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DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
AREQUIPA-PER-2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTN DE AREQUIPA
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
AREQUIPA-PER-2017
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PROLOGO
Los Autores
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NDICE
PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES ................................................................................................... 6
PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7
PRCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRCTICA 3 : PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIN ............................................................................................ 31
PRCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRCTICA 7 : CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS........................................................................................................ 57
PRCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRCTICA 11 : OBTENCIN DE CIDO ALGNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS DE
INTERS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRCTICA 14 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS ............ 83
PRCTICA 15 : MTODO PARA LA DETERMINACIN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y escherichia coli POR LA
TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MLTIPLE (NMERO MS
PROBABLE O NMP) ............................................................................................... 86
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Recomendaciones Generales
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PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biolgicos fsicos, psicolgicos y mecnicos.
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2. La piel
Cortaduras o rasguos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados
(lpices, bolgrafos, etc.).
3. Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolucin de un microscopio est en relacin inversa a la longitud de onda
de la luz usada.
1. Parte mecnica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revlver
- Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido
- Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales
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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo
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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
IV. CUESTIONARIO
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
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PRCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe
nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su examen microscpico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin.
La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observacin, mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
Material
- Microscopio
- Lminas cubreobjetos
- Lminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodologa
- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca una gota de lquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una gota de suero
fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensin y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
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Grafique la Observacin y Resultados
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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como tcnicas
intermedias entre stas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teidas.
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o slida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
clulas eucariticas. As, el citoplasma de las procariticas est rodeado por una membrana
plasmtica y una pared celular (como en las clulas vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, ncleo diferenciado. Las molculas de ADN estn en contacto directo con el
citoplasma. Adems carecen de mitocondrias, retculo endoplasmtico, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las clulas procariticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, s contienen numerosas membranas llamadas
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tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintticos que utilizan para captar la energa
de la luz solar y sintetizar azcares (fotosntesis).
Materiales:
Muestra biolgicca: Nosstoc (murmunta hidratada)
Procedimiento Experimental
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V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
I. OBJETIVOS
- Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin.
- Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasto posee un ndice
de refraccin cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y difieren uno de otro en
cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por
otras molculas. Algunos de los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de radicales cromforos del
compuesto.
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las
clulas de cultivo antiguo.
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GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antgeno o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075 m.
Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son:
c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo ms prximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de
los microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas protoplsmicas. Existe un gran
nmero de fijadores, tanto en forma simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales
de fijacin son: por el calor y alcohol en fro.
a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o Bsico, trmino que no
ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, si una parte de la molcula es aninica o
catinica.
Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear
de las clulas. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas, tales como estructuras
citoplsmaticas, y como colorante de contraste. Ej: cido pcrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante cido con uno bsico. Ej: Wright,
Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudn III.
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfologa
y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin azul de metileno, Tincin fucsina.
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b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
caractersticas de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram,
Tincin cido-alcohol resistente.
- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente
arriba de la porcin azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como
sea posible. Djela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posicin plana
en la superficie del lquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el centro de ste (el
portaobjeto deber estar numerado).
- Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala trazando una espiral del
centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados
del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que
se encuentren en ella.
Fijacin
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
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- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.
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TINCIN DE SAFRANINA
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.
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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin de Gram, Asas de platino,
Grmenes diferentes, Aceite de inmersin.
TINCIN GRAM
El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solucin dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido
a su naturaleza qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta,
an luego del tratamiento con un decolorante orgnico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en su pared celular, pierden
la coloracin primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante
secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han
perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.
Reactivos
- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95 = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lmina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tincin.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de cao.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos ms o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de cao.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.
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1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas conidiales, Morfologa de los
conidiforos, filides y metulas, y en la presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente
figura se muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:
B. APLICACIONES INDUSTRIALES
INVERTASA O SACARASA.
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Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo
ocurre en la interfase entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remocin de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica
ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logr producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin
de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjol, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
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La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor
aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y generalmente el gnero ms
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia comn de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construccin, entre los que resaltan el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada
para su adhesin a las paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las reas urbanas
que en las rurales).
