Tesis Laura Muñoz

Programa de Doctorado en Sealizacin Celular
HORMONA LIBERADORA DE LA
HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y
SUS ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIN
DEL CNCER DE PRSTATA
Tesis Doctoral presentada por
LAURA MUOZ MORENO
2014
Programa de Doctorado en Sealizacin Celular
HORMONA LIBERADORA DE LA
HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y
SUS ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIN
DEL CNCER DE PRSTATA
Tesis Doctoral presentada por
LAURA MUOZ MORENO
Directoras:
DRA. ANA MARA BAJO CHUECA
DRA. MARA JOS CARMENA SIERRA
Alcal de Henares, 2014

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA DE
SISTEMAS.
Facultad de Medicina
Campus Universitario.
28871 Alcal de Henares (Madrid)
Telfonos: 91 885 45 77 Fax: 91 885 45 85
ANA MARA BAJO CHUECA y MARA JOS CARMENA SIERRA

Profesora Titular y Catedrtica del Departamento de Biologa de Sistemas de la
Universidad de Alcal,
INFORMAN:
Que el trabajo presentado por Laura Muoz Moreno, titulado HORMONA

LIBERADORA DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y SUS
ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIN DEL CNCER DE
PRSTATA, ha sido realizado en el Departamento de Biologa de Sistemas de
la Universidad de Alcal bajo su direccin y, a su juicio, cumple todos los
requisitos necesarios para que la interesada opte al Grado de Doctor.
Alcal de Henares,
Dra. Ana M Bajo Chueca Dra. M Jos Carmena Sierra

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA DE
SISTEMAS.
Facultad de Medicina
Campus Universitario.
28871 Alcal de Henares (Madrid)
Telfonos: 91 885 45 77 Fax: 91 885 45 85
ANTONIO JIMNEZ RUIZ, como Director del Departamento de Biologa de

Sistemas de la Universidad de Alcal,
INFORMA:
Que Tesis Doctoral que lleva como ttulo: HORMONA LIBERADORA DE

LA HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y SUS ANTAGONISTAS
EN LA PROGRESIN DEL CNCER DE PRSTATA, ha sido realizada
por Laura Muoz Moreno en el Departamento de Biologa de Sistemas de la
Universidad de Alcal bajo la direccin de ANA MARA BAJO CHUECA y
MARA JOS CARMENA SIERRA y, a su juicio, cumple todos los requisitos
necesarios para que la interesada opte al Grado de Doctor.
Alcal de Henares,
Dr. Antonio Jimnez Ruiz

La ciencia, a pesar de sus progresos increbles, no podr
nunca explicarlo todo. Cada vez ganar nuevas zonas a
lo que hoy parece inexplicable. Pero las rayas fronterizas
del saber, por muy lejos que se eleven, tendrn siempre
delante un infinito mundo de misterio
Gregorio Maran
A mis padres y hermana
A Felipe
Ahora echo la vista atrs y me doy cuenta de lo afortunada que soy por tener
tanta gente a la que agradecer el apoyo que me han dado durante estos increbles aos
No poda comenzar sin agradecer a Juan Carlos por acogerme en su laboratorio,
por ayudarme a conseguir la tan esperada beca, y por soportar mis continuas peticiones
de autgrafosHe aprendido muchsimo de ti durante estos aos.
Todava recuerdo el primer momento que llegu al laboratorio para
entrevistarme con m, ahora, Directora de Tesis, Ana Bajo, por intermediacin de mi
mejor amigo, era un sueo para m poder entrar en un laboratorio y tener la opcin de
hacer la Tesis. No s cmo expresar lo mucho que agradezco lo que has hecho para que
este sueo se hiciera realidad, por confiar en mi desde el primer momento, por luchar por
mi como investigadora, por animarme cuando algo sala mal, pero sobre todo por ser un
apoyo, por escucharme y ayudarme a nivel personal.
Como olvidarme de mi querida Co-directora Maria Jos, tantos aos planificando
experimentos, proyectos y congresos, inventndonos que hacer, y pelendonos con cada
lnea que escriba en esta Tesis. Estos aos no han sido fciles, pero t conseguiste que todo
resultara ms sencillo, buscando soluciones increibles a cada problema. Ahora me toca
agradecerte de corazn todo el tiempo que has empleado en ayudarme, el gran entusiasmo
que me has transmitido por la investigacin y la docencia, adems de las luchas para
darme alguna oportunidad como docente, no cambies nunca, eres increble!
Anuska y Eva mis grandes apoyos durante estos aoscomo decir unas palabras
que estn a vuestra alturaos llevas un pedacito de mi corazn Eva, cuantos aos
juntas en este laboratorio y cuanto te echo de menos amigacreo que no poda haber
tenido mejor compaera en este viaje. Hemos vivido tantas alegras y tristezas, pero
siempre juntas, peleando por hacernos un hueco en el maravilloso mundo de la
investigacin que nos traa de cabeza, hemos vivido tantas experiencias dentro, y fuera
del laboratorio en esos maravillosos congresosy como no, a nivel personal me llevo a una
amiga muy especial, para siempre. Gracias por ayudarme y apoyarme siempre que lo
necesitaba, sin condiciones. Te deseo lo mejor es tu nueva etapa como madre, eres increble
y lvaro es la gran prueba de ello. Anuska, gracias por estar siempre a mi lado, por
aguantarme cuando no poda ms, por escucharme siempre sin quejas, por esos grandes
consejosque sabia eres ta, por mostrarme ese entusiasmo por la vida aunque algo
vaya malme siento realmente afortunada de tenerte haberte conocido y de tenerte como
amiga, y quiero que sepas que me tendrs a tu lado siempre que me necesites. Espero que
puedas seguir en este mundo y que dentro de unos aitos nos invites para celebrar tu
nombramiento como profesora titular, porque te lo mereces, pero prometo no equivocarme
esta vez en lo que escriba en la banda. De mayor quiero ser como t, no cambies nunca!!!
Y como no agradecer a mis Liebhers, porque sin ellos esta tesis no hubiera sido
posible, siempre me han dado todo lo que necesitaba, gracias!.
Too, mi farmacutico particular, eres un to increble de verdad, no olvidar esas
comidas amenizadas con las magnficas antoadasEspero que te vaya todo genial,
pero me tengo enterar, que los amigos se cuentan las cosas importantes Disfruta de la
oportunidad que te brindan Anuska y Javier cada da, es una suerte que les tengas a tu
lado ayudndote. Javier Lucio, eres un ejemplo para todos los docentes e investigadores de
la universidad, quiero pensar que si todos fueran como t, todo ira mejorespero que te
dejen seguir luchando. A Maribel, muchas gracias por todo tu trabajo que est tambin
reflejado en todos nuestros trabajos y, por supuesto, en esta Tesis, bien lo sabes Coral,
eres una mquina, no dejes que esas ganas decaigan, mucho nimo, puedes hacerlo!. Paula,
no te pongas celosa que t eres mi farmacutica particular tambin, sigue con esa energa
inagotable que tienes y llegars muy lejos. Carlos, el toque andaluz de las comidas, espero
que tengas mucha suerte con tu Tesis. Mati, todo el esfuerzo que has realizado durante
estos aos tendr una gran recompensa.
Mis antecesorasValdehita, he tenido la suerte de disfrutar de ti durante unos
meses, y de esas charlas y consejos a la hora de la comida, ojal se vuelvan a repetir, te
deseo todo lo mejor, y que disfrutes de esa peque tan preciosa, Vera; Sandra, espero que te
vaya genial en esta nueva etapa, y a ver si retomamos las quedadas fuera del labo de las 5
Prietas que ltimamente est complicado. A mis posibles predecesorasBea, Isabel y
Mara, mucha suerte, espero que podis disfrutar de la experiencia de realizar la Tesis.
Jose, mucho tiempo ha pasado desde que empezamos la carrera, todava recuerdo
que me dijiste que sera capaz y parece que as ha sido, gracias por tener siempre palabras
de nimo, eres un gran amigo, y estoy muy orgullosa de todo lo que has conseguido.
Ceci y Nadia, sois las siguientes, ser un honor ver como os converts en doctoras,
un ttulo ms que merecido, s que no es nada fcil pero vosotras podis con todo, sois unas
luchadoras. Agatha, mi querida FPUme encanta que seas mi compi de esas guerras
contra el mundo, y su compi Alicia, espero que disfrutis muchsimo de vuestros aos
aqu, y si necesitis algo aqu sigo. A mis compis de pasillo, Arancha, por ayudarnos
siempre en todo lo que estaba en tus manos y por organizar las fiestas de Navidad, espero
que acabes donde acabes seas muy feliz; el laboratorio de los Guijarro, Borja, Patricia y
David, por vuestra compaa en este pasillo tan solitario, os deseo lo mejor a los tres.
A los pocos becarios que sobreviven, Ana, ya te queda poquito, mucho nimo;
Irene, la famosa vecina de Mara Jos, espero que sigis las dos as de encantadoras;
Hctor, disfruta siguiendo los pasos de tu padre; Miguel, que guerra me has dado con las
centrfugasjajaja, a Eva, un gran chino, que bueno... A Nuria, espero que tengas mucha
suerte. A los que se han ido ya Elia, Andrea, Irene, Diana, Carlos Maro, Ariel, Ral,
Mali, Pablo, Ester, Carmen
Agradecer la compaa en esas eternas prcticas de los tcnicos Miguel y Luis, a
Anglica, por tu ayuda con todos los papeleos, a Isabel y Cristina, y a Lourdes, que ya se
nos fue, por vuestra ayuda en cultivos. A la gente de gerenciano podan faltar
A todos los profesores del departamento, en especial a Eduardo y Miguel ngel
una gran compaa de pasillo. Gracias Miguel ngel por esas conversaciones
transcendentales que solemos tener y por tus cancioncillas que me animan el da.
Al laboratorio de Sevilla, gracias a Jose A. Pintor que me acogi durante esos meses
en su laboratorio como una ms, gracias a More, por ensearme un mundo nuevo en la
investigacin y por hacernos rer siempre, a Beln por ayudarme siempre que poda, y
sobre todo a mi Cris, que adems de una compaera se convirti en una gran amiga.
A mis amigos, sobre todo a mis queridas Pa ti la vida, Myri, Elena y Silvia que a
pesar de no entender mucho lo que haca siempre me han apoyado y aconsejado, os quiero.
A Miguel, Juanma, Yoyer, Santi, Pablo, lvaro, Mitos, Laura, Saras, Tati, Ester, SoniaA
las chicas de la academia, que me han acompaado durante estos aos.
A mis primas, MCarmen, mi ejemplo a seguir, Sonia y Julia, sois un apoyo muy
importante para m, os quiero primis, y a mis tos que ya no estn, os echo de menos A
mis tos Toms y Alfonsa, y mis primos Vernica y Daniel. A mi familia poltica,
especialmente a mis peques que adoro, Diego y Martita.

