tiene estos hongos de tener estructuras

sexuadas que ofrecen estas subdivisiones. En esta condicin, como lo describe (De

Hoog et al. 2000) Fusarium pertenece a la divisin Eumycota divisin Ascomycota,

clase Euascomycetes, orden Hipocreales, Familia Hypocreaceae, genero Fusarium.

La mayora de las especies de este gnero habita bajo tierra y races de las

plantas, los fragmentos de plantas y compuestos orgnicos depositados

aproximadamente a 100 cm de profundidad del suelo. Estos hongos, parsitos o

saprofitos, dispersan sus propgulos por accin de la lluvia, el viento y los insectos

acuticos.

Otros grupos que habitan en plantas superiores pueden difundir sus propgulos

con agua de la lluvia. Son importantes patgenos causantes de cncer en los brotes,

lesiones en las ramas y tambin obstruyen las inflorescencias de algunas plantas

(Burgess, 1981). Otras especies provocan daos en la semilla y frutos del campo,

causando prdidas antes y despus de la recoleccin (Mills,1989). Algunas especies

pueden producir toxinas que afectan la permeabilidad de la membrana de las clulas

as como su metabolismo, la variedad de Fusarium oxysporum produce

 33

enfermedades en tomates, camote, peras y fue el responsable de la enfermedad del

banano en Panam, produciendo la destruccin de miles de hectreas en Amrica

Central (Alexoupoulos CJ et al., 1996). Las especies que causan enfermedades en el

hombre y actan con mayor frecuencia son F. solani, F. oxysporum, F. moniliforme,

F. proliferatum, F. chladosporum, etc ( Kwon-Chung. 1992).

La principal caracterstica de este gnero es la produccin de conidios en forma

de hoz con extremos afilados constituyendo los llamados macroconidios (ligeramente

curvada o inclinada), su presencia es la principal caracterstica para identificar al

gnero. Algunas especies de macroconidios con una caracterstica estructural

pronunciada se les denomina como clulas pie. Emergen de las clulas monidigenas

(filides), se pueden presentar solas o agrupadas en masa que crecen directamente

del micelio vegetativo conocido como esporodoquios. Los macroconidios son

generalmente agrupados por materiales mucilaginosos que forman masas. Ellos

pueden tener uno hasta diez por tabique transversal (Guarro et al 1995). Sus

microconidios son pequeos, pueden tener forma elantoides elipsoide, piriforme,

ovoides o subglobosos, unicelulares, a veces pueden presentar un tabique, se

producen en mono o polifialidade y estn organizadas como cabezas mucosas o en

cadenas; una de las caractersticas importantes es que tienen base truncada (Guarro

et al 1995) (Nelson et al.,1994). En la figura 11 podemos aprecias sus

micromorfologias. En nuestros ensayos se trabajaron con dos cepas de Fusarium,

F.oxysporum y F. solani, en la figura 12 se puede apreciar su macromorfologa y en

la figura 13 micromorfologia de Fusarium solani y Fusarium oxysporum.

 34

Figura 11. Micromorfologia de Fusarium.

 35

Figura 12. Macromorfologa (A) Fusarium solani, (B) Fusarium oxysporum.

 36

Figura 13.Micromorfologia de (A) Fusarium oxysporum, (B) Fusarium solani.

 37

3.3 Reactivos

Se utiliz, para extraer los aceites esenciales agua destilada, obtenida por

equipo de destilacin Pobel, alcohol etlico marca Merck al 99,9% de pureza, etanol

al 70% marca Merck para desinfectar el lugar de trabajo, sulfato de sodio marca Merck

para eliminar residuos de agua en los aceites esenciales. Tambin se utilizaron

solventes de grado analtico como acetonitrilo, metanol, para cromatografa de gases.

3.3 Equipos

Estufa de cultivo Merck.

Rotavapor Bchi R-114, con un bao termorregulado Bchi Waterbath B-480.

Para la cromatografa de gases se us un Cromatgrafo de Gases Hewlett

Packard 6890 acoplado a un detector selectivo de masas Hewlett Packard 5973 y

provisto de una columna capilar HP Ultra 2 de 25 m de longitud y de 0.2 mm de

dimetro interno, y de un sistema de anlisis de datos.

3.5 Medios de cultivo

Se utiliz agar sabouraud dextrosado para el cultivo de todas las cepas fngicas

en estudio, su composicin es la siguiente: Peptona 10g ,Dextrosa 40g ,Agar-Agar

15g Agua Destilada c.s.p 1000g, pH 7.0-7.2 .

 38

3.6 Mtodos

3.6.1 Preparacin placas agar sabouraud

Se adicion 65 g de medio deshidratado a 1000 ml de agua destilada y se

calent hasta su completa disolucin, luego se agreg 0,05 g. de cloranfenicol

levgiro y 100 mg de gentamicina por litro de medio. Se esteriliz en autoclave a

121C por 15 minutos. Se distribuy en placas estriles y se almacen refrigerando

para su mejor conservacin.

3.6.2 preparacin de las cepas fngicas en estudio

Se utiliz 4 cepas de los gneros Aspergillus (ATCC), 2 cepas de Fusarium

(ATCC), almacenados en el Instituto de Microbiologa Clnica de la Universidad

Austral de Chile.