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehculo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rpida. En ciertas especies son patgeno de
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la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la produccin del tempeh, un alimento fermentado
derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los
zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.
EL GNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.
EL GNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios de cultivo. En este Gnero
los esporangiforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de cidos lctico, ctrico,
succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica o
filamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios lquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos
azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados
en la hidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en sntesis
lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin de
amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir
etanol, pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentacin alcohlica, en cambio, en los ltimos aos se
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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
A. MATERIAL
B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
2. CULTIVOS
A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a
infecciones dermatolgicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que
pueden estar presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
C. PREPARACION
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I. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
B. ASPERGILLUS FUMIGATUS
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C. ASPEGILLUS FLAVUS
D. PENICILLIUM
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a. RHYZOPUS
b. MUCOR
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V. CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y
equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.
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a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran
hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm3 sobre
la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de
cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica,
como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.
a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.
Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica cilndrica.
Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de agua).
Orificios superiores para purga de gases de combustin.
Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.
Canastilla para colocar el material a esterilizar.
Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de algodn
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente:
- De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono
truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparacin.
El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.
34
V. CUESTIONARIO
2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiolgico, por qu?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
35
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de cultivo.
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo.
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o
disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.
Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hecho que es caracterstico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un gran
nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas
an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o
polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que
estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin
es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
36
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos
grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio,
aminocidos, etc.
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin
pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn tipo
de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
37
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas
bioqumicas de las bacterias.
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.
38
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier
mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la
fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica utilizando la
bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los lmites fisiolgicos.
Lmite Lmite
Microorganismo pH ptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es
debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).
39
1.00 (agua pura) Sangre Mayora de Gramnegativos
no halfilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamn Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada
E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia
y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y segn criterios se podran dividir en:
A. MEDIOS SLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y
visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios
especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.
B. MEDIOS LQUIDOS
Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de recuentos
bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidos
lcticos, etc.
40
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISLIDOS
Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son tiles
para algunas pruebas bioqumicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.
41
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.
d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .
4.1. PREPARACIN
- Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus
incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al
conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolucin.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121C.
42
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la
posicin deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
o En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de
conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservacin
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.
AGAR NUTRITIVO
Composicin
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
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Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composicin
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
45
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
V. CUESTIONARIO
1. Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados,
Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?
4. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
5. A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.
6. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y
clasifique en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrfilos.
Psicrtrofos, mesfilos, termfilos, Hipertermfilos?
10. Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
11. Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos.
12. Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen?
13. Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3 y qu sustancias se le
agregan para que cumpla esa funcin?
14. Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos?
46
16. Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene la consistencia del agar
blando?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
47
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I. OBJETIVOS
Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en
condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados
para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en
condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al
ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias
separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales, la
morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede
ser lquido o slido.
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta
y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco bastante
cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir muchas asas son
calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las ms utilizadas son las de
0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para extender el
inculo lquido previamente adicionado en la placa, a travs de una pipeta pasteur. Se esteriliza
en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la
llama hasta agotar el alcohol del asa.
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecacin,
deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el medio de
cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
49
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por
esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores para pipeta tipo
pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volmenes graduados son muy utilizados en
bacteriologa y cuya aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio
de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se homogenizar
y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patgenos
coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer aproximadamente 24 horas. En
ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de un rotavapor para que el crecimiento
se establezca por igual en todo el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin
posterior y de la cantidad de inculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de cultivo slido, se
utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra por
agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido,
se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C
por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre jvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un medio slido,
se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose
a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin cultivos jvenes.
Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo de cultivo
base.
50
A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de microorganismos
problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios lquidos y el nmero de
microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos con
diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una
batera de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato
brico. Cada tubo corresponder a una determinada concentracin de microorganismos.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estras.
- Siembra por difusin.
- Siembra por diseminacin.
- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho inculo se
depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo
en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos
el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde qued
la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de
platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma direccin se repite la
51
operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el
interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada vez que se
va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para separar estas colonias se
realice en cada estra un flameado previo del asa de siembra.
52
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una
temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de inculo que oscila
entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar solidificar, la
mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este
caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de CMI
(concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos.
53
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA
Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a
cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato
entre otras.
La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo de dilucin.
El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se
inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las clulas
individuales queden separadas una de otras. Cada clula aislada crece ahora para formar una
colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las clulas que componen la colonia
son la progenie de una nica clula original.
Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para mantener la
esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome
prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las soluciones
con microorganismos no deseados.
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III. MATERIALES Y EQUIPOS
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V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS
I. OBJETIVOS
GENERALIDADES:
Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura, tamao, consistencia,
cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados segn el
tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios slidos y lquidos.
Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao generalmente es visible a
simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie
como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color caractersticos, que
aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas
y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo
de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.
Sin embargo, adems de stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades
inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula individual pero es
la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia, pero
no en la clula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la
sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde
colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
57
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos
mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concntricas
o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las que las colonias
aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos uno de los pigmentados
ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia
en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy pequeos para verse con luz
transmitida.
58
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CARACTERSTICAS PTICAS
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Luz
transmitida
Luz reflejada
MEDIO SEMISLIDO
60
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y
envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una caracterstica
de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de hidratos de carbono?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
61
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I. INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que
incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras
que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos procedimientos se
puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o
difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de
clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz
transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo
el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana
es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.
Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz transmitida
(transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es
directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente manera:
Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso de
matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar
muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.
II. OBJETIVOS
El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo
requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre los
microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren
de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das.
62
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha
crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por minuto
peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta
curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran
desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados
hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y
las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a
velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos
txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin.
4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el
microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta
alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinacin
Adaptacin Divisn celular Acumulan metabolitos txicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos
Turbidez 0,75
viables/ml
Densidad ptica
8,0 Viables (densidad ptica)
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0 0,1
Tiempo
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubacin a 37C
- Microscopio
- Espectrofotmetro
63
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un
matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento:
una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las
clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido
transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rpido.
La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del
inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la
aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase de
crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las clulas crecen rpidamente,
y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora de las clulas se
hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante la fase log
depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un
crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de
generacin).
Realizacin (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de
esterilidad en las proximidades del mechero.)
1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3
mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz
con 50 ml de Caldo nutritivo prparado por componentes, estril.
3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540
nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo
Caldo Nutritivo estril antes de cada medida.
5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en
refrigeracin hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de
abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
64
VII. CUESTIONARIO:
65
VIII. OBSERVACIONES
IX. CONCLUSIONES
66
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS
I. OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de contaje celular.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente
simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el Cell Coulter.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos
basta con una cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer, y un microscopio. Una
cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a
medir. El dispositivo presente unas seales que determina un volumen conocido (x microlitros).
Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se pueden
determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen.
Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas,
la concentracin en la suspensin celular ser:
67
Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado.
Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar la cantidad de
clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas.
2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas
clulas.
3) La precisin es difcil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teido la muestra.
5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja densidad. En el asa de bacterias,
en una suspensin de clulas con menos de 106 clulas por mililitro, se podran ver pocas o
ninguna bacteria.
IV. METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea cantidad de suspensin con
una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequea en la superficie pulida de la cmara de
recuento cerca del extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por capilaridad.
Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas solo en el espacio contenido entre el
cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.
V. CUESTIONARIO
68
1.- Investigue las caractersticas de:
Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje celular, Otros mtodos de
recuento celular
2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales.
3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
69
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA
I. OBJETIVOS
Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inculo.
II. INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de colonias, la tcnica por
vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles,
se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la
dilucin que corresponda permite estimar el nmero de microorganismos viable por gramo o mL de
muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y tipo
de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado grupo de microorganismos. Esta
tcnica permite la mayora de las veces cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.