A mi amor, Felipe, eres el pilar que me sostiene arriba, gracias por todo tu apoyo
en los malos y en los buenos momentos, por estar siempre sin necesidad de pedrtelo, por
escucharme, ayudarme y mimarme tanto, eres increble y te quiero con locura, siempre
+.
A mis padres, que gran suerte tengo de teneros a mi lado, nos os cambiara por
nada del mundo, todo esto es gracias a vuestro esfuerzo, sin vosotros mi sueo no se podra
haber hecho realidad, sois nicos, os quiero!. A mi hermana, Carol, gracias por apoyarme
siempre que te he necesitado y por ayudarme siempre que has podido, te quiero enana, y
espero que todo te vaya genial. A mi peque, Jairo, un bichito al que adoro con todas mi
corazn.
ABREVIATURAS
Universidad de Alcal Abreviaturas
-SMA: Actina de msculo liso EGFR: Receptor del factor de crecimiento

AAH: Hiperplasia adenomatosa atpica epidrmico
ABTS: 2,2-acinobis-(3- tilbenzotiazolina -6-) EGTA: cido etilenglicoltetractico
AC: Adenilato ciclasa ELISA: Inmunoanlisis ligado a enzima
ADAM: Desintegrina y metaloproteasa EMT: Tansicin epitelio-mesnquima
AR: Receptor de andrgenos EP: Dibujo de elaboracin propia.
AFR: Anfiregulina EPG: Epigenina
BAX: Protena X asociada a BCL2 EPR: Epirregulina
BCL2: Protena del linfoma de clulas B 2 ERE: Receptor de estrgenos
BRCA1, -2: gen de cncer de mama 1 y 2 ERK: Quinasas reguladas por seales
BrdU: Bromodeoxiuridina extracelulares
BSA: Albmina srica bovina FAK: Quinasa de adhesin focal
BTC: Betacelulina FBS: Suero fetal bovino
CAM: Molculas de adhesin celular FDA: Food and Drug Administration
cAMP: Adenosin monofosfato cclico FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos
CBP: Protena de unin a CREB FITC: Isotiocianato de fluorescena
CDK. Quinasa dependiente de ciclina GABA: cido gamma-aminobutrico
COX: Ciclooxigenasa GDP: Guanosina difosfato
CP: Cncer de prstata GH: Hormona del crecimiento
CRE: Elemento de respuesta a cAMP GHRH: Hormona liberadora de la
CREB: Protena de unin a CRE hormona de crecimiento
CSC: Clula madre cancerosa GHRH-RP: Pptido relacionado con GHRH
DAG: Diacilglicerol GnRH: Hormona liberadora de
DBD: Dominio de unin al DNA gonadotropinas
DEPC: Dietilpirocarbonato GPCRs: Receptores acoplados a protenas G
DMSO: Dimetilsulfxido GTP: Guanosina trifosfato
dNTPs: desoxirribonucletidos trifosfato HB-EGF: EGF de unin a heparina
DRE: Examen digital del recto HER2, -3 y -4: Receptor del factor de
DTT: Ditiotreitol crecimiento epidrmico humano tipo 2, 3 y 4
EGF: Factor de crecimiento epidrmico HER2-P: HER2 fosforilado
EDTA: cido etilendiaminotetractico hGHRH-R: Receptor de GHRH hipofisario
Abreviaturas Universidad de Alcal
HGPIN: Neoplasia prosttica intraepitelial de OMS: Organizacin Mundial de la Salud

alto grado PACAP: Pptido activador de la
HIF: Factor inductor de hipoxia adenilato ciclasa hipofisaria
HIFU: Ultrasonidos focalizados de alta PBMC: Clulas mononucleares en sangre
frecuencia perifrica
HRG: Heregulina PC1: Proprotena convertasa 1
HRP: Perxidasa de rbano PCNA: Antgeno nuclear de
IFN-: Interferon proliferacin celular
IGF: Factor de crecimiento similar a PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa
insulina PDGF: Factor de crecimiento derivado
IL-17: Interleuquina 17 de plaquetas
IP: Ioduro de propidio PI3K: Fosfoinostido 3 quinasa
iNOS: xido ntrico sintasa inducible PIGF: Factor de crecimiento placentario
IP3: Inositol trifosfato PIN: Neoplasia prosttica intraepitelial
JAK: Janus Quinasa PIP2: Fosfatidilinositol 4-5, bisfosfato
KGF: Factor de crecimiento de keratinocitos PKA: Protena quinasa A
LEF: Factor potenciador linfoide PKC: Protena quinasa C
LGPIN: Neoplasia prosttica intraepitelial de PLC: Fosfolipasa C
bajo grado PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
MAPK: Protena quinasa activada PON1: Paraoxonasa 1
por mitgenos PR: Prostactectoma radical
MDR: gen de sensibilidad a medicamentos PSA: Antgeno prosttico humano
MEK: Quinasa de MAPK PTB: Dominio de unin a fosfotirosina
MET: Transicin mesnquima-epitelio PTEN: Homlogo de fosfatasa y tensina
MMPs: Metaloproteasa de matriz PyK2: Protena tirosina quinasa 2
MT-MMP: Metaloproteasa de la membrana RECK: Protena rica en cistena inductora de
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- reversin
2,5-difenil-tetrazol RNASEL: Ribonucleasa L
NAD: Dominio de autorregulacin negativa SH2: Dominio de unin a Src
NFB: Factor de transcripcin nuclear B STAT3: Transductor de seal y activador de
Nrg1, 2, 3 y 4: Neuregulina 1, 2, 3 y 4 la transcripcin
Universidad de Alcal Abreviaturas
SVs: Variantes de splicing

TDT: tiempo de duplicacin del tumor
TGF: Factor de crecimiento transformante
TIMP: Inhibidor tisular de metaloproteasas
TMD: Dominio transmembrana
TNF: Factor de necrosis tumoral
TRH: Hormona liberadora de tirotropina
VEGF: Factor de crecimiento del
endotelio vascular
VEGFR: Receptor deVEGF
VIP: Pptido intestinal vasoactivo
1. INTRODUCCIN.. 1
1.1 Cncer de prstata..... 3
1.1.1 Epidemiologa.... 4
1.1.2 Etiologa 5
1.1.3 Diagnstico.... 7
1.1.4 Clasificacin... 7
1.1.5 Tratamiento.. 12
1.1.6 Progresin tumoral... 13
1.1.6.1 Lesiones premalignas 14
1.1.6.2 Transicin epitelio-mesnquima y mesnquima-epitelio
(EMT y MET).. 15
1.1.6.3 Dependencia/Independencia andrognica... 16

1.2 Procesos tumorales implicados en la progresin del CP. 18
1.2.1 Proliferacin.. 18
1.2.2 Adhesin.... 23
1.2.3 Degradacin de la matriz extracelular. 25
1.2.4 Angiognesis. 27
1.3 Familia del EGFR. 29
1.3.1 Receptores y ligandos... 30
1.3.2 Activacin de los receptores. 32
1.3.3 Transactivacin de la familia EGFR mediada por GPCR... 34
1.3.4 Familia EGFR y cncer 36
1.4 Hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH).... 37
1.4.1 Acciones biolgicas de GHRH. 41
1.4.2 Receptores de GHRH.... 45
1.4.3 Sealizacin de GHRH. 49
1.4.4 Antagonistas de GHRH 53
2. OBJETIVOS.... 57
3. MATERIAL Y MTODOS...... 61
3.1 Materiales...... 65
3.1.1 Reactivos... 65
3.1.2 Modelos experimentales........ 69
3.1.2.1 Lneas celulares. 69
3.1.2.2 Animales de experimentacin... 70
3.2 Mtodos.......... 61
3.2.1 Clulas... 61
3.2.1.1 cidos nucleicos 61
Aislamiento de RNA 61
Retrotranscripcin de RNA (RT).... 61
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).... 72
3.2.1.2 Protenas.... 74
Aislamiento de protenas totales. 74
Aislamiento de citosoles y ncleos.. 75
Inmunodeteccin de protenas. 75
Inmunocitoqumica . 77
Zimografa.... 78
ELISA para valorar el VEGF.. 79
3.2.1.3 Ensayo de incorporacin de bromodesoxiuridina 80
3.2.1.4 Ensayo de viabilidad con MTT 81
3.2.1.5 Ensayo de ciclo celular.. 82
3.2.1.6 Ensayo de adhesin... 82
3.2.1.7 Ensayo de migracin..... 83
3.2.2 Ratones.. 84
3.2.2.1 Induccin de tumores con clulas PC3. 84
3.2.2.2 Induccin de tumores con clulas RWPE-1 86
3.2.2.3 Seguimiento de los experimentos de tumorigenicidad. 87
3.2.2.4 Aislamiento de RNA y RT-PCR.. 87
3.2.2.5 Inmunohistoqumica...... 87
3.2.2.6 Tricrmico de Masson....... 89
3.2.2.7 Lisados de tejido tumoral y Western blotting... 89
3.2.2.8 Estudio de la expresin de VEGF y de la actividad
...gelatinoltica de MMPs 90
3.2.2.9 Aislamiento de membranas y ncleos.. 90

3.2.2.10 Sonda 2-desoxi-D-glucosa ..... 91
3.2.2.11 Rayos X... 92
3.2.3 Anlisis estadstico.... 93
4. RESULTADOS.... 95
4.1 Estudio de GHRH y sus receptores en clulas prostticas humanas.. 97
4.1.1 Expresin de GHRH..... 97
4.1.2 Expresin de los receptores de GHRH 98
4.1.3 Localizacin de los receptores de GHRH..... 97
4.1.4 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la expresin de sus
...receptores.. 100
4.2 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en procesos implicados en la

...progresin del cncer de prstata......101
4.2.1 Viabilidad celular y citotoxicidad..101

4.2.2 Proliferacin celular.. 104
4.2.2.1 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en la proliferacin
...de clulas RWPE-1, LNCaP y PC3.. 104
4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la

...proliferacin inducida por GHRH en clulas PC3.... 106
4.2.2.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la.expresin de

...PCNA en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3........... 108
4.2.3 Ciclo celular y apoptosis en PC3... 110

4.2.3.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular... 110
4.2.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre el factor de
...transcripcin p53 en PC3...... 112
4.2.3.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre p21 en PC3... 113
4.2.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre las protenas
...Bcl2 y Bax implicadas en apoptosis en PC3..114
4.2.4 Adhesin celular.... 115

4.2.4.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la adhesin celular
... de clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. 116
4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de.

.....E-cadherina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3 118
4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de

.-catenina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. 121
4.2.4.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de,

.......CD44, c-Myc y Ciclina D1 en clulas PC3 125
4.2.5 Migracin celular..... 126

4.2.6 Degradacin de la matriz extracelular.. 130
4.2.7 Neurodiferenciacin...... 133
4.2.8 Angiognesis....... 135
4.3 Efecto de GHRH y de sus antagonistas sobre la va del EGF. 136
4.3.1 Expresin y activacin de EGFR Y HER2... 136
4.3.2 Heterodimerizacin de EGFR-HER2..... 139
4.3.3 Vas de sealizacin implicadas en la transactivacin de EGFR
..y HER2 mediada por GHRH... 140
4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivacin de EGFR

...y.HER2 por GHRH. 140
4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activacin

...de.pSrc ..... 142
4.3.3.3 Implicacin de las metaloproteasas en la transactivacin

................... .de EGFR y HER2 por GHRH .... 144
4.3.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la expresin de
..TACE/ADAM17 147
4.3.3.5 Implicacin de la transactivacin de EGFR y HER2

... .......inducida por GHRH en angiognesis, adhesin y
migracin celular 148
4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidrmico, EGF, sobre

......................la.expresin de GHRH y sus receptores 152
4.4 Estudio del efecto los antagonistas de GHRH en un modelo

.experimental in vivo de cncer de prstata humano 153
4.4.1 Efecto de JMR-132 y JV-1-38 en el crecimiento de tumores

...in vivo... 153
4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad. 153

4.4.1.2 Expresin de GHRH y sus receptores... 155
4.4.1.3 Proliferacin celular............... 157
4.4.1.4 Ciclo celular y apoptosis.... 158
4.4.1.5 Adhesin celular 159
4.4.1.6 Degradacin de la matriz extracelular. 162
4.4.1.7 Angiognesis.. 164
4.4.1.8 Metstasis.. 165
4.4.1.9 Expresin de EGFR, HER2 y Src. 167
4.4.1.10 Expresin de diferentes isoformas de PKCs. 169
4.4.2 Efecto de MIA-690 y Gefitinib en el crecimiento de tumores
.in vivo.. 170
4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad. 171