Hongos Filamentosos: Fusarium solani ATCC 18006; Fusarium oxysporum

ATCC 9991; Aspergillus fumigatus ATCC 1022; Aspergillus terreus ATCC 10070;

Aspergillus flavus ATCC 9643 y Aspergillus niger ATCC 1004.

3.6.3 Cultivo e incubacin

Cada una de las cepas se sembr en agar Sabouraud Dextrosa (SDA) con la

tcnica estndar de siembra usando el asa de Nquel-Cromo en forma de L. La

incubacin se realiz a 25C durante 7-15 das, revisando diariamente los cultivos

para ver el crecimiento del micelio. Posteriormente, las cepas se sembraron en agar

Papa-zanahoria (PCA) para una mejor fructificacin.

 39

3.6.4 Macromorfologa de colonias

Se observaron las caractersticas de la colonia desarrollada en el agar, teniendo

en consideracin el color del micelio, la textura y el color del reverso del medio de

cultivo.

3.6.5 Pureza de la colonia

Se realiz un examen directo de la cepa observada, efectuando la tcnica

estndar, usando asa de Nquel-Cromo en forma de gancho, tomando una pequea

porcin del agar y depositndola sobre una gota de lactofenol que se encontraba en

un portaobjetos previamente sollamado. La preparacin se cubri con un

cubreobjetos sollamado y se realiz la observacin microscpica. Para verificar la

pureza de la colonia, se tom en consideracin la presencia de hifas tabicadas

hialinas, con estructuras caractersticas y la ausencia de bacterias u otro

contaminante.

3.7 Obtencin de los aceites esenciales

Se recolectaron hojas de Laurel (Laurelia sempervirens) y Tepa (Laureliopsis

philippiana) del parque Oncol, perteneciente a la comuna de Valdivia. Su

identificacin la realiz la Sra. Cristina San Martn, docente del instituto de Botnica

de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad Austral de Chile, Valdivia.

Se tomaron 1,5 kilos de hojas frescas de cada especie vegetal y se extrajo por

la tcnica de arrastre a vapor, Segn la tcnica de hidrodestilacin (Jun Tian. Et al.,

2011) durante 2 horas hasta obtener la totalidad del aceite esencial de cada muestra,
 40

se envasaron en frascos mbar y se guardaron a temperatura ambiente entre 18-22

grados Celsius, hasta su utilizacin en las pruebas biolgicas.

3.8 Test de susceptibidad con aceites esenciales

Las pruebas hechas en placas sabouraud fueron para determinar la sensibilidad

al aceite esencial de los microorganismos fueron realizadas mediante la tcnica de

Vincent & Vincent por quintuplicado, con la modificacin de sustituir los sensidiscos,

por sacabocado, agregando 25l del aceite esencial puro y las diluciones seriadas,

1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000 en etanol al 70% y adems se hicieron los controles

con el solvente puro. Los cultivos se dejaron incubar por 5 das y fueron utilizadas

placas de control de crecimiento con el mismo tiempo de incubacin, que las

sometidas a los test antifngicos, figura 14.

 41

Figura 14. Pocillos: A) aceite concentrado, B) aceite diluido 1:10, C) aceite diluido

1:100, D) aceite diluido 1:1000, E) aceite diluido 1:10000, F) alcohol 70. El solvente

para las soluciones fue alcohol 70. La placa previamente fue inoculada con cepa

fngica en agua destilada estril, de densidad 0.5 Mc Farland.

 42

4. RESULTADOS

4.1 Anlisis cromatogrficos y caracterizacin, de los aceites esenciales de

Laurelia sempervirens (Laurel) y Laureliopsis philippiana (Tepa).

Los datos aportados por el Cromatgrafo de gases para el anlisis de las

molculas presentes en Laurelia sempervirens (Laurel).

En la tabla I, donde podemos observar los compuestos encontrados por el

Cromatgrafo de gases acoplado a detector de masas (GC-MS), uno de los

compuestos detectados del aceite esencial de Laurel (Laurelia sempervirens) es el

Safrol o 1,3-benzodioxol,5-(1-propenil), es el mas abundante.

 43

Tabla I. Resultados entregados por el equipo Cromatgrafo de gases para el aceite

esencial de Laurelia sempervirens. Todos los compuestos detectados en la tabla

estn con una certeza del 95%, con respecto a la biblioteca interna del equipo.

COMPUESTO T.R REA (%)

-Pinene 941,11 1.48

Camphene 957,37 0.11

-Phellandrene 1009,80 0.33

p-Cymene 1031,75 0.12

-Phellandrene 1037,66 1.08

3-Carene 1070,4 0.42

Isosafrol 1177,5 11.90

Safrol 1292,6 65.03

Piperonal 1358,2 0.37

3-Allyl-6-methoxyphenol 1359,6 1.13

-Caryophyllene 1384,9 0.74

-Gurjunene 1396,6 0.24

-Humelene 1440,9 0.35

Germacrene D 1444,8 2.33

Spathulenol 1457,2 11.16

-Cadinol 1615,0 1.10

 44

Tambin podemos confirmar la presencia del safrol a travs de su huella digital

de fragmentacin, debemos recordar que cada molcula en el detector de masas se

fragmenta de manera particular y es ste principio el que permite detectar con gran

certeza las molculas descritas en esta tesis, el safrol se encontr con 99% de

coincidencia en comparacin a los fragmentos simulados del detector de masas, esto

se puede ver en la figura 15.