70
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tincin de Gram, Cajas
Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGA
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
71
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la preparacin y dilucin de muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45C, mezclar
rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilucin utilizada. Reportar
el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, segn el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300,
tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y
establecer la relacin de los dos recuentos
V. RESULTADOS
VI. CUESTIONARIO
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
72
PRCTICA
OBTENCIN DE CIDO ALGNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia trabeculata
I. OBJETIVO
Aplicar tcnicas de extraccin de cido alguinio a partir de algas.
Aplicar tcnicas de purificacin de cido alguinio a partir de algas.
II. INTRODUCCIN.
Existen variedades de algas pardas que producen cido algnico, que es la base para producir alginato de Sodio,
Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata, crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.
En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales como: Macrocystis pyrifera,
sargazos Lessonia trabeculata (aracanto, palo) y Lessonia nigrescens (aracanto negra), en ambientes
inter y submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la extraccin, y b)
mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen disposiciones normativas, que en resumen, en la
actualidad, prohben la actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N 839- 2008-
PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas varadas (RM N 264-2009-
PRODUCE).
En las algas pardas, el cido algnico es uno de los principales constituyentes de las paredes celulares,
casi siempre se encuentra con otros polisacridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%),
diferencindose de estas dos ltimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse asociado con
varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El cido algnico es un polisacrido, de frmula general: (C6H8O6)n,
donde n se repite de 80 a 83 veces., y compuesto de cido manurnico y cido gulurnico unidos con
enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+
73
Fig Molculas constitutivas del cido algnico.
El cido algnico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio inico, formndose alginato
de sodio, que es soluble y de fcil extraccin.
Al cido algnico y los alginatos son bastante higroscpicos y un secado completo es muy lento, presentando
una humedad de un 15-25%.
La viscosidad de una solucin de alginato es una propiedad que depende o deriva de su peso molecular del
polisacrido, y de la relacin de cido manurnico a cido gulurnico (M/G).
Material de Laboratorio:
Termmetro, vasos de precipitacin, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas, pH-metro, papeles filtrantes,
pipetas, embudos, etc.
Reactivos:
cido clorhdrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol, etc.
Equipos:
Potencimetro, balanza analtica, estufa graduada para baja temperatura.
1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un baln de vidrio de 2 litros, con suficiente
cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento
de los tallos, el lavado se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los lquidos no den
precipitado con solucin diluida de nitrato de plata.
2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solucin 0,2 N de HCl, los cuales terminan
cuando el lquido del lavado no da turbidez con etanol.
As se transforman los alginatos en cido algnico (insoluble).
MCl HAlg HCl MAlg.
3.- Luego se corta la muestra en pequeos trozos, se agrega agua y se calienta hasta 45 C por unos 10
minutos.
5.- Las muestras lavadas se tratan con una solucin de Na2CO3 al 10% en peso (ajustando el pH a 9-10),
se calienta hasta 70 C agitando continuamente, luego dejar en reposo por varias horas, conviene dejarlo
hasta el da siguiente, de tal modo que se macere. Durante la maceracin, el cido algnico se somete a un
tratamiento alcalino para solubilizar el extracto como alginato de sodio, como resultado, la solucin
presentar un aspecto lechoso parduzco y viscoso.
6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na2CO3 al 2% a 70 C por 10 minutos, se filtra y el filtrado
se agrega a la solucin anterior y, si es necesario, se vuelve a filtrar.
7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro. Para blanquearlo o
decolorarlo se agrega una solucin de hipoclorito de sodio al 5.25% en la proporcin de 1/10 del
volumen de los filtrados resultantes que contiene el vaso de precipitado y se deja actuar por unos 10
minutos.
8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se determina el pH inicial, luego se acidifica con
HCl concentrado, agregando de 10 en 10 ml , midiendo su pH hasta llegar a pH=2:
74
Se observa la formacin de una gran masa de precipitacin blanquecina, que se deposita en el fondo del
recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de tocuyo blanco, lavando el filtrado con cido clorhdrico
diluido.