4.4.2.2 Angiognesis . 172
4.4.2.3 Metstasis.... 173
4.5 Efecto de GHRH sobre la induccin de tumores.. 174
5. DISCUSIN...... 177
6. CONCLUSIONES........ 197
7. BIBLIOGRAFA. 203
8. SUMMARY...... 235
9. PRODUCCIN CIENTFICA..... 241
10. FINANCIACIN....... 247
1. INTRODUCCIN
Universidad de Alcal Introduccin
En 1853, J. Adams, un cirujano ingls realiza la primera descripcin del

cncer de prstata mediante un examen histolgico, sealndola en su informe
como una enfermedad muy rara. Durante los ltimos 150 aos la prevalencia
de cncer de prstata ha aumentado de forma drstica, y aunque se ha
encontrado tratamiento eficaz para estadios menos avanzados de la enfermedad,
todava no se ha encontrado una cura para los casos ms agresivos.
1.1 CNCER DE PRSTATA
La prstata es una glndula del aparato reproductor masculino que aporta

el lquido seminal y sustancias que protegen y nutren a los espermatozoides.
Tiene forma de castaa, su tamao es de 4 cm de largo por 3 cm de ancho y su
peso es de 20 g, aunque sus dimensiones varan con la edad. Se encuentra
delante del recto y por debajo de la vejiga, rodeando a la primera porcin de la
uretra, la cual separa la prstata en porcin ventral (fibromuscular) y dorsal
(glandular) (Figura 1A). Se han descrito diferentes modelos para el estudio
anatmico de la prstata, pero el ms aceptado es el modelo de McNeal que
distingue 4 zonas (Figura 1B) (Kirby y col., 2006):
Zona anterior: exclusivamente fibromuscular.

Zona central: representa el 25%, en ella se originan los procesos
inflamatorios y se asientan el 8% de los cnceres de prstata.
Zona de transicin: constituye el 5%, y en ella se desarrollan el 25% de
los adenocarcinomas de prstata.
Zona perifrica: representa el 70% de la prstata, y es el sitio de origen
del 75% de los carcinomas prostticos. Esta es la razn de que los
hombres operados de hiperplasia benigna de prstata sigan teniendo
riesgo de desarrollar un carcinoma en el futuro, por haber sufrido una
ciruga conservadora donde solo se ha eliminado la zona central.
-3-
Introduccin Universidad de Alcal
A) B)
Vejiga
Prstata Uretra Zona central

Zona de transicin
Uretra
Zona perifrica
Figura 1. Vista lateral del rgano reproductor masculino (A) y detalle de la

anatoma de la prstata (B). Imagen tomada de www.nlm.nih.gov (A) y
modificadas de www.hkua.org (B).
1.1.1 EPIDEMIOLOGA
El cncer de prstata (CP) es la segunda neoplasia ms comn en los

hombres a nivel mundial. Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) se
estima que 1,1 millones de hombres en todo el mundo fueron diagnosticados de
cncer de prstata en el ao 2012, representando el 15% de los cnceres
diagnosticados en los hombres, y un 70% de los casos se producen en pases
desarrollados. Con un valor estimado de 307.000 muertes en 2012, el CP es la
quinta causa de muerte por cncer en los hombres y supone el 6,6% del total de
muertes de hombres en el mundo. La tasa de mortalidad es generalmente alta en
poblaciones como el Caribe (29 por 100.000) y frica subsahariana (19-24 por
100.000), siendo muy baja en Asia (2,9 por 100.000 habitantes) e intermedia en
Amrica y Oceana. En EEUU, el CP constituye la neoplasia ms frecuente y la
segunda causa de muerte especfica por cncer en los hombres (Siegel y col.,
2014). En Espaa se sita en el primer puesto en cuanto a la incidencia, y el
segundo ms frecuente en las tasas mortalidad por cncer (Figura 2).
-4-
SIN DATOS
Figura 2. Tasa de mortalidad del cncer de prstata por cada 100.000

habitantes. Imagen modificada de www.theglobeandmail.com.
1.1.2 ETIOLOGA
Se han encontrado una serie de factores de riesgo que aumentan la

probabilidad de padecer cncer de prstata:
Edad: El 99% de los pacientes han sido diagnosticados con CP a partir de

los 50 aos de edad. La incidencia del CP aumenta de forma exponencial
con el aumento de la edad, siendo mayor en el rango de 65-69 aos, el
cual contribuye a un 32% de los cnceres de prstata. En cuanto a la
mortalidad, la mayor tasa se sita en pacientes con edades por encima de
85 aos, que suponen un 23% de las muertes por cncer de prstata (Dorr
y col., 2013).
Raza: Los datos disponibles apuntan a que los hombres de raza negra
tienen mayor probabilidad de desarrollar cncer de prstata que la
poblacin de raza blanca. Se piensa que puede haber factores genticos
implicados en esta mayor susceptibilidad al CP. La diferencia que se
-5-
observa en la tasa de incidencia entre los hombres de raza negra en

distintos pases, sugiere que estn implicados factores ambientales como
la dieta y el nivel socioeconmico (Kheirandish y Chinegwundoh, 2011).
Antecedentes familiares: Se trata de un factor de riesgo importante sobre

todo en hombres jvenes. Cuando existe un pariente de primer grado con
CP el riesgo se duplica, y para el caso de 2 o 3 parientes, el riesgo se
multiplica por 5 y 11. Aproximadamente, un 10-15% de pacientes con
cncer de prstata tienen un familiar con cncer de prstata. Se han
encontrado genes asociados al CP hereditario: BRCA2, BRCA1,
RNASEL y PON1 (Colloca y Venturino, 2011). Adems, algunos autores
afirman que mutaciones en los locus 8q y 17q son las responsables del
16% de los cnceres de prstata hereditarios (Kote-Jarai y col., 2008).
Dieta: Algunos estudios en modelos animales implican a ciertas

sustancias de la dieta en el riesgo de padecer CP, tales como, las aminas
heterocclicas, producidas por socarrar las carnes, y por la presencia de
las hormonas esteroides sexuales, particularmente los estrgenos. Varios
estudios apuntan a que la ingesta de frutas y verduras est asociada
directamente a un menor riesgo de padecer CP (Nelson y col., 2014).
Factores infecciosos: Existen estudios que afirman que los agentes

infecciosos pueden influir en la incidencia del CP a travs de varios
mecanismos como, incorporacin de oncogenes vricos al genoma,
inhibicin de los genes supresores de tumores, estimulacin de la
proliferacin y supresin de la vigilancia inmunolgica. La inflamacin
crnica de la prstata generada por las enfermedades de transmisin
sexual se asocia con mayor riesgo al CP, pero actualmente no se ha
relacionado especficamente con ningn agente infeccioso especfico
(Ferrs-I-Tortajada y col., 2011).
-6-
Otros factores: Algunos estudios han encontrado que la obesidad y la

Diabetes mellitus tipo II estn relacionadas con la aparicin de CP
agresivo. Estas alteraciones metablicas pueden producir estrs oxidativo
y causar un estado pro-inflamatorio permanente, lo que incrementa el
riesgo de padecer cncer de prstata (Di Francesco y Tenaglia, 2014).
1.1.3 DIAGNSTICO
En general, el CP en etapas iniciales no causa sntomas, y para su

deteccin los mtodos ms utilizados son el anlisis de la cantidad de antgeno
prosttico especfico (PSA) en la sangre, y el examen digital del recto (DRE).
Sin embargo, varios estudios ponen en duda que el PSA sea un buen marcador
de CP, ya que se encuentra alterado en otras enfermedades como la hiperplasia
benigna de prstata, prostatitis e infeccin urinaria (Dimakakos y col., 2014). El
marcador ms apropiado para el diagnstico del CP en una etapa temprana no
ha sido descubierto todava, incluso se cree que un solo marcador no sera
suficiente.
1.1.4 CLASIFICACIN
El CP se clasifica segn la parte afectada, el grado de diferenciacin

histolgico y el estadio del tumor.
Segn el tipo celular afectado por el cncer encontramos la siguiente

clasificacin (Kirby y col., 2006):
Tumores epiteliales: adenocarcinoma, carcinosarcoma, adenocarcinoma

ductal, carcinoma urotelial, escamoso y de clulas basales. Este tipo
supone el 95 % de los canceres de prstata.
-7-
Tumores neuroendocrinos: carcinoma de clulas pequeas, tumor

carcinoide, tumor neurodiferenciado endocrino, paraganglioma y
neuroblastoma.
Tumores estromales
Tumores mesenquimticos
Tumores hematolinfoides
Otros tumores
El grado de diferenciacin histolgica se determina por el grado de

Gleason, que se estableci en 1992 para el CP y est reconocido
internacionalmente para la gradacin del cncer. Para ello, se realiza un examen
histolgico de la muestra, otorgando una puntuacin (Figura 3) a los dos
patrones ms habituales, y sumndola posteriormente para obtener el grado de
Gleason que ir de 2-10 (Gleason, 1992; Iczkowski y Lucia, 2011).
-8-
Grado 1: Glndulas pequeas y redondeadas,

monoestratificadas, con citoplasma claro y sin
estroma interglandular. El conjunto glandular est
bien compacto y delimitado del entorno.
Grado 2: Glndulas ms irregulares y citoplasma

ms claro y existe estroma entre las glndulas. El
conjunto glandular est mal delimitado.
Grado 3: Glndulas mucho ms irregulares con

mayor separacin estromal. El citoplasma es ms
basfilo y existe una mala delimitacin del
entorno. El epitelio puede adquirir una forma
papilar y cibriforme.
Grado 4: Existe una progresiva fusin de las

glndulas que se ramifican y forman ramas slidas.
Se observan clulas grandes con un citoplasma
plido. El conjunto est mal delimitado e invaden
de forma agresiva el estroma.
Grado 5: El tejido est formado por masas

infiltrantes irregulares con configuraciones
glandulares ocasionales o clulas con anillo de
sello de distribucin irregular. La invasin del
estroma es intensa y destructiva.
Figura 3. Representacin de los grados de la clasificacin de Gleason en el

cncer de prstata. Imagen tomada de www.stjohnprovidence.org.
El sistema de estadiaje aceptado internacionalmente es el TNM, cuyas

siglas indican el tamao del tumor (T), ndulos linfticos afectados (N) y
generacin de metstasis (M). La clasificacin realizada para 2010 (Sobin y
Compton, 2010) es la siguiente:
T- Tumor primario
TX No se puede evaluar el tumor primario.

T0 Ausencia de datos de tumor primario.
-9-
T1 Tumor clnicamente inaparente no palpable ni visible en las

pruebas de imagen.
T1a El tumor es un hallazgo histolgico fortuito en el 5% o
menos del tejido resecado.
T1b El tumor es un hallazgo histolgico fortuito en ms del 5%
del tejido resecado.
T1c Tumor identificado en una biopsia por puncin, por
ejemplo, debido a una concentracin elevada de PSA.
T2 Tumor limitado a la prstata.

T2a El tumor afecta a la mitad de un lbulo o menos.
T2b El tumor afecta a ms de la mitad de un lbulo, pero no a los

dos lbulos.
T2c El tumor afecta a los dos lbulos.
T3 El tumor se extiende a travs de la cpsula prosttica.