 45

Figura 15. Estructura molecular del Safrol, y las seales caractersticas detectadas
por el espectrmetro de masas.
 46

Datos entregados por el Cromatgrafo de gases para el anlisis de las

molculas presentes en Laureliopsis philippiana (Tepa).

En la tabla II se destacan los compuestos mayoritarios de la Tepa, tales como

el Eugenol, Eucaliptol y Safrol.

 47

Tabla II. . Resultados entregados por el equipo Cromatgrafo de gases con respecto

al anlisis del aceite esencial de Laureliopsis philipiana. Todos los compuestos

detectados en la tabla estn con una certeza del 95%, con respecto a la biblioteca

interna del equipo.

COMPUESTO TR (min) REA

campheno 3,87 0,39

tricico[5.3.0.0(4,8)]decano 4,26 4,69

alfa- pineno 4,34 0,96

beta pineno 4,4 1,73

D-limoneno 4,85 0,49

Eucaliptol 4,89 13,89

1,3,7-octatrien,3,7 dimetil 5,1 0,51

cis,-beta-terpineol 5,37 0,21

2-ciclohexen-1-ol,1 metil 6,26 0,49

Safrol 8,21 30,07

Eugenol 9,12 6,01

copaeno 9,34 0,26

ciclobuta[1,2:3,4] diciclopentano 9,47 0,24

biciclo[3.1.1] pet-2-eno,2,6 dimetil 10 0,33

1H- 10,13 2,37

CICLOPROP[2]azuleno,decahidro

Benceno,1-metil-4-(1,2,2-trimetil 10,5 1,14

 48

isoledeno 10,53 0,13

1H-CICLOPROP[2]azuleno, 10,81 0,48

1.a,2,3,4,4

napfaleno,1,2,3,4,4a5,6,8a, octa 10,93 0,35

nafaleno,1,2,3,4-6,8,a,-hexahidro 10,97 0,18

benceno 1,2,3-trimetoxi-5-(2-pro 11,24 7,12

oxido de cariofileno 11,67 0,54

isolemicina 12,23 0,37

tricosano 18,73 0,34

hexacosano 19,58 0,3

escualeno 20,02 0,3

dtriacontano 20,34 0,27

dotriacontano 20,55 0,28

hexacosano 21,05 0,2

heptacosano, 1-cloro 21,18 0,18

escualeno 21,31 0,18

nonacosano 21,76 0,2

nonacosano 21,86 0,24

 49

Se destaca en la tabla II la presencia de Eugenol y Safrol, compuestos que

tienen reportada actividad antifngica (bittner et al., 2009,De Oliveira et al., 2013), en

la figura 16 se aprecian las seales caracteristicas del Eugenol y su estructura

molecular.
 50

Figura 16. Estructura molecular del Eugenol, y sus seales caractersticas,

detectadas por el espectrmetro de masas.

 51

4.2 Resultado de los ensayos de actividad antifngica con Ac. Esencial Tepa

y Laurel contra cepas de Fusarium y Aspergillus

4.2.1 Susceptibilidad antifngica mediante tcnica de difusin en agar

Mediante el anlisis de la susceptibilidad por difusin en agar se pudo

comprobar que de las 6 cepas de hongos filamentosos analizados, cuando fueron

expuestos al aceite esencial de L. sempervirens, las 6 cepas no presentaron

crecimiento de micelio en todo el agar con excepcin de Fusarium solani, figura 17

(E), que si present halos de inhibicin, en la tabla III se puede observar la

sensibilidad de las cepas frente a aceite esencial de L. sempervirens, mientras que

cuando fueron expuestos a aceite esencial de L. philippiana figura 18 prcticamente

ninguna cepa pudo desarrollarse en el agar con la excepcin de fusarium solani

figura 18 (E) donde se puede observar muy poco crecimiento, en la tabla IV se

aprecia la sensibilidad de las cepas frente a aceite esencial de L. philippiana, ntese

el crecimiento de las colonias que no fueron expuestas al extracto en la figura 19.

 52

Figura 17. Laurel frente a: A fumigatus (A), A. niger (B), A flavus (C), A terreus (D),

F. solani (E), F. oxysporum (F).

 53

Tabla III. Actividad antifngica de Aspergillus y Fusarium, frente a aceite

esencial de L. sempervirens. A) Cepa con aceite esencial concentrado B) Cepa con

aceite esencial dilucin 1:10, C) Cepa con aceite esencial dilucin 1:100, D) Cepa

con aceite esencial dilucin 1:1.000, E) Cepa con aceite esencial dilucin 1:10.000,

F) Control negativo: Alcohol 70%, CN: Control positivo. SC: Sin crecimiento, CF:

Crecimiento fngico.

Dilucin de aceites esenciales

Especies CN A B C D E F

A.flavus Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A. terreus Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A.niger Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A.fumigatus Crecimiento SC SC SC SC SC SC

F. solani Crecimiento SC SC CF CF CF CF

F. oxysporum crecimiento SC SC SC CF CF CF
 54

Figura 18. Tepa frente a: A fumigatus (A), A. niger (B), A flavus (C), A terreus (D), F.

solani (E), F. oxysporum (F).