9.- La purificacin consiste en cambiar de fase el compuesto de inters para eliminar con la otra fase los
contaminantes, en este caso se precipitar con cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes,
en su gran mayora, en las aguas sobrenadantes.
2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl
10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza mediante un lavado con
NaClO. El alginato de calcio es de inters comercial obtenido en forma purificada, a partir de l pueden
obtenerse los restantes.
A continuacin el alginato de Calcio se acidifica con cido clorhdrico al 5%, 11.- para transformarse en
cido algnico, como se muestra en la siguiente reaccin:
CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl
12.- El cido algnico se escurre y se seca en estufa de vaco a 50C hasta peso constante, por unas 5
horas, se enfra y se pesa.
El ltimo producto buscado es el alginato de sodio el que se consigue desde la solucin cida de cido
algnico por alcalinizacin con NaOH 5 N, como este alginato es soluble en agua se seca en estufa de
vaco a 50C hasta peso constante.
HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O
V. CUESTIONARIO
VI. RESULTADOS
75
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
76
PRCTICA
AISLAMIENTO Y SELECCIN DE
MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL
I. OBJETIVOS
Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtencin de metabolitos
de inters industrial.
Aplicar tcnicas de purificacin de microorganismos aprendidas previamente en microbiologa general.
Las reas de aplicacin de la microbiologa industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y
el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiologa industrial en el mantenimiento de la
salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicacin en la produccin de
compuestos de actividad farmacolgica y de vacunas.
En la industria de alimentos es tambin significativa la aplicacin de la microbiologa industrial, en la
produccin de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lcteos y muchas otras aplicaciones.
La produccin agropecuaria se ve tambin favorecida en sus aspectos de produccin vegetal y animal,
por un conjunto variado de procesos microbiolgicos.
El rea de aplicacin en minera est relacionada con la biolixiviacin, o sea, con la aplicacin de
microorganismos en la extraccin de metales de minerales de baja ley.
Finalmente, el rea de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicacin de microorganismos en la
purificacin de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado,
para la eleccin del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a continuacin:
77
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. En el mbito industrial, en general, cada firma posee su
propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de tcnicas clsicas
de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la industria que
las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de organismos
modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis, degradacin o
biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos
aislados o modificados no est disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la eleccin
del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las
propiedades que son de inters.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podran encontrar organismos adaptados a la
degradacin de estos productos qumicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el mismo;
en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre
tratamiento de la muestra.
Materiales y Reactivos
Asa.
Hisopos estriles.
Bolsas plsticas 1 l.
Cuchillo.
Caja Petri con agar nutritivo.
Caja Petri con agar papa dextrosa.
Caja Petri con agar YPD con 10 % de
Aceite de oliva.
Incubadora.
Mechero.
Balanza.
78
3. Incubar las cajas de APD a 30 C y de AN a 37 C.
Procedimiento para identificar los microorganismos de inters industrial
Dependiendo del uso que se est buscando para los microorganismos y la industria donde se emplearn,
ser el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarn levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularn
diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observar un halo transparente, resultado de
la actividad lipasa positiva.
2. Tambin en el queso se buscarn bacterias del genero Lactobacillus cido-lcticas, con potencial
para ser utilizadas para la preparacin de yogur. Se efectuarn las pruebas bioqumicas
pertinentes para su identificacin.
3. En la pia se buscarn hongos del gnero Aspergillus, productoras de cido actico, as como
bacterias cido-acticas para la produccin de vinagre. La identificacin del hongo se har
con base en sus caractersticas macroscpicas y microscpicas, y para las bacterias se harn
pruebas bioqumicas.
4. Con la tierra se seguir el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya
sea hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarn con base en sus
caractersticas macroscpicas y microscpicas; para las bacterias, se harn pruebas
bioqumicas. En el caso de las levaduras, se observarn las caractersticas morfolgicas de las
colonias y un frotis en fresco al microscopio.