T3a Extensin extra-capsular, incluida afectacin microscpica
del cuello de la vejiga.
T3b El tumor invade una o ambas vesculas seminales.
T4 El tumor est fijo o invade estructuras adyacentes distintas de las

vesculas seminales: esfnter externo, recto, msculos elevadores o
pared de la pelvis.
N- Ganglios linfticos regionales
NX No se pueden evaluar los ganglios linfticos regionales

N0 Ausencia de metstasis ganglionares regionales
N1 Metstasis ganglionares regionales.
- 10 -
M- Metstasis a distancia
MX No se pueden evaluar las metstasis a distancia.
M0 Ausencia de metstasis a distancia.
M1 Metstasis a distancia.
M1a Ganglios linfticos no regionales.
M1b Huesos.
M1c Otros focos.
Actualmente para valorar el estadio clnico de un paciente con CP se

combina la clasificacin TNM, la gradacin de Gleason y las concentraciones de
PSA sricas para clasificar el cncer de prstata por etapas como se muestra en
la tabla 1 (Edge y col., 2010).
Tabla 1. Estadios clnicos del cncer de prstata.
T N M PSA Gleason
Etapa I T1a-c N0 M0 <10 6
T2a N0 M0 <10 6
Etapa IIA T1a-c N0 M0 <20 7

T1a-c N0 M0 10-20 6
Cncer
T2a N0 M0 10-20 6
T2a N0 M0 <20 7
T2b N0 M0 <20 7
Etapa IIB T2c N0 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-2 N0 M0 20 Cualquiera
- 11 -
T1-2 N0 M0 Cualquiera 8
Etapa III T3a-b N0 M0 Cualquiera Cualquiera
Etapa IV T4 N0 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-4 N1 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-4 N0-1 M1 Cualquiera Cualquiera
1.1.5 TRATAMIENTO
Entre las diferentes opciones que se utilizan en el tratamiento del CP

destacan la ciruga, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, criociruga y
ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU).
Dentro de las opciones quirrgicas encontramos la prostatectoma

radical (PR) y la linfoadenectoma plvica, que se suelen combinar cuando el
riesgo de metstasis es alto, ya que normalmente entre el 15 y 40% de los
ndulos extirpados tienen clulas tumorales (Joniau y col., 2013). Otro tipo de
tratamiento quirrgico es la criociruga que consiste en aplicar fro extremo
para destruir el tejido enfermo, y que normalmente se utiliza en tratamientos a
corto plazo.
La radioterapia es la segunda modalidad de tratamiento ms habitual

para CP localizado. Dentro de ella encontramos la terapia con haz de
protones, que utiliza radiacin ionizante de una forma ms localizada, precisa y
- 12 -
menos txica. As mismo, se ha visto que produce un incremento en la

supervivencia de los enfermos de CP (Pugh y col., 2013).
La terapia hormonal se basa en el hecho de que los andrgenos suponen

una fuente de alimentacin para el crecimiento del tumor. Por ello, la terapia de
deprivacin de andrgenos, junto con otras aproximaciones mdicas, supone un
tratamiento inicial para evitar el CP metastsico. Los tratamientos utilizados
para la deprivacin andrognica incluyen: estrgenos, agonistas de la GnRH
(hormona liberadora de gonadotropinas) e inhibidores de la 5- reductasa.
Normalmente los tratamientos van dirigidos a las clulas cancergenas, pero es
importante tambin inhibir el estroma prosttico, ya que juega un papel
importante en la invasividad de las clulas tumorales (Chen y Zhao, 2013).
La quimioterapia es principalmente utilizada en el CP avanzado

independiente de andrgenos, donde ha conseguido resultados satisfactorios
incrementando la supervivencia, disminuyendo los niveles de PSA y mejorando
la calidad de vida del paciente. Entre los frmacos utilizados encontramos:
docetaxol, doxorubicina, vinblastina, paclitaxel, mitoxantrona y otros, siendo
utilizados solos o combinados entre s. Estos compuestos inhiben vas
importantes en el crecimiento tumoral como el ciclo celular (Chen y Zhao,
2013).
La eleccin del tratamiento adecuado depende del estadio en el que se

encuentre la enfermedad; adems, hay que tener en cuenta la edad del paciente,
sus condiciones generales de salud y los posibles efectos adversos del
tratamiento.
1.1.6 PROGRESIN TUMORAL
El CP se inicia con pequeas lesiones bien localizadas; algunas de estas

lesiones progresan dando lugar a carcinomas, que pueden alcanzar el estadio
- 13 -
ms avanzado de la enfermedad, metastatizando a otros rganos. En pacientes

con CP localizado, la supervivencia en un periodo de 5 aos es de un 100%; sin
embargo, cuando la enfermedad progresa hacia la metstasis la supervivencia se
reduce a un 31%. El 80% de las metstasis observadas en pacientes con CP se
producen en el hueso y dentro del 20% restante encontramos metstasis en
pulmn, cerebro e hgado (Jin y col., 2011).
1.1.6.1 Lesiones premalignas
En 1926, Oertel describi por primera vez las lesiones premalignas de la

prstata. Actualmente se han estudiado en profundidad y se han clasificado en
neoplasia prosttica intraepitelial (PIN) e hiperplasia adenomatosa atpica
(AAH) (Greg, 2013).(Oertel, 1926)
La PIN se caracteriza por una proliferacin displsica del epitelio ducto-

acinar de la prstata. Actualmente se clasifica en alto (HGPIN) y bajo (LGPIN)
grado. La HGPIN es probablemente la precursora del carcinoma prosttico. En
estas lesiones, las glndulas se observan con bordes ondulados, papiliformes o
cribiformes. Los ncleos se vuelven atpicos conforme aumenta el grado de la
lesin, apareciendo acumulaciones cromticas y nuclolos muy prominentes.
La AAH presenta una proliferacin bien delimitada de las glndulas

parecidas a las observadas en un carcinoma con un grado de Gleason 1-2. Las
clulas tienen citoplasma claro y los ncleos con una morfologa normal y
nuclolos no prominentes. Esta lesin se encuentra en un 23% de las
prostatectomas.
- 14 -
1.1.6.2 Transicin epitelio-mesnquima y mesnquima-epitelio (EMT y

MET)
En los ltimos aos, se ha propuesto a la EMT y a las cancer stem cells

(CSCs) como protagonistas de la resistencia a frmacos del CP (Li y col., 2014).
La EMT es un proceso fisiolgico por el cual las clulas epiteliales pierden su
fenotipo epitelial, su polaridad y la adhesin con otras clulas. Esto conlleva a la
adquisicin de un fenotipo mesenquimal, con una alta capacidad de invasin,
migracin, anti-apoptosis y desorganizacin de la matriz extracelular. Muchos
estudios establecen la importancia de la EMT en la progresin del cncer de
prstata, permitiendo que las clulas tumorales epiteliales invadan el estroma y
se diseminen hacia rganos distantes (Grant y Kyprianou, 2013; Li y col., 2014;
Yao y col., 2011).
Se ha visto que la formacin de tumores secundarios en rganos distantes

depende de la EMT. Las clulas metastticas con fenotipo mesenquimal, llegan
a un foco secundario, donde se transforman, de nuevo, en clulas con
caractersticas epiteliales.
Es decir, la EMT es necesaria para la transformacin de las clulas

tumorales en metastticas y la MET para el crecimiento de esas clulas en un
foco secundario. Uno de los primeros pasos en la EMT es la prdida de la
expresin y actividad de E-cadherina en las clulas tumorales, hecho que se
revierte tras el proceso de MET (Yao y col., 2011).
Las CSCs son una pequea poblacin de clulas neoplsicas que se

encuentran dentro del tumor, cuya caracterstica principal es la capacidad de
generar nuevos tumores. Estas clulas se han encontrado en diversos tumores
slidos, entre ellos, el CP. Se ha visto que en el desarrollo de metstasis estn
implicadas CSCs de los mrgenes tumorales sometidas a EMT (Li y col., 2014;
Yao y col., 2011).
- 15 -
1.1.6.3 Dependencia/Independencia Andrognica
Las clulas del tejido prosttico normal necesitan andrgenos para su

crecimiento y supervivencia. Igualmente las clulas de CP son dependientes de
andrgenos. Cuando el CP se detecta de una forma temprana, se aplican
tratamientos anti-andrognicos que consiguen destruir las clulas tumorales,
pero en ocasiones se seleccionan poblaciones celulares que sobreviven a la
ablacin de andrgenos, permitiendo la progresin hacia la independencia
andrognica, lo que traducido a la enfermedad se considera como cncer de
prstata resitente a castracin (CRPC) (Figura 4). Esta progresin provoca un
incremento de la angiognesis y de la metstasis (Saraon y col., 2011). Si no se
evita, el CP evolucionar a un estado de independencia andrognica. Entre las
causas que pueden inducir la independencia andrognica estn:
Cambios genticos y epigenticos producidos en clulas de CP

(Schrder, 2008)
Activacin de diferentes vas de sealizacin independientes del

receptor de andrgenos (AR) por activacin de oncogenes (por ejemplo,
Bcl2) o inhibicin de genes supresores de tumores (por ejemplo, PTEN)
(Saraon y col., 2011; Schrder, 2008)
Activacin del AR independiente de ligando por factores de crecimiento

(IGF, KGF, etc) o receptores tirosina quinasa (como EGFR o HER2)
(Saraon y col., 2011; Schrder, 2008; Greg, 2013).
Hipersensibilidad de AR por la accin de co-activadores y co-represores

(Schrder, 2008)
Mutaciones en el AR en un 10-20% de los pacientes con CP avanzado

(Saraon y col., 2011; Schrder, 2008).
- 16 -
La diferenciacin neuroendocrina de las clulas de CP dependientes de

andrgenos puede inducir la independencia andrognica (Conteduca y
col., 2014). La transformacin de las clulas epiteliales prostticas hacia
un fenotipo neuroendocrino hace que estas se vuelvan resistentes a los
tratamientos actuales y secreten neuropptidos y factores de crecimiento
influyendo en la proliferacin y la apoptosis celular (Terry y Beltran,
2014).
Prstata normal Cncer de prstata

PIN y AAH
Dependiente de
Andrgenos
EMT
Cncer de prstata
Independiente de
Andrgenos
Proliferacin del Invasin de rganos Migracin a rganos

tumor secundario distantes distantes
MET
Figura 4. Progresin hacia la independencia andrognica del cncer de

prstata. (EP).
- 17 -
1.2 PROCESOS TUMORALES IMPLICADOS EN LA

PROGRESIN DEL CNCER DE PRSTATA
1.2.1 PROLIFERACIN
El control de la proliferacin celular es fundamental para el

mantenimiento de un organismo; cuando este control falla se puede producir
una proliferacin descontrolada de las clulas, iniciando as un proceso
cancergeno. El equilibrio entre la proliferacin y la muerte celular es crucial en
el control de la prevencin del proceso tumoral. En este sentido, la muerte
celular programada o apoptosis controla el nmero de clulas y elimina las
clulas daadas (Kirby y col., 2006).
Las clulas tumorales adquieren la autonoma necesaria para su

proliferacin en ausencia de estmulos, desregulando la maquinaria de control
del ciclo celular, al menos en uno de sus tres puntos de control: en la fase M
donde se comprueba si la alineacin cromosmica es correcta, al final de G1
donde se prueba si el DNA est daado, y al finalizar G2 donde se analiza si la
replicacin ha sido adecuada y si el entorno es favorable. El control del ciclo
celular se lleva a cabo de una forma muy estricta a travs de una serie de
protenas reguladoras: las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas (CDK).
Ambos tipos de protenas forman los diferentes complejos Ciclina-CDK segn
la fase de ciclo en la que nos encontremos (Figura 5).
- 18 -
Ciclina E-CDK2
Ciclina A-CDK2
Ciclina D-CDK4 y 6
S
G1
M G2
Ciclina B-CDK1
Figura 5. Esquema representativo de las fases del ciclo celular y de sus

puntos de control. (EP).
En este complejo sistema de control participan otro tipo de molculas que

interactan con las diferentes protenas implicadas en el ciclo celular. Este es el
caso del PCNA (Antgeno nuclear de proliferacin celular), que es un
componente de la holoenzima DNA polimerasa , responsable de la replicacin
del DNA en la fase S del ciclo celular (Maga y Hubscher, 2003). La mayor
expresin de PCNA se ha encontrado en la ltima parte de la fase G1 y en la
primera parte de la fase S. Existe, de hecho, un especial inters del papel de
PCNA en el cncer, debido a su gran relevancia en la proliferacin celular,
llegando a proponerse como diana teraputica en esta enfermedad (Wang,
2014).
PCNA puede interactuar con otras protenas debido a la presencia en su

extremo C-terminal de un motivo de unin de protenas llamado PIP-Box. La
- 19 -
protena que presenta una mayor afinidad de unin a PCNA es p21