 55

Tabla IV. Actividad antifngica de Aspergillus y Fusarium, frente a aceite

esencial de L. philippiana. A) Cepa con aceite esencial concentrado B) Cepa con

aceite esencial dilucin 1:10, C) Cepa con aceite esencial dilucin 1:100, D) Cepa

con aceite esencial dilucin 1:1.000, E) Cepa con aceite esencial dilucin 1:10.000,

F) Control negativo: Alcohol 70%, CN: Control positivo. SC: Sin crecimiento, CF:

Crecimiento fngico.

Dilucin de aceites esenciales

Especies CN A B C D E F

A.flavus Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A. terreus Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A.niger Crecimiento SC SC SC SC SC SC

A.fumigatus Crecimiento SC SC CF CF CF CF

F. solani Crecimiento SC SC CF CF CF CF

F. oxysporum crecimiento SC SC SC CF CF CF
 56

Figura19. Cepas control. A fumigatus (A), A. niger (B), A flavus (C), A terreus (D),

F. solani (E), F. oxysporum (F).

 57

5. DISCUSIN

Segn los resultados cromatogrficos, por CG-MS hechos a Laureliopsis

philippiana se determin la presencia de Eugenol y Eucaliptol en el aceite esencial.

Adems en este anlisis se observ cmo compuestos mayoritarios, derivados de la

biosntesis del isopreno, en los cuales se destaca el Eugenol (6,05 %), el Metil

eugenol (7,12%), el Safrol (30,07%) que en caso de Laureliopsis philippiana y L.

sempervirens se encuentra como compuesto mayoritario, debo mencionar que en el

caso de Tepa (Laureliopsis philippiana) su actividad fue muy superior a la de Laurel,

esto se puede deber a que la Tepa (Laureliopsis philippiana) contiene derivados del

Eugenol y que posiblemente pueden potenciar su actividad, tal como se observa en

la figura 18. Con respecto L. sempervirens posee una gran cantidad de Safrol

(65,03%). Desde el punto de vista bibliogrfico existen escasos antecedentes sobre

la composicin qumica de estos aceites esenciales, estos resultados permiten

ampliar el conocimiento sobre la composicin qumica de nuestra flora nativa. En

ambos casos, destaca la presencia de Safrol como constituyente mayoritario, donde

se reporta la presencia de Safrol en el aceite esencial de Laurel (Bitner et al., 2009),

hay que mencionar que la abundancia de este compuesto no es la misma que en

dicho estudio, es probable que las diferencias en las concentraciones se deba a la

zona geogrfica, condiciones climticas, etc. Tambin podemos destacar la similitud

en las molculas encontradas en la Tepa y Laurel, ambos tienen considerables

concentraciones de Safrol, esto puede deberse a que pertenecen a la misma familia

de las monimiceas.
 58

Estos resultados cromatogrficos corroboran ms an la capacidad antifngica

de los extractos de Laurel y Tepa ya que los reportes de actividad antimicrobiana de

los compuestos encontrados est bien documentado (Kamatou et al., 2012). La Tepa

fue el aceite esencial que present mayor actividad, puede ser por la presencia de

Eugenol ya que en todos los aceites esenciales que est presente esta molcula se

observa una fuerte actividad antifngica (Bittner et al., 2009; De Oliveira et al., 2013).

El Safrol fue prohibido para su uso en aditivos alimenticios, ya que un estudio

demostr que su uso en ratas a altas concentraciones produce cncer en ellas, ste

estudio es controversial, ya que los derivados del Safrol que son supuestamente

cancergenos, que se encuentran en la orina de ratas, no se encuentran en humanos

(Benedetti 1977). Se debe destacar que el potencial de este compuesto no solo est

circunscrito a su uso como antifngico tambin se est utilizando como precursor en

la sntesis de nuevos frmacos contra el Alzheimer, ya que el Safrol se puede

modificar hasta lograr obtener compuestos similares a la AMPAKINA CX-516,

inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa. Los resultados son similares al compuesto

AMPAKINA CX-516, mientras que Isoeugenol y Eugenol son molculas similares al

Safrol, las cuales presentan una fuerte inhibicin de la enzima acetilcolinesterasa

(Cobar et al., 2005), estos datos son un complemento a nuestro trabajo ya que la

versatilidad de estas molculas no solo est circunscrito a la actividad antimicrobiana

sino que se extiende hasta su accin farmacolgica frente a algunas enfermedades

crnicas tales como el Alzheimer u otras.

Tambin es interesante mencionar que los aceites esenciales de Tepa y Laurel

presentaron una inhibicin total del crecimiento de las cepas de Aspergillus, gnero
 59

que presenta resistencia intrnseca a los azoles como es el caso de A. lentulus. Las

cepas fueron dejadas por varias semanas y no se observ crecimiento en las placas,

tal como se observa en las figuras 18 y 19, por lo que se comprueba su efecto

fungicida, adems debo destacar que Tepa y Laurel tuvieron actividad contra

Fusarium solani, especie fngica altamente resistente a los antifngicos conocidos

hasta el da de hoy, los pacientes afectados por fusariosis sistmica generalmente

presentan una mortalidad cercana al 100%. En el experimento realizado por (Mayayo

2012), se inocularon ratas inmunocompetentes, con Fusarium solani, la mortalidad

fue del 100%.