IV. CUESTIONARIO
79
V. RESULTADOS
Queso
Pia
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
80
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I. OBJETIVO
La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta
a travs de los pelos radicales para que en la matriz de las clulas corticales induzca una meiosis y
mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de la
leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un
bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio,
que luego transfiere al ribosoma vegetal para la sntesis de protenas vegetales; simultneamente
por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirn como fuente de
carbono y energa para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicacin de fertilizantes
qumicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen
el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de produccin y la
contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.
81
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Material Biolgico
- Races de alfalfa con ndulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bistur
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGA
82
V. CUESTIONARIO
- Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium.
- Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium.
- Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
83
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I. FUNDAMENTO TEORICO
La deteccin y cuantificacin de todos los microorganismos patognicos potencialmente presentes en el agua demanda tiempo,
los costos son elevados y no siempre se obtienen resultados positivos o que confirmen la presencia de los microorganismos.
El objetivo de la prueba microbiolgica del agua es proveer subsidio acerca de su potabilidad, es decir, ausencia de riesgo de
ingestin de microorganismos causadores de enfermedades, mayormente provenientes de la contaminacin por excrementos
humanos y de otros animales de sangre caliente. Vale resaltar que los microorganismos presentes en aguas naturales son, en
su mayora, inofensivos a la salud humana. Pero en la contaminacin por desecho sanitario estn presentes microorganismos
que podrn perjudicar la salud humana. Los microorganismos patognicos incluyen virus, bacterias, protozoarios y
helmintos.
El agua potable no debe contener microorganismos patognicos y debe estar libre de bacterias
indicadoras de contaminacin fecal. Como indicadores de contaminacin fecal, las bacterias de referencia
elegidas son las del grupo coliforme. El principal representante de ese grupo de bacterias es llamado
Escherichia coli. Ese grupo de bacterias ha sido elegido como indicador de contaminacin del agua
debido a los siguientes factores:
a. Estn presentes en el excremento de animales de sangre caliente, incluso de los seres humanos;
d. El tiempo de sobrevivencia en el agua es mayor que las bacterias patognicas intestinales, por
ser menos exigentes en trminos nutricionales, adems de ser incapaces de multiplicarse en
ambiente acutico o multiplicarse menos que las bacterias entricas; y. Son ms resistentes a
los agentes tensoactivos y agentes desinfectantes que a las bacterias patognicas.
En este grupo se incluyen cuatro gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella, adems de
algunas cepas de Serratia (ver Tabla ).
84
Tabla . Caractersticas del grupo coliforme
Gas glucosa + + + +
Lactosa + + + d
Indol + d - -
Rojo metilo + - - +
Voges-Proskauer - + + -
Citrato - + + +
Urea - + +/- d
Movilidad +/- - + +
d= dudoso
El hbitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque tambin se
pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). As, su
procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. Los coliformes son resistentes a condiciones
medioambientales adversas, soportan la desecacin, pero no condiciones de congelacin o refrigeracin.
Esta ltima caracterstica hace que su investigacin en alimentos congelados no tenga ninguna relevancia.
Solamente son tiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de productos terminados o
indicativos de la fase de conservacin y almacenamiento.
En el grupo coliforme destacan por su mayor significacin sanitaria los coliformes fecales,
entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46C (habitualmente 44,5 o 45,5C)
con produccin de cido y gas a partir de lactosa.
Escherichia coli bacteria del grupo coliforme que fermenta la lactosa y manitol, con produccin de
cido y gas a 44,5 0,2oC en 24 horas, produce indo a partir del triptfano, oxidase negativa, no hidroliza
85
la urea y presenta actividad de las enzimas galactosa y glucuronidase, que es considerado el ms
especfico indicador de contaminacin fecal reciente y de eventual presencia de organismos patognicos.
El origen fecal de la E. coli es incuestionable y su naturaleza ubicua poco probable, lo que valida su papel
ms especfico de organismo indicador de contaminacin, tanto en aguas naturales como tratadas.