(Cip1/WAF1), unindose al PIP-Box por su extremo C-terminal, impidiendo la
accin de PCNA sobre la polimerasa, y con ello la replicacin (Moldovan y col.,
2007). Por otro lado, p21 es capaz de unirse por su extremo amino-terminal a
los complejos ciclina-CDKs inhibindolos y provocando, en consecuencia, una
parada del ciclo, en cualquiera de sus fases, segn el complejo con el que
interaccione (Abbas y Dutta, 2009). La regulacin de p21 puede ocurrir a travs
de dos vas: dependiente o independiente de p53. En esta ltima va, diversos
factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidrmico (EGF),
derivado de plaquetas (PDGF), de fibroblastos (FGF) y de insulina (IGF), y
otras molculas como c-Myc, son capaces de inducir la activacin de p21 a
travs de sus receptores tirosina quinasa (RTKs) (Prez-Sayns y col., 2013). La
va dependiente se inicia cuando p53 activa la trascripcin de p21. Por otro lado,
se ha visto la existencia de molculas como c-Myc que inhibe la transcripcin de
p21 al unirse a una regin prxima a su promotor reprimindolo (van de
Wetering y col., 2002)
La protena p53 es un factor de transcripcin regulador del crecimiento y

de la apoptosis, actuando como supresor de tumores. Su activacin se inicia tras
producirse un dao en el DNA, parando el ciclo celular en los puntos de control
de G1 y G2. Estructuralmente, p53 contiene 5 dominios funcionales, entre los
ms importantes se encuentran, el dominio N-terminal, necesario para la
activacin de los genes inducibles por p53, el dominio central de unin a
elementos de respuesta a DNA, y el dominio de interaccin con otros
monmeros (Lhr y col., 2003). Diversos estudios han demostrado su
implicacin en cncer, encontrndose mutado en un 50% de las neoplasias
analizadas, incluido el CP. Las mutaciones de p53 en cncer afectan
normalmente al dominio de unin de elementos respuesta a DNA, adems, estas
mutaciones hacen que p53 active la trascripcin de genes, entre los que se
encuentran, EGF, c-myc, fos y MDR-1 (Mirzayans y col., 2012). Este ltimo se
- 20 -
sabe que codifica para una protena que confiere resistencia selectiva a ciertos
frmacos usados para el tratamiento del cncer (Thottassery y col., 1997).
Entre las diversas protenas que regula p53 encontramos a STAT3

(Transductor de seal y activador de transcripcin 3), que tambin es un factor
de transcripcin que regula proliferacin, supervivencia, diferenciacin y
motilidad celular (Qi y Yang, 2014). STAT3 ha sido detectado, de una forma
constitutiva, en diversas neoplasias como, el cncer de prstata, mama, ovario y
de cabeza y cuello (Lin y col., 2002). Por otro lado, se ha visto que p53 inhibe la
fosforilacin de STAT3, as como, su unin al DNA en lneas celulares de cncer
de prstata (Lin y col., 2002). Adems, se ha observado, que STAT3 se sobre-
expresa y se activa por accin de agentes carcinognicos, activando la
transcripcin de genes como c-myc y el propio STAT3, e inhibiendo la de otros
como p53 al unirse a su promotor (Niu y col., 2005; Qi y Yang, 2014).
Otra funcin de p53 es inducir apoptosis mediante la regulacin de genes

como, Bcl2 y Bax. En concreto, p53 activa la trascripcin de Bax (pro-
apopttica) y reprime la de Bcl2 (anti-apopttica), provocando as, la activacin
de la apoptosis (Basu y Haldar, 1998; Johnstone y col., 2002; Mirzayans y col.,
2012). En tumores que presentan perdida de funcin de p53, se ha encontrado
un incremento en el cociente Bcl2/Bax como resultado de los efectos opuestos
que ejerce p53 sobre cada uno de ellos (Mirzayans y col., 2012).
Existe una gran variedad de protenas quinasas implicadas en diferentes

vas de sealizacin, y por ende, en los procesos fisiolgicos y en el desarrollo de
enfermedades como el cncer. Es el caso de una de las familias ms estudiadas,
las Protenas Kinasas C (PKC). Las PKCs participan directa o indirectamente
en procesos biolgicos tan importantes como ciclo celular (actuando sobre p53 y
p21), apoptosis (a travs de Bax y Bcl2), sntesis de DNA, motilidad, adhesin,
proliferacin y diferenciacin celular (mediante EGFR entre otros) y resistencia
a frmacos (Kang, 2014). Las PKCs se dividen en tres subfamilias: clsica (, I,
- 21 -
II y ), nuevas o no clsicas (, , y ) y atpicas (, y ). Dentro de ellas se

destaca el papel en el CP de las isoenzimas , I, II, y (Kang, 2014). As, se
ha visto que la supresin de las isoenzimas y provoca un incremento en la
apoptosis y reduccin de la proliferacin en clulas de CP independiente de
andrgenos (Kang, 2014; Kuo y col., 2011); la expresin de PKC se asocia a un
proceso de apoptosis en clulas de CP (Castilla y col., 2013; Kang, 2014); y PKC
, en CP independiente de andrgenos, acta como supresor de tumores
inactivando a c-myc in vivo e in vitro, impidiendo adems la transcripcin de
genes implicados en proliferacin y anti-apoptosis (Kim y col., 2013).
Otro tipo de quinasas implicadas en el equilibrio mitognico son las

MAPKs (Protenas quinasas activadas por mitgenos). Estas protenas se
activan gracias a la unin de factores de crecimiento, citoquinas y otros
mitgenos, a sus receptores de membrana. Esta activacin inicia hasta siete
cascadas de sealizacin diferentes segn las MAPKs implicadas en ellas. La va
de sealizacin ERK1/2 ha sido la ms implicada en proliferacin y desarrollo
de tumores; de hecho, se han encontrado diversas mutaciones en todos los
miembros de la cascada de sealizacin en varios tumores humanos
(Carlomagno y Chiariello, 2014). Tras la activacin de la va, la protena
ERK1/2 se dirige al ncleo donde se acumula, y all se encarga de fosforilar a
protenas oncognicas como c-Myc y STAT3 (Cargnello y Roux, 2011;
Carlomagno y Chiariello, 2014). ERK1/2 tambin modula protenas implicadas
en ciclo celular, mediante la activacin directa o indirecta de reguladores
positivos de dicho proceso como es la Ciclina D1 (Cargnello y Roux, 2011).
En su conjunto, todas las molculas indicadas en este apartado

intervienen en el equilibrio proliferacin/muerte celular, lo cual se muestra en la
figura 6.
- 22 -
Factores de RTKs
crecimiento
p21 ERK1/2
PCNA p21
Ciclo celular c-myc

p21 STAT3
Ciclina-CDK
p53 Proliferacin
PKC
Bcl-2 Bax
Apoptosis
Figura 6. Conexiones entre las diferentes molculas implicadas en el

balance proliferacin/muerte celular. (EP).
1.2.2 ADHESIN
El proceso conocido como adhesin celular representa la capacidad que

tienen las clulas de formar uniones clula-clula o clula-matriz extracelular,
regulando as, la comunicacin entre ellas. Dicho proceso est implicado en la
progresin tumoral ya que, la metastasis se inicia con la disrupcin del contacto
clula-clula (Cavallaro y Christofori, 2004). Las molculas implicadas en la
adhesin son glicoprotenas transmembrana denominadas de forma genrica
como CAM (Molculas de adhesin celular). Existen dos tipos de CAM:
dependientes de calcio (cadherinas) e independientes de calcio (integrinas,
selectinas, sindecanos e inmunoglobulinas) (Cavallaro y Christofori, 2004;
- 23 -
Paredes y col., 2012). De todas ellas las ms importantes son las cadherinas, que
se encargan de la unin clula-clula.
Las cadherinas se unen por su dominio extracelular a otras cadherinas

presentes en clulas adyacentes. Tienen tambin un dominio transmembrana y
un dominio citoplasmtico que conecta con molculas intracelulares implicadas
en el mantenimiento del citoesqueleto, la sealizacin celular y el transporte
intracelular (Paredes y col., 2012). El miembro principal de esta familia es la E-
cadherina o cadherina 1. Se ha visto que la prdida de la expresin y de la
actividad de la E-cadherina en clulas epiteliales conduce a un estado invasivo y
metastsico. De hecho, la funcin de la E-cadherina est ausente en muchos
tumores epiteliales, indicando un papel supresivo en la tumorigenesis epitelial,
este hecho, se observa principalmente en casos de cncer avanzado, por ello, se
utiliza como marcador en procesos tumorales (Berx y van Roy, 2009; Canel y
col., 2013). En este sentido, la perdida de E-cadherina no solo provoca una
menor adhesin celular, sino que, induce la transicin epitelio-mesenquima
(EMT), provocando un aumento en la motilidad e invasividad celular, y
resistencia a la apoptosis (Onder y col., 2008).
La E-cadherina se une por su dominio citoplasmtico a la -catenina y a

la p120-catenina formando un complejo proteico que se une a la actina,
estabilizando el citoesqueleto. La prdida de la E-cadherina provoca la
liberacin de la -catenina de la membrana, unindose en el citoplasma al factor
de transcripcin Lef/TcF (Lymphoid enhancer factor/T cell Factor). Este
complejo se trasloca al ncleo, donde, la -catenina-Lef/TcF activa la
transcripcin de genes implicados en procesos de proliferacin, adhesin,
invasin, apoptosis y angiognesis como son los de ciclina D1, CD44, MMPs,
c-myc y VEGF. La localizacin nuclear de la -catenina puede tambin ser
promovida por factores de crecimiento, como EGF, IGF y PDGF, tras la
activacin de las MAPK o PKC.. Diversos estudios han demostrado la elevada
presencia nuclear de -catenina en varios tumores avanzados, convirtindose en
- 24 -
un marcador pronstico para el cncer resistente a quimioterapia y con

capacidad de metastatizar (Thakur y Mishra, 2013).
EGF, IGF,
PDGF
E-Cadherina PKC ERK1/2