Lamentablemente la concentracin mnima inhibitoria no pudo ser determinada

ya que segn las pruebas de susceptibidad la dilucin 1:10000 presentaba actividad,

queda claro que la actividad de los aceites es muy alta a bajas concentraciones,

tambin es necesario agregar que los extractos no son compuestos puros aislados,

sino que son una batera de compuestos que probablemente presentan sinergismo

en su actividad. Est demostrado que algunos compuestos naturales combinados con

antifngicos convencionales tales como anfotericina B y algunos azoles, se ve

potenciada su actividad significativamente (alhmad et al., 2010).

Los posibles mecanismos de accin de los terpenos contenidos en los aceites

esenciales puede deberse a su volatilidad y bajo peso molecular, de esta forma

pueden atravesar estructuras de resistencia de la especie fngica fcilmente. As,

tanto el dao a la membrana citoplasmtica como una reduccin en su contenido de

ergosterol, promueven la formacin de poros por los cuales difunden molculas e

iones (fundamentalmente K+ y H+), lo que finalmente compromete la viabilidad de la

 60

membrana. La deplecin de ergosterol de la membrana fngica, o la inhibicin de su

sntesis, son mecanismos relevantes, puesto que este compuesto tiene una funcin

estructural en el hongo (Avello et al., 2012). El mecanismo especfico de estos

compuestos no ha sido descrito completamente, pero lo anteriormente descrito se

acerca al posible mecanismo, atacando la membrana y la sntesis de ergosterol.

En hongos filamentosos como Aspergillus, la resistencia a azoles est

primariamente asociada a mutaciones de gen Cyp51A, mientras que la resistencia a

equinocandinas a mutaciones en el gen FKS1 (Pfaller et al., 2012). Lo anteriormente

descrito refuerza la misin de buscar nuevas molculas que presenten actividad

antifngica, o utilizar compuestos naturales combinados con las drogas antifngicas

conocidas hasta hoy, para evitar el aumento en la resistencia tal como se observa en

la resistencia a antibiticos.

La informacin obtenida en relacin con la composicin qumica de las especies

estudiadas es un aporte al conocimiento de la biodiversidad qumica de las especies

vegetales chilenas, as como a la actividad biolgica de sus metabolitos. El impacto

en la salud que provocan intoxicaciones con alimentos colonizados con especies

fngicas , provoca estragos en la poblacin, sin olvidar tambin las enfermedades

fngicas sistmicas debido al alto nmero de pacientes inmuno deprimidos a causa

de distintas enfermedades tales como el SIDA, cncer y otras enfermedad que

provocan inmunosupresin .

Una proyeccin que puede desarrollarse con nuestra investigacin, es que

podemos encontrar nuevas drogas a base de productos naturales extrados de

plantas nativas del sur de Chile, que pueden ser utilizados tanto en la industria
 61

agroalimentaria como en la medicina, an nos queda mucho camino por recorrer en

la investigacin de productos naturales, solo hemos vislumbrado una milsima parte

del potencial que representa nuestra flora nativa y la del mundo.

 62

7. Bibliografa

Ahmad, A.; Khan, A.; Khan, L.A.; Manzoor, N. (2010). In vitro synergy of eugenol and

methyleugenol with fluconazole against clinical Candida isolates. J. Med.Microbiol.,

59, 1178-1184.

Alexoupoulos CJ, Mims CW, Blackwell M.(1996). Introductory Mycology, 4 ed. John

Wiley & Sons., New York.

Alves TM. (2000). Biological Screening of Brazilian Medicinal Plants. Mem Inst

Oswaldo Cruz. 95., 367-373.

Avello Lorca Marcia, Carolina Lpez Canales, Carlos Gatica Valenzuela, Evelyn

Bustos Concha, Alejandra Brieva Chait, Dr. C. Edgar Pastene Navarrete, Dr. C.

Magalis Bittner Berner. (2012). Efectos antimicrobianos de extractos de plantas

chilenas de las familias Lauraceae y Atherospermataceae. R.C. de Plantas

Medicinales.17., 73-83.

Barrera LL & Garca L. (2008). Actividad antifngica de aceites esenciales y sus

compuestos sobre el crecimiento de Fusarium sp. aislado de papaya (Carica papaya).

R. UDO Agricola., 8, 33-41.

Barceloux, D.G. (2008). Medical Toxicology of Natural Substances. Foods, Fungi,

Medicinal Herbs, Plants and Venomous Animals. Wiley Hoboken, NJ, USA.

Bedoukian, P.Z. (1986). Perfumery and Flavouring Synthetics, 3rd ed. Allured

Publishing Corporation: Carol Stream, IL, USA.

Benedetti MS,Malno A, Broillet AL.(1977) Absorption, metabolism and excretion of

safrole in the rat and man.Toxycology., 2,69-83.

 63

Braga, P.C.; Sasso, M.D.; Culici, M.; Alfieri, M.(2007). Eugenol and thymol, alone or

in combination, induce morphological alterations in the envelope of Candida albicans.