El Recuento Estndar de Bacterias es muy importante durante el proceso de tratamiento del agua, ya que
permite evaluar la eficiencia de varias etapas del tratamiento. Es importante tambin conocer la densidad
de bacterias, haya visto que un aumento considerable de la poblacin bacteriana puede comprometer la
deteccin de organismos coliformes. Aunque la mayora de esas bacterias no sea patognica, puede
representar riscos a la salud, como tambin, deteriorar la calidad del agua, provocando olores y sabores
desagradables.
II. PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la presencia y
cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en
solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a continuacin:
1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5,
10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C durante la noche en posicin
invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de
dilucin correspondientes.
86
3) Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-
5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este
medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las
colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el
amarillo (una buena forma de detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan
colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de
urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da
negativo para ambas actividades. En TSI nicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer
con precipitados negros (por produccin de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto
de los caracteres siguientes:
III. RESULTADOS
IV. OBSERVACIONES
V. CONCLUSIONES
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PRCTICA
MTODO PARA LA DETERMINACIN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA
COLI POR LA TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO
MLTIPLE (NMERO MS PROBABLE O NMP)
I. OBJETIVO
II. GENERALIDADES
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como
vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador
de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben
tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se
observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la
probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo
que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En
productos alimenticios que han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin,
etc.), se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso
mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a
88
44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es
Escherichia coli.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y
animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas.
Estas
E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada
grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las clulas
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De
manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterohemorrgica
(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa
(DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del
viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy
frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil
de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera,
la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de
resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.
La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en
ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias,
por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja.
Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del
intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas
mucosas. La infeccin
Por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque ocasiones puede ser crnica.
Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que codificada por el gen eae y
un factor de adherencia que es codificado por plsmido, ambas protenas permite su unin a los
enterocitos y la destruccin las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y
productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106
microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli
los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones
del antgeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente
relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se
presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos
lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC
la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas caractersticas importantes de este
89
microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como
fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon
debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto
citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al
menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una
variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir
insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene
muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae
tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que
puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es
negativa a la prueba de MUG.
La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y
sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de Escherichia coli
antes descritas.
III. FUNDAMENTO
Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o
hielo, consultar el cuadro 1.
1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatosa
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de
fosfatosa
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentracin sencilla o
caldo lactosado concentracin sencilla con campana de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.
cajas Petri con agar para mtodos estndard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere
91
V. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd
NOTAS
Material necesario al inicio de la prctica.
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96
h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica
92
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
93
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS
94
VII. PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con
caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. tubos para homogeneizar la muestra.
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formacin de
gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas,
incubar 24 h. ms.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro
tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h..
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes
totales/100 mL.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril
sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
95
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes
fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter
aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estra cruzada en
agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro
negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms
colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las
pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas.
Incubar las placas a 35C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o
cocobacilos Gram-negativos.
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar turbiedad en el
tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
Incubar a 35C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva.
NOTAS
96
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM.
Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el reactivo de
Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono, tambin se puede
utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de
flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador
que contiene el medio, indica prueba positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-
umbeliferil- -D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la
enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico 4-metilumbeliferil-beta-D-
glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz
ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fcil de observar. Cuando
el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de gas , tomar
una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de gas; si no
se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae
como control negativo.
2. Alimentos
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estriles y mezclar.
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3
minutos.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con
muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2y 5 C.
Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio.
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo
lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35-37C durante 24-48 h.
Los tubos despus de la incubacin, se registrarn como positivos si presentan crecimiento y
produccin de gas.
97
2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro
tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas,
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el nmero ms
probable de organismos coliformes totales por mL.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo
lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin de gas
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes fecales por mL.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados
positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que
demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas fermentadoras
de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares.
Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias.
Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.
98
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS
Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volmenes de
20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes
tablas:
TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.
99
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS
USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS
101
BIBLIOGRAFA
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103