-Catenina
E-Cadherina
E-Cadherina
-Catenina -Catenina
Lef/TCF
VEGF
Lef/TCF CD44
-Catenina c-myc
ciclina D1
Figura 7. Va de sealizacin de la E-cadherina/-catenina. (EP).
1.2.3 DEGRADACIN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
La metstasis es un proceso complejo por el cual, las clulas tumorales se

diseminan desde el tumor primario colonizando rganos distantes. Este proceso
consta de varias etapas: invasin y degradacin de la matriz extracelular (ECM),
intravasacin en el torrente sanguneo, extravasacin en rganos distantes y
proliferacin de las clulas tumorales en dichos rganos. Por ello, conocer los
mecanismos implicados en dichas etapas es fundamental para la comprensin del
proceso metastsico. El mecanismo que inicia el proceso metastsico requiere la
- 25 -
activacin de los sistemas proteolticos. Estos sistemas se encargan de degradar

la ECM facilitando la diseminacin de las clulas tumorales.
Entre las molculas ms importantes que participan en este proceso

encontramos la familia de las metaloproteasas de matriz (MMP). Las MMPs
son endopeptidasas dependientes de zinc, que contienen tres dominios tpicos:
pptido-seal, pro-pptido y cataltico. Existen 4 grupos de MMPs: matrilisinas,
gelatinasas, MMPs tpicas y dependientes de furina. A su vez, pueden estar
ancladas a la membrana celular (MT-MMPs) o estar libres en el citoplasma
(Gong y col., 2014b). Las MMPs ms estudiadas en la progresin del cncer de
prstata son la MMP-2 y MMP-9 (Gong y col., 2014b; Hadler-Olsen y col.,
2013). Ambas son gelatinasas ya que contienen un dominio de unin a gelatina,
y se secretan como zimgenos inactivos, activndose tras la ruptura de su pro-
dominio. Su sobre-expresin y actividad estn asociadas con el incremento de la
agresividad tumoral. En pacientes con CP se han asociado a un elevado grado de
Gleason y TMN. Estas gelatinasas degradan la matriz extracelular liberando
molculas bioactivas como VEGF, TGF-, FGF-2, EGF y otras, que
intervienen en la progresin tumoral, activando la migracin celular y la
angiognesis. La MT-MMP1, activada va cAMP, escinde el pro-dominio de la
pro-MMP2, activndola, y a su vez la MMP2 escinde la pro-MMP9, dando
lugar a la forma activa de la MMP9 (Bauvois, 2012; Gong y col., 2014b) (Figura
8).
Las MMPs estn especficamente reguladas por una familia de protenas

pequeas extracelulares llamadas TIMPs (Inhibidores de metaloproteasas de
tejido). Existen 4 miembros, TIMP-1, -2 -3 y -4, y cada uno de ellos inhibe
varias MMPs. La expresin de estos inhibidores se encuentra silenciada en
numerosas lneas celulares de cncer. Los TIMPs tienen funciones
independientes de las metaloproteasas, actuando sobre la angiognesis,
apoptosis, proliferacin, migracin y diferenciacin celular (Sun, 2010). Otra
protena inhibidora de metaloproteasas es RECK (protena rica en cistena
- 26 -
inductora de reversin), la cual se localiza en la membrana plamtica. RECK

bloquea la accin de MMP2, 9 y MT-MMP1 a travs de varios mecanismos,
inhibiendo su actividad proteoltica, regulando su secrecin o secuestrando las
MMPs en la superficie celular (Meng y col., 2008; Xu y col., 2010).
MMP-2
pro-MMP-2
Degradacin TIMPs
de la ECM
Activacin de
molculas
MT-MMP1
MMP-9
RECK
cAMP ATP
TIMPs
pro-MMP-9
proMT-MMP1
Figura 8. Activacin de las metaloproteasas de matriz. (EP).
1.2.4 ANGIOGNESIS
El desarrollo de la red vascular en mamferos se produce a travs de tres

mecanismos principales: vasculognesis (formacin de vasos sanguneos de
novo), angiognesis (generacin de vasos sanguneos a partir de vasos ya
existentes) y remodelacin vascular (incremento del volumen luminal de vasos
formados) (Kubota, 2012). En 1971, Folkman propuso que el crecimiento
tumoral y la metstasis eran dependientes de la angiognesis, de tal forma que si
se bloqueaba la angiognesis se podra frenar la progresin tumoral. En este
- 27 -
sentido se ha comprobado que la aplicacin de terapia anti-angiognica

incrementa la supervivencia de los enfermos de cncer (Kubota, 2012). El
proceso angiognico est sometido a un complejo sistema de control por parte
de factores pro-angiognicos y anti-angiognicos (Welti y col., 2013). (Folkman,
1971)
Uno de los factores pro-angiognicos ms importantes es el VEGF

(Factor de crecimiento del endotelio vascular). Dentro de la familia del VEGF
existen siete miembros diferentes: -A, -B, -C, -D, -E y PlGF (Factor de
crecimiento placentario) (Hoeben y col., 2004). El VEGF-A es el miembro ms
estudiado de la familia y se encuentra sobre-expresado en muchos tumores. Las
clulas tumorales son capaces de liberar VEGF-A incrementando la
permeabilidad vascular y el transporte a travs de los vasos sanguneos, lo que
provoca la salida de protenas plasmticas que inducen el crecimiento, migracin
e invasin de las clulas endoteliales (Prager y col., 2011). El VEGF responde a
diferentes estmulos como la hipoxia, a travs del HIF-1 (Factor inducible por
hipoxia 1); los factores de crecimiento como son EGF, TGF, FGF, PDGF e
IGF; y otras molculas como p53 mutado, Src, ras, citoquinas y xido ntrico
(Kubota, 2012; Welti y col., 2013) (Figura 9).
Actualmente se ha visto que las propias clulas tumorales pueden

diferenciarse en clulas endoteliales, y formar vasos sanguneos tiles; a este
proceso se le denomina mimetismo vascular, y sus mecanismos, a da de hoy,
son poco conocidos (Welti y col., 2013).
- 28 -
Factores
HIF-1 de crecimiento
Src Citoquinas
NO Clulas
p53 tumorales
VEGF
Vasos
sanguneos
VEGFR
Figura 9. Angiognesis y liberacin de VEGF. (EP).
1.3 FAMILIA DEL EGFR
La familia del receptor de crecimiento epidrmico (EGFR) se encarga de

controlar mltiples procesos biolgicos fisiolgicos y patolgicos. La
importancia de esta familia se observa en los ratones knockout generados para
cada miembro de esta familia, los cuales eran no natos o moran en una etapa
temprana tras el nacimiento, al producirse defectos neuronales, cardiacos, seos
y epiteliales en pulmn, piel, pelo y ojos (Lemmon y col., 2014).
- 29 -
1.3.1 RECEPTORES Y LIGANDOS
La familia de los EGFR est formada por cuatro miembros: EGFR1

(HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4). Son
glicoprotenas constituidas por tres partes principales: una parte extracelular
formada por 4 dominios, de unin a ligando (I y III), de dimerizacin (II), y de
transmisin de la seal (IV); una parte transmembrana y una parte intercelular,
con un dominio con actividad tirosina quinasa (V) y un extremo carboxi-
terminal con residuos de tirosina, exceptuando el receptor HER3 que carece de
actividad tirosina quinasa (Carrin-Salip y col., 2012; Roskoski, 2014b) (Figura
10). Los receptores de la familia EGFR se localizan generalmente en epitelio,
mesnquima y clulas neuronales (Roskoski, 2014b).
EGFR HER-2 I HER-3 HER-4

II
IV
V V V
V
Y Y Y
Y Y Y Y
Y Y Y Y
Y
Figura 10. Esquema de la estructura de los receptores de la familia EGFR. (EP).
Los receptores de esta familia son activados por diversos factores de

crecimiento que se unen como ligandos especficos de cada miembro de la familia
(Roskoski, 2014b). Estos ligandos se pueden dividir en 4 grupos segn se
observa en la tabla 2.
- 30 -
Tabla 2. Relacin entre los receptores de la familia del EGFR y sus

ligandos.
Ligandos Receptores
Grupo I EGF (Factor de crecimiento epidrmico) EGFR
EPG (Epigenina)
TGF (Factor de crecimiento transformante )
AFR (Anfiregulina)
Grupo II BTC (Betacelulina) EGFR, HER4
HB-EGF (EGF de unin a heparina)
EPR (Epiregulina)
Grupo III Nrg1 (Neuregulina 1) HER3, HER4
Nrg2 (Neuregulina 2)
Grupo IV Nrg3 (Neuregulina 3) HER4
Nrg4 (Neuregulina 4)
El receptor de HER2 carece de ligando conocido hasta el momento. Se ha

demostrado que MUC4, una mucina transmembrana, modula la expresin de
HER2 estabilizndolo (Kozloski y col., 2010).
Todos los ligandos de la familia del receptor de EGFR se generan como

pro-ligandos que poseen una parte extracelular, un segmento transmembrana y
otro pequeo intercelular. La parte extracelular es el ligando efectivo y se libera
por proteolisis gracias a la accin de la familia de las ADAMs (Desintegrina y
metaloproteasa). Esta familia de metaloproteasas est compuesta por 12
miembros que se encuentran ancladas a la membrana y se activan por Zinc. Las
- 31 -
ADAM10 y ADAM17 son las implicadas en el procesamiento y generacin de

los ligandos de la familia del EGFR (Duffy y col., 2011; Roskoski, 2014b).
Los ligandos de los receptores EGFR suelen actuar en distancias cortas,

de forma autocrina, generalmente sobre los receptores de la misma clula desde
donde se liberaron, aunque tambin pueden actuar de una forma paracrina
sobre otras clulas adyacentes (Roskoski, 2014b).
1.3.2 ACTIVACIN DE LOS RECEPTORES
La estimulacin de los receptores es provocada por la unin del ligando

que induce un cambio conformacional al interactuar con los dominio I y III del
receptor, dejando expuesto el dominio II de dimerizacin, que se unir con el
mismo o distintos miembros de la familia (homo u heterodimerizacin,
respectivamente) (Bertelsen y Stang, 2014; Lemmon y col., 2014). Los
receptores EGFR y HER4 forman fuertes homodimeros tras la unin del
ligando, sin embargo, HER2 y HER3 solo dimerizan con otros miembros de la
familia, sin llegar a formar homodmeros (Lemmon y col., 2014). HER2, a pesar
de carecer de ligandos, es el receptor prioritariamente elegido para dimerizar
con el resto de miembros de la familia, ya que su dominio de dimerizacin esta
constitutivamente expuesto y se piensa que no sufre proceso de internalizacin o
que este es seguido de un rpido proceso de reciclaje (Bertelsen y Stang, 2014;
Lemmon y col., 2014).
Tras la unin del ligando al receptor, y la dimerizacin posterior, los

receptores se autofosforilan en los residuos de tirosina del dominio
citoplasmtico, generando sitios de unin para protenas adaptadoras o enzimas
que se encuentran en los siguientes pasos de las cascadas de sealizacin. Dichas
protenas contienen dominios de unin a Src (SH2) o de unin a fosfotirosinas
(PTB). Estas protenas activan varias cascadas de sealizacin dependiendo del
- 32 -
dmero formado por los receptores al activarse, siendo los ms frecuentes los
que aparecen en la tabla 3 (Arteaga, 2002; Bertelsen y Stang, 2014; Kong y col.,
2008; Way y Lin, 2005; Zaczek y col., 2005):
Tabla 3. Relacin entre los dmeros de receptores de la familia del EGFR y

las vas de sealizacin que activan.
DMERO VIA DE SEALIZACIN QUE ACTIVA
EGFR/EGFR PLC, PI3K/AKT, JAK/STAT y MAPK
EGFR/HER2 PLC y MAPK
EGFR/HER3 PLC y PI3K
HER2/HER3 MAPK y PI3K/AKT
HER2/HER4 MAPK
HER4/HER4 PI3K/AKT
Esta maquinaria de sealizacin regula procesos implicados en la

progresin tumoral: EMT, angiognesis, adhesin, migracin, diferenciacin y
proliferacin celular (Figura 11) (Roskoski, 2014b).
- 33 -
EGFR-EGFR
EGFR I I
II II
EGF
EGF
IV IV
V V
V
Y
Y
Y
p-Y Y -p
p-Y Y -p
p-Y Y -p
PI3K-AKT MAPK PLC JAK-STAT
Angiognesis, adhesin, migracin, diferenciacin

y proliferacin celular
Figura 11. Activacin de los receptores de la familia EGFR. (EP).
1.3.3 TRANSACTIVACIN DE LA FAMILIA DE LOS EGFRS