Fitoterapia., 78, 396400.

Bittner M.(2009). Fungistatic antivity of essential oils extracted from Peumus boldus

mol., Laureliopsis philippiana (looser) schodde and Laurelia sempervirens ( ruiz y

pav.) tul. (Chilean Monimiaceae). Chilean J. of A. Research., 69, 30-37.

Burgess LW. Nelson PE, Tousson TA, Cook RJ. (1981). General ecology of the

Fusaria. In: Fusarium: disease, biology and taxonomy. Pennsylvania, State University

Press.

Campaniello D, Corbo MR, Sinigaglia M. (2010). Antifungal Activity of Eugenol against

Penicillium, Aspergillus, and Fusarium Species. J Food Prot., 73, 1124-1128.

Carneiro HA, Coleman JJ, Restrepo A, Mylonakis E. (2011). Fusarium infection in lung

transplant patients: report of 6 cases and review of the literature. Medicine (Baltimore).

2011, 90, 69-80.

Carlile, M.J., Watkinson, S.C. y Gooday, G. (2001). The Fungi. Academic Press,

Londres, Reino Unido.

Cbar Pinto, O. M.; Vsquez Mencos, A. A.; Torres Flores, j. a.(2005) Sntesis de

anlogos del medicamento anti-alzheimer ampakina cx 516 a partir de los productos

naturales Safrol y piperonal. Direccin General de Investigacin-Instituto de

Investigaciones Qumicas y Biolgicas Universidad de San Carlos de Guatemala.

Cohen BE. (1998). Amphotericin B toxicity and lethality: a tale of two channels. Int J

Pharm., 162, 95-106.

 64

Colombo AL, Nucci M, Park BJ, Nouer SA, Arthington-Skaggs B, Da Matta DA,

Warnock D, Morgan J.(2006). Brazilian Network Candidemia Study. Epidemiology of

Candidemia in Brazil: a nationwide sentinel surveillance of candidemia in eleven

medical centers. J Clin Microbiol., 44,2816-2823.

Cuenca-Estrella M, Gomez-Lopez A, Mellado E, Monzon A, Buitrago MJ, Rodriguez

Tudela JL.(2009). Analysis of the activity profile in vitro of micafungin against spanish

clinical isolates of common and emerging species of yeasts and moulds. Antimicrob

Agents Chemother.,53,182-192.

Da Matta DA, de Almeida LP, Machado AM, Azevedo AC, Kusano EJ, Travassos NF,

Salomo R, Colombo AL. (2007). Antifungal susceptibility of 1000 Candida

bloodstream isolates to 5 antifungal drugs: results of a multicenter study conducted in

So Paulo, Brazil, 1995-2003. Diagn Microbiol Infect Dis., 57,399-404.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. (2000). Atlas of Clinical Fungi.

Centraalbureau voor Schimmelcultures/Universitat Rovira Virgili, Reus, Spain.

Denning, D.W. (2006). Aspergillosis. Schering-Plough Corporation. Disponible en la

pagina web de

Aspergillus:http://www.aspergillus.org.uk/indexhome.htm?library.php~main.

Farooqi AA, Seeramu BS. (2001). Cultivation of medicinal and aromatic crops.

University Press New Delhi. pp 518.

Fehlbaum P, Bulet P, Michaut L, Lagueux M, Boekaert W, Hetru C, et al.(1994). Insect

bimmunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal

peptide with sequence homology to plant antifungal peptides. J Biol Chem.,

269,3315933163.
 65

Frisvad, J.C. y Samson, R.A. (2000). Neopetromyces gen. nov and an overview of

teleomorphs of Aspergillus subgenus Circumdati. Studies in Mycology., 10, 201-207.

Gavalda J, Ruiz I.(2003). [Guidelines for the treatment of invasive fungal infection.

Invasive fungal infection by Candida spp. Invasive Fungal Infection Study Group

(MICOMED) and Infection in Transplantation Study Group (GESITRA) of the Spanish

Society for Infectious Diseases and Clinical Microbiology (SEIMC)]. Enferm Infecc

Microbiol Clin., 21,498-508.

Geiser, D.M. (2008). Sexual structures in Aspergillus: morphology, importance and

genomics. Medical Mycology., 12, 1-6.

Gerson SL, Talbot GH, Hurwitz S, Strom BL, Lusk EJ, Cassileth PA.(1984). Prolonged

granulocytopenia: the major risk factors for invasive pulmonary aspergillosis in

patients with acute leukemia. Ann Intern Med., 100,345-351.

Godoy P, Tiraboschi IN, Severo LC, Bustamante B, Calvo B, Almeida LP, da Matta

DA, Colombo AL. (2003). Species distribution and antifungal susceptibility profile of

Candida spp. bloodstream isolates from Latin American hospitals. Mem Inst Oswaldo

Cruz., 98,401-405.

Guarro J, Gen J.(1995). Opportunistic Fusarial infections in humans. Eur J. Clin

Microbiol Infect Dis., 14,741-754.

Gurinder JK & Daljit SA. (2010). Bioactive potential of Anethum graveolens,

Foeniculum vulgare and Trachyspermum ammi belonging to the family Umbelliferae -

Current status. J. of M. Plants Research., 4, 87-94.

 66

Hjort, C.M. (2003). Genetically Engineered Food. Wiley, Wenheim, Alemania. Pags.

86-89.

Hoareau L. (1999). Medicinal plants: a re-emerging health aid. E J B., 2, 56-70.

Jun Tian Xiaoquan Ban, Hong Zeng, Jingsheng He, Bo Huang, Youwei Wang.(2011).

Chemical composition and antifungal activity of essential oil from Cicuta virosa L. var.

latisecta . Celak. Int J Food Microbiol., 145,464-470.

Kamatou Guy P., Ilze Vermaak and Alvaro M. Viljoen.(2012). Eugenol From the

Remote Maluku Islands to the International Market Place: A Review of a Remarkable

and Versatile Molecule. Molecules., 17, 6953-6981.

Kozakiewicz Z. 1989. Aspergillus species on stored products. CAB International

Mycological Institute, Kew, Surrey.

Khan, M.S.A.; Malik, A.; Ahmad, I. (2012). Anti-candidal activity of essential oils alone

and in combination with amphotericin B or fluconazole against multi-drug resistant

isolates of Candida albicans. Med. Mycol., 50, 3342.

Kradin, R.L. y Mark, E.J. (2008). The pathology of pulmonary disorders due to

Aspergillus spp. Archives of Pathology & Laboratory Medicine., 132, 606-614.

Kwon-Chung KJ, Bennett JE. (1992). Medical Mycology. Philadelphia: ed Lea &

Febiger 1992.

Lacaz CS. In: Lacaz CS, Porto C, Martins JEC. (1998). Guia para Identificao.

Fungos Actinomicetos e Algas, So Paulo, Sarvier.

Lewis RE, Wiederhold NP, and Klepser ME. (2005). In vitro pharmacodynamics of

amphotericin B, itraconazole, and voriconazole against Aspergillus, Fusarium, and

Scedosporium spp. Antimicrob. Agents Chemother., 49,945-951.

 67

Link, J.H.F. (1809). Observationes in Ordines plantarum naturales. Gesellschaft fur

Natur (Berlin). 3, 1-42.

Liu JY, Chen WT, Ko BS, Yao M, Hsueh PR, Hsiao CH, Kuo YM, Chen YC.(2011).

Combination antifungal therapy for disseminated fusariosis in immunocompromised

patients : a case report and literature review. Med Mycol., 49,872-878.

Mayayo e, i. Pujol and j. Guarro. (1999). Experimental pathogenicity of four opportunist

Fusariurn species in a murine model. J. Med. Microbiol., 48, 363-366.

Mayer AC, Emmert G(1815). Verschimmelung in lebende Korper. Deustsch Arch Anat

Physiol., 1: 310.

Miao, J.Y.; Zhao, B.X.; Li, H.H.; Zhang, S.L.; Du, C.Q.(2002). Effect of safrole oxide

on vascular endothelial cell growth and apoptosis induced by deprivation of fibroblast

growth factor. Acta Pharmacol. Sin., 23, 323-326.

Micheli P.A. (1729). Nova plantarum genera juxta Tournefortii methodum disposita.

Florencia,Italia.

Mills JY.(1989). Ecology of Mycotoxigenic Fusarium species on cereal seeds. J Food

Potec., 52,737-42.

Montenegro I. (2006). Estudio preliminar de molculas bioactivas. Tesis de pregrado

escuela de bioqumica, Facultad de Ciencias, Univ. Austral de chile.176pp.

Montanari C A, Vanderlan da S.(2001). Planejamento racional de frmacos baseado

em produtos naturais. Qum Nova., 24, 105-111.

Mousa HAL, Al-Bader SM, Hassan DA. (1999). Correlation between fungi isolated

from burn wound and burn care units. Burns., 25,145-147.

 68

Nelson PE, Dignani MC, Anaissie EJ. (1994). Taxonomy, biology and clinical aspects

of Fusarium species. Clin Microbiol Rev., 7,479-504.

Nucci M, Anaissie E.(2007). Fusarium infections in immunocompromised patients.

Clin Microbiol Rev., 20,695-704.

Oelofse, D., Dubery, I.A., Meyer, R., Arendse, M.S., Gazendam, I. y Berger, D.K.

(2006). Apple polygalacturonase inhibiting protein1 expressed in transgenic tobacco

inhibits polygalacturonases from fungal pathogens of apple and the anthracnose

pathogen of lupins. Phytochemistry., 67, 255-263

Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin Jr DK, Calandra TF, Edwards Jr JE.

(2009). Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update

by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis., 48,50335.

Perrone, G., Susca, A., Cozzi, G., Ehrlich, K., Varga, J., Frisvad, J.C., Meijer, M.,

Noonim, P., Mahakarnchanakul, W. y Samson, R.A. (2007). Biodiversity of Aspergillus

species in some important agricultural products. Studies in Micology., 59, 53-66.

Peterson SW et al. (2000). Genetic variation and aflatoxin production in Aspergillus

tamarii and A. caelatus: Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and

Aspergillus Classification. Samson RA, Pitt JI, editores. Harwood Academic

Publishers, Australia. pp. 447-458.

Pfaller MA. (2012). Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and

consequences for treatment. Am J Med., 125, 3-13.