MEDIADA POR GPCR
En 1996, un estudio llevado a cabo por Daub y colaboradores, demostr

que distintos agonistas de GPCRs eran capaces de fosforilar a los receptores
EGFR y HER2, activndolos. Actualmente, se conocen multitud de GPCRs
capaces de transactivar a los receptores de la familia EGFR.
La transactivacin llevada a cabo por los GPCRs (Figura 12) depende de

varios factores, entre ellos, la clase de GPCR, el tipo celular y el ambiente
- 34 -
extracelular. Existen dos tipos de mecanismos, dependiente e independiente

de ligando. La transactivacin dependiente de ligando o Triple-membrane
passing signal mechanism (TMPS), implica tres pasos. Primero, se produce la
activacin de las metaloproteasas, MMPs o ADAMs, por parte de segundos
mensajeros, como Src, que activan los GPCRs. En segundo lugar, las
metaloproteasas provocan la liberacin de los ligandos anclados a la membrana,
y por ltimo, estos ligandos se dirigirn a los receptores unindose a ellos y
activndolos (George y col., 2013; Sur y Agrawal, 2014). La transactivacin de
los EGFR mediada por las ADAM10 y 17 est directamente implicada en el
desarrollo, crecimiento y progresin de distintos cnceres (Duffy y col., 2011;
George y col., 2013).
El segundo mecanismo de transactivacin se lleva a cabo en el interior

celular sin necesidad de ligando. El GPCR activa molculas efectoras como Src,
Ca2+, PKC, PyK2 (Proteina tirosina quinasa 2), arrestinas y especies reactivas
de oxgeno, que desencadenan la fosforilacin de los residuos de tirosina del
dominio citoplasmtico del receptor activando las cascadas de sealizacin
consecuentes (George y col., 2013; Sur y Agrawal, 2014).
En nuestro grupo de investigacin, se ha demostrado como el pptido

intestinal vasoactivo (VIP), a travs de sus receptores de membrana, provoca la
transactivacin de EGFR y HER2, en lneas celulares de cncer de prstata y de
mama (Sotomayor y col., 2007; Valdehita y col., 2009). VIP pertenece a una
superfamilia que incluye al glucagn, secretina y otros pptidos similares, y
cuyos receptores son GPCR. El tratamiento con VIP en lneas celulares de CP
provoca la transactivacin independiente de ligando de EGFR y HER2 a
tiempos cortos, as como, dependiente de ligando a tiempos ms largos de
tratamiento (Sotomayor y col., 2007).
- 35 -
Ligandos
ADAM
GPCR
EGFR EGFR

Src
p-Y Y -p
p-Y Y -p
Ca2+ Pro-ligandos
p-Y Y -p p-Y Y -p
PKC p-Y
p-Y Y -p Y -p
PyK2
Arrestinas
ROS Transactivacin dependiente de ligando
Transactivacin independiente de ligando
Figura 12. Transactivacin de los receptores EGFR por GPCR. (EP).
1.3.4 FAMILIA EGFR Y CNCER
La desregulacin de los miembros de la familia EGFR est implicada en

varias patologas: cncer, diabetes, autoinmunidad, inflamacin, enfermedades
cardiovasculares y nerviosas. En cncer contribuyen de manera relevante a la
proliferacin, migracin, transformacin, angiognesis e invasin de las clulas
tumorales (Androutsopoulos y col., 2013). Varios estudios remarcan la
importancia de los receptores de EGF en cncer, en concreto de EGFR y HER2.
La sobre-expresin de estos receptores ha sido implicada en la adquisicin de la
independencia andrgenica en el CP, correlacionndose con un peor prosnstico
de la enfermedad. Se estima que entre un 40-80% de los tumores prostticos
sobre-expresan EGFR. La sealizacin por EGFR se encuentra hiperactivada
por una sobreproduccin de ligandos y/o receptores, por activacin constitutiva
de los receptores, o debido a la transactivacin producida por IGF-1R, GPCRs y
receptores de citoquinas (Huang y Chang, 2010).
- 36 -
La gran importancia de la famila EGFR en cncer ha llevado a la

generacin de tratamientos especficos. Muchos de ellos han sido aprobados
para su utilizacin en pacientes, y se pueden dividir en dos grupos principales:
Inhibidores de la actividad tirosina quinasa de los receptores, y anticuerpos
monoclonales dirigidos frente a dichos receptores (Tabla 4) (Roskoski, 2014a;
Roskoski, 2014b):
Tabla 4. Tratamientos aprobados para pacientes con cncer contra los

receptores de la familia del EGF.
Tipo de Nombre Diana Ao de

tratamiento aprobacin
Pequeos Afatinib/Gilotrif EGFR 2013
inhibidores Erlotinib/Tarceva EGFR 2004
Gefitinib/Iressa EGFR 2003
Lapatinib/Tykerb EGFR y HER2 2007
Anticuerpos Ado-trastuzumab HER2 2013
monoclonales emtansine/Kadcyla
Cetuximab/Erbitux EGFR 2004
Panitumumab/Vecibix EGFR 2006
Pertuzumab/Omnitarg HER2 2012
Trastuzumab/Herceptin HER2 1998
1.4 HORMONA LIBERADORA DE LA HORMONA DEL

CRECIMIENTO (GHRH)
A finales de los aos 60 y principios de los 70, los Doctores Andrew

Schally y Roger Guillemin, aislaron, caracterizaron y secuenciaron las
hormonas reguladoras hipotalmicas. La primera hormona reguladora
- 37 -
hipotalmica en ser secuenciada fue la TRH (Hormona liberadora de

tirotropina), la segunda fue la GnRH (Hormona liberadora de gonadotropina), y
la tercera la somatostatina. La existencia de GHRH se comenz a sugerir a
principios de 1961 por Reichlin. Este investigador realiz lesiones en el
hipotlamo de ratas, provocando la disminucin de hormona del crecimiento
(GH) en la hipfisis, lo que indicaba la existencia de una sustancia del
hipotlamo que provocaba la liberacin de la GH en la hipfisis (Frohman y
Szabo, 1981).; Reichlin, 1961)
En 1981, se demostr la presencia ectpica de la neurohormona GHRH

en tumores pancreticos (Frohman y Szabo, 1981). Un ao ms tarde, dos
grupos independientes identificaron GHRH en hipotlamo animal y humano
(Guillemin y col., 1982; Rivier y col., 1982). El grupo de Rivier encontr un
nico pptido formado por 40 aminocidos, mientras que, el grupo de Guillemin
aisl tres pptidos de 37, 40 y 44 aminocidos, en una proporcin de 22%, 12% y
64%, respectivamente. Al comparar dichos pptidos, se observ que los 40
aminocidos descubiertos por el grupo de Rivier coincidan con los primeros del
pptido de 44 aminocidos del grupo de Guillemin (Guillemin y col., 1982;
Rivier y col., 1982). Posteriormente, se caracteriz completamente GHRH, su
forma madura est constituida por 44 aminocidos que aparecen representados
en la figura 13. Sin embargo, la accin biolgica de GHRH reside en los 29
ltimos aminocidos. Se ha comprobado que la presencia de la tirosina en
posicin uno es clave para la unin de la hormona a su receptor (Frohman y col.,
1989)
HO - Tyr - Ala - Asp - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys -
Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gln - Asp -
Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu - Ser - Asn - Gln - Glu - Arg -
Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2
- 38 -
Figura 13. Secuencia de la hormona liberadora de la hormona del

crecimiento, GHRH. Se marcan subrayados los 29 aminocidos que
confieren la accin biolgica a GHRH.
En 1984, se caracteriz la estructura de GHRH en las hipfisis de

diferentes mamferos: cerdo, cabra, oveja, vaca y rata. Al comparar dichas
estructuras con la obtenida en hipfisis humana, se observa que todas presentan
44 aminocidos excepto la GHRH de rata que presenta 43 aminocidos (Figura
14). Se observa, adems, como la GHRH de cerdo es la que presenta mayor
homologa con la humana difiriendo tan solo en 3 aminocidos, mientras que, la
GHRH de rata es la que presenta una menor homologa, diferencindose en 14
aminoacidos de la GHRH humana (Ling y col., 1984).
hGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M S R Q Q G E S N Q E R G A R A R L - NH2
pGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M S R Q Q G E R N Q E Q G A R V R L - NH2
c, bGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M N R Q Q G E R N Q E Q G A K V R L - NH2
oGHRH Y A D A I F T N S Y R K I L G Q L S A R K L L Q D I M N R Q Q G E R N Q E Q G A K V R L - NH2
rGHRH H A DA I F T S S Y R R I LG Q LYA R K L L H E I M N RQ Q G E R N Q E Q R S R F N - NH2
Figura 14. Comparativa de la estructura de la GHRH humana (h), porcina

(p), caprina (c), bovina (b), ovina (o) y murina (r).
El gen de la GHRH se encuentra localizado en el cromosoma 20

(20q11.2) del genoma humano (Pezzolo y col., 1994), con un tamao de 10 kb.
Est formado por 5 exones con 750 pares de bases, de los cuales el exn 3 y
parte del exn 4 codifican para el pptido completo, sin embargo, solo el exn 3
codifica para la parte biolgicamente activa del pptido (Frohman y col., 1989).
GHRH se sintetiza inicialmente como un precursor inactivo de 104

aminocidos que sufre un procesamiento post-transcripcional. Este precursor es
- 39 -
escindido en tres etapas por la furina y la proprotena convertasa 1 (PC1),

obteniendo finalmente la GRHR activa y el GHRH-RP (Pptido relacionado con
GHRH) tal como se muestra en la figura 15 (Posner y col., 2004).
Gen GHRH
5 GHRH GHRH-RP 3 cDNA GHRH
proGHRH
proGHRH
1 19 30 73 104
Furina
preproGHRH
20 30 73 104
PC1
preGHRH
31 73 104
GHRH GHRH-RP
31 73 74 104
Figura 15. Procesamiento pre y post-transcripcional de la hormona

liberadora de la hormona del crecimiento, GHRH. (EP).
- 40 -
GHRH pertenece a una familia de pptidos que tienen cierta homologa

estructural y biolgica, entre los que se encuentran: el pptido intestinal
vasoactivo (VIP), el pptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria
(PACAP), la secretina, el glucagn y el neuropptido Y. Adems, esta familia de
pptidos comparte homologa entre sus receptores, lo que conlleva una actividad
cruzada, pudiendo unirse entre ellos (Csernus y col., 1999b).
Aunque GHRH fue aislada inicialmente en tumores pancreticos,

posteriormente se localiz en la hipfisis humana y animal. Actualmente se sabe
que GHRH se localiza ectpicamente en ciertos tejidos sanos: linfocitos, tero,
ovario, testculos, placenta, corteza cerebral, hipfisis, rin, prstata, hgado y
pulmn (Barabutis y Schally, 2010). Adems, GHRH se ha localizado en
diversos tipos de tumores y lneas celulares tumorales: ovario, endometrio,
mama, prstata, estmago, pancreas, pulmn, hueso, coln y glia (Busto y col.,
2002; Fainstein Day y col., 2007; Garcia-Fernandez y col., 2003; Halmos y col.,
2002; Khorram y col., 2001; Kiaris y col., 1999).
1.4.1 ACCIONES BIOLGICAS DE GHRH
Desde su descubrimiento a principios de los 80, se han investigado las

posibles acciones biolgicas de GHRH en el organismo, debido a su presencia en
diferentes tejidos. La funcin principal de GHRH se localiza en la hipfisis.
GHRH es liberada desde el hipotlamo y se dirige hacia el lbulo anterior de la
hipfisis estimulando la secrecin de la hormona del crecimiento (GH)(Kiaris y
col., 2011b). Esta hormona se dirige directamente a rganos diana o al hgado
estimulando la secrecin de IGF, el cual vuelve al hipotlamo regulando
negativamente la liberacin de GHRH. Se conocen otras acciones biolgicas de
GHRH, que se detallan a continuacin para diferentes rganos o sistemas:
- 41 -
Efectos en tejido sano
Sistema Nervioso Central
Ayuda a la consolidacin de la memoria (Hallschmid y col., 2011)