 69

Philipson, W.R. (1993). Monimiaceae.. En: Kubitzki, K., Rohwer, J.G. & Bittrich, V.

(Editores). The Families and Genera of Vascular Plants. II. Flowering Plants -

Dicotyledons.. Springer-Verlag: Berln.

Pinto E, Vale-Silva L, Cavaleiro C, Salgueiro L. (2009). Antifungal activity of theclove

essential oil from Syzygium aromaticum on Candida, Aspergillus and dermatophyte

species. J Med Microbiol., 58,1454-1462.

Pointing, S.B. y Hyde, K.D. (2001). Bio-exploitation of Filamentous Fungi. Fungal

Diversity Press, Hong Kong. Pags. 223-251.

Ros JL, Recio MC. (2005). Medicinal plants and antimicrobial activity. J

Ethnopharmacol., 100, 80-84.

Rotstein C, Cummings KM, Tidings J, Killion K, Powell E, Gustafson TL, Higby

D.(1985). An outbreak of invasive aspergillosis among allogenic bone marrow

transplants: a case control study. Infect Control., 6,347-355.

Rogers TR, Frost S. (2009). Newer antifungal agents for invasive fungal infections in

patients with haematological malignancy. Br J Haematol.,144,629641.

Saito M L.(1990). Estudo da atividade inseticida de algumas especies vegetais.

embrapa- cnpma.,1,23-30.

Sanglard D, Ischer F, Parkinson T, Falconer D, Bille J.(2003). Candida albicans

mutations in the ergosterol biosynthetic pathway and resistance to several antifungal

agents. Antimicrob Agents Chemother., 47,2404-2412.

Seifert, K.A. y Gams, W. (2001). The taxonomy of anamorphic fungi. En: The Mycota.

Systematics and evolution Part A. Springer-Verlag, Berlin, Alemania. Pags. 307-347

 70

Silver L L, Bostian K A.(1993). discovery and development of new antibiotics: the

problem of antibiotic resistance.A.A and Chemotherapy., 37, 377-383.

Singh G, Maurya S, Catalan C, De Lampasona MP. (2004). Chemical constituents,

antifungal and antioxidative effects of Foeniculum vulgare essential oil and its acetone

extract. J Agric Food Chem., 52, 3292-3296.

Soliman KM, Badeaa RI.(2002). Effect of oil extracted from some medicinal plants on

different mycotoxigenic fungi. Food Chem Toxicol., 40,1669-1675.

Subramanian, C.V. (1972). The perfect states of Aspergillus. Current Science., 41,

755-761.

Sluyter Theodor (1817-1895) from Greifswald published his thesis in Berlin including

the first well-documented case of human pulmonary aspergillosis.

Tvora LGF, Gambale W, Heins-Vaccari EM, Arriagada GLH, Lacaz CS, Santos CR,

Levin AS.(2003). Comparative performance of two air samplers for monitoring

airborne fungal propagules. Braz J Med Biol Res., 36,613-616.

Vanden Bossche, H. (1988). Aspergillus and Aspergillosis. Hardback, Nueva York,

EEUU. Pag.23.

Velluti A, Sanchis V, Ramos AJ, Egido J, Marin S.(2003). Inhibitory effect of cinnamon,

clove, lemongrass, oregano and palmarose essential oils on growth and fumonisin B1

production by Fusarium proliferatum in maize grain. Int J Food Microbiol., 89,145-154.

Van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-

Ossenkopp YJ, Kuijper EJ, Van Tiel FH, Melchers WJ, Verweij PE.(2011). Clinical
 71

Implications of Azole Resistance in Aspergillus fumigatus, the Netherlands, 2007-

2009. Emerg Infect Dis., 17,1846-1854.

Vonberg, R.P. y Gastmeier, P. (2006). Nosocomial aspergillosis in outbreak settings.

T. J. of H. Infection, 63, 246-254.

Webster D, Taschereau P, Belland RJ, Sand C, Rennie RP. (2008). Antifungal activity

of medicinal plant extracts; preliminary screening studies. J Ethnopharmacol.,

115,140-146.

Wosten, H.A.B., Scholtmeijer, K. y de Vries, R.P. (2007). Hyperproduction of enzymes

by fungi. En: Food Mycology. A multifaceted approach to fungi and food. CRC Press,

Boca Raton, Florida, EEUU. Pags. 183196.

Wosten, H.A.B., Scholtmeijer, K. y de Vries, R.P. (2007). Hyperproduction of enzymes

by fungi. En: Food Mycology. A multifaceted approach to fungi and food. CRC Press,

Boca Raton, Florida, EEUU. Pags. 183196.

Yunes R A, Pedrosa R C, Filho C.(2001). Frmacos e fitoterpicos: a necessidade do

desenvolvimento da indstria de fitoterpicos e fitofrmacos no Brasil. Qum. Nova.,

24,147-152.

Zhang X.(2002). Estrategia de la OMS sobre Medicina Tradicional. Genebra:

Organizao Mundial da Sade.

Zhao, J.; Zhao, B.; Miao, J.; Zhang, S.; Yin, D.(2005). Safrole Oxide Inhibits

Angiogenesis by Inducing Apoptosis. Vasc. Pharmacol., 43, 69-74.