Mejora el deterioro cognitivo en adultos (Baker y col., 2012)
Incrementa los niveles de GABA (cido gamma-aminobutrico)
(Friedman y col., 2013)
Estimula las neuronas reguladoras del sueo en el hipotlamo (Peterfi y
col., 2010)
Provoca la produccin y liberacin de GH en la hipfisis (Kiaris y col.,
2011b)
Activa la cascada de sealizacin de las MAPKs en la hipfisis (Pombo y
col., 2000)
Glndula suprarrenal
Facilita la liberacin del cortisol tras una situacin de hipoglucemia
(Perras y col., 2002)
Sistema cardiovascular
Promueve la supervivencia de los cardiomiocitos (Granata y col., 2009)
Tiene un papel protector y regenerativo tras un infarto de miocardio
(Barabutis y Schally, 2010)
Epitelios
Mejora el cierre de heridas provocadas por traumas o ciruga (Dioufa y
col., 2010; Kiaris y col., 2011a)
- 42 -
Pncreas
Estimula la proliferacin y supervivencia de islotes pancreticos
(Barabutis y Schally, 2010; Ludwig y col., 2010)
Sistema inmune
Regula la diferenciacin del sistema inmune y la produccin de citoquinas
(Kiaris y col., 2011b)
Estimula la secrecin de IL-17 en clulas mononucleares de sangre
perifricas (PBMC) (Stepien y col., 2010)
Sistema reproductor
Regula la diferenciacin celular, apoptosis y maduracin de clulas
germinales (Moretti y col., 2002)
Promueve la maduracin folicular (Moretti y col., 1990)
Regula la espermatognesis actuando sobre las clulas de Leydig
(Ciampani y col., 1992)
Tejido adiposo
Reduce el tejido adiposo visceral (Makimura y col., 2012)
Fibroblastos
Induce la proliferacin y migracin de fibroblastos (Kiaris y col., 2001)

Incrementa la expresin de la protena -SMA en fibroblastos,
induciendo la diferenciacin en miofibroblastos (Kiaris y col., 2011a)
Efectos en tejido tumoral
Generales
Promueve la actividad de la telomerasa en clulas tumorales (Kiaris y

Schally, 1999)
- 43 -
Prstata
Puede inducir la proliferacin de clulas de cncer de prstata

dependientes e independientes de andrgenos, al activar la va
GHRH/GH/IGF (Chopin y Herington, 2001)
Mama
Estimula la proliferacin de las clulas de cncer de mama activando la

va Ras/Raf/MAPK (Siriwardana y col., 2006)
Pulmn
Estimula la proliferacin de clulas tumorales y la produccin de IGF-I y

II (Kiaris y col., 1999)
Incrementa la expresin de la xido ntrico sintasa (Barabutis y col.,
2011)
Crvix
Activa las protenas JAK y STAT3 (Siejka y col., 2010a)

Ovario y endometrio
Puede inducir la proliferacin de clulas de cncer de ovario y

endometrio, al activar la va GHRH/GH/IGF (Kahn y col., 1999)
Neuroendocrino
Estimula la proliferacin tumoral, as como, la liberacin de VEGF y

cromogranina A (Stepie y col., 2009)
Linfomas
Puede inducir la malignidad en linfomas, al activar la va

GHRH/GH/IGF (Heath., 2005)
- 44 -
1.4.2 RECEPTORES DE GHRH
El receptor de GHRH (GHRH-R) es un receptor acoplado a protena G

(GPCR) de tipo II o B (Mayo, 1992). Esta familia de receptores, a la que
pertenecen otros como los receptores de VIP y PACAP, presenta una estructura
con varios intrones que les permiten la formacin de numerosas variantes de
splicing alternativo. El gen de GHRH-R est localizado en el cromosoma 7p14-
15 y se encuentra codificado por 1269 pb, contiene 13 exones separados por
intrones de diferentes tamaos, que alargan su longitud hasta 15 kb (Gaylinn,
2002; Gaylinn y col., 1994). En el promotor del gen se han encontrado multitud
de sitios de unin para factores de transcripcin como Pit-1, Oct-1, Brn-2, NF-
1, cAMP (CRE) y receptor de estrgenos (ERE) (Petersenn y col., 1998). El
GHRH-R que inicialmente se localiz en la hipfisis (p-GHRH-R) posee un
dominio extracelular con el extremo amino, como primera parte de la molcula,
7 dominios transmembrana, 3 bucles extracelulares y 3 intracelulares, y un
dominio intracelular que acaba en el extremo carboxi-terminal (Figura 16).
- 45 -
1
-NH2
-COOH
423
Figura 16. Estructura del receptor de GHRH presente en hipfisis. Las

flechas separan las partes codificadas por cada uno de los trece exones.
(EP).
En 1995, Tang y colaboradores identificaron la presencia de 3 variantes

de GHRH-R humano en muestras de tejido normal y tejido tumoral de hipfisis
y ovario. La primera variante tena una secuencia idntica al conocido p-
GHRH-R, pero la segunda y tercera eran formas truncadas de la primera. En el
ao 2000, se aislaron y secuenciaron las diferentes variantes del GHRH-R
(Rekasi y col., 2000). Se identificaron 4 variantes de splicing del receptor: SV1,
SV2, SV3 y SV4. La variante SV1, presenta una homologa de un 99% con
respecto al fragmento codificado del exn 3 al 13 p-GHRH-R, sin embargo, los
primeros 334 nucletidos son completamente diferentes. Esta diferencia se
produce debido a la insercin del intrn 1 junto con la desaparicin de los tres
primeros exones por una modificacin del sitio de splicing. La protena formada
es completamente funcional ya que contiene la parte distal del primer dominio
- 46 -
extracelular, los dominios transmembrana, los bucles extra- e intracelulares y el

extremo carboxi-terminal del p-GHRH-R. La variante SV2 tiene menor
homologa que SV1, ya que adems de perder los exones del 1 al 3, pierde el
exn 7. Esta variante da lugar a una protena funcional pero que solo contiene
los dos primeros dominios transmembrana, el primer bucle intracelular y la
mayora de los bucles extracelulares. La variante SV3, adems de perder los
mismos exones que SV2, tiene incompleta la secuencia intrnica inicial. La
variante SV4 pierde los exones 5 y 6, adicionalmente. El receptor que da lugar a
partir de estas dos ltimas variantes no es maduro, ya que pierde los dominios
transmembrana, los bucles y el extremo carboxi-terminal. La secuencia
intrnica inicial, que presentan todas la variantes, codifica para el extremo N-
terminal de la protena, de lo cual carece la SV3 al tenerlo incompleto (Halmos y
col., 2002). El proceso de splicing de las diferentes variantes esta esquematizado
en la figura 17.
- 47 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gen
GHRH-R
5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3 cDNA
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 p-GHRH-R
5 Intron 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3 cDNA
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 SV1
5 Intron 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 3 cDNA
TM1 TM2
SV2
5 Intron 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 3 cDNA
SV3
5 Intron 3 4 8 9 10 11 12 13 3 cDNA
SV4
Figura 17. Esquema del gen de GHRH-R y de los cDNAs de p-GHRH-R y

SVs. Se indican las regiones correspondientes a los exones con nmeros, los
dominios transmembrana (TM) y las zonas de splicing. (EP).
Los receptores de GHRH se han localizado en varios tumores humanos:

mama (50%), ovario (80%), prstata (75%), adenoma hipofisario (75%),
glioblastoma (100%) y meniangioma (100%) (Schulz y Rcken, 2006). Los
receptores de GHRH (p-GHRH-R y SVs) estn presentes en tejido normal y
tumoral. El p-GHRH-R est altamente expresado en hipfisis, y adems, se
encuentra ms expresado en tejidos tumorales, si lo comparamos con sus
correspondientes tejidos normales en rin, pulmn, hgado y prstata. Por otro
lado, los receptores SVs se encuentran ms expresados en tejidos tumorales que
en tejidos sanos, siendo la variante SV1 la mayoritaria (Havt y col., 2005).
- 48 -
Estudios realizados en cncer de prstata humano indican que el receptor de

hipfisis se encuentra sobre-expresado en el 86% de los cnceres de prstata que
expresan GHRH-R, as mismo, las variantes se sobre-expresan en un 65% para
SV1, en un 60% para SV2 y en un 15% para SV4 (Halmos y col., 2002).
1.4.3 SEALIZACIN DE GHRH
La sealizacin producida por GHRH no ha sido completamente

discernida, aunque si se conocen los efectos que produce. GHRH hipotalmica es
liberada de las clulas neurosecretoras del ncleo arqueado presente en el
hipotlamo, dirigindose al lbulo anterior de la hipfisis donde se une a sus
receptores por el dominio extracelular. Esta unin produce un cambio
conformacional en el receptor, lo que provoca que el receptor interacte con la
protena G heterotrimrica (, y ), promoviendo el intercambio de guanil
nucletidos y provocando la disociacin de la subunidad y el dmero
(Martin y col., 2005). Existen 16 tipos de G acoplados a diferentes efectores
(Dorsam y Gutkind, 2007). En este sentido GHRH es capaz de activar dos de
ellas, la protena Gs y Gq.
La estimulacin del receptor de GHRH por su ligando puede activar la

subunidad de la protena Gs heterotrimrica, la cual activa la enzima adenilato
ciclasa que transforma el ATP en cAMP. Esto provoca la acumulacin de cAMP
que se une a las subunidades reguladoras de la Protena Kinasa dependiente de
cAMP (PKA), permitiendo la disociacin de las subunidades catalticas. Estas
subunidades fosforilan protenas de membrana e intracelulares provocando la
activacin de canales inicos, despolarizacin de la membrana y una entrada de
Ca2+ que induce la liberacin de la hormona del crecimiento (GH) de las clulas
somatotropas (Mayo y col., 2000; Zeitler y Siriwardana, 2000). GH se dirige a
sus sitios diana: msculo, hueso, tejido nervioso, adiposo y sistema inmune,
estimulando el metabolismo, proliferacin y diferenciacin celular. As mismo,
- 49 -
se dirige al hgado donde induce la produccin de factor de crecimiento

semejante a la insulina tipo I (IGF-I) heptico, que a su vez, puede actuar sobre
el crecimiento de clulas normales y tumorales (Kiaris y col., 2011b) (Figura 18).
Hipotlamo
GHRH
Hipfisis
GH
Hgado
GH
Sistema inmune
IGF-I
Hueso Msculo
Sistema nervioso
Clulas tumorales
Figura 18. Principales tejidos regulados directa o indirectamente por

GHRH. (EP).
Las subunidades catalticas de PKA son capaces de fosforilar a diversas

protenas, entre las que encontramos a CREB, la protena de unin al elemento
regulador de cAMP. CREB se transloca al ncleo y se une al coactivador
p300/CBP, juntos inducen la transcripcin de genes con el elemento respuesta
- 50 -
CRE en su promotor como es el caso de jun, fos, pit-1 y ghrhr (Frohman y

Kineman, 2002). La protena que se genera tras la traduccin de pit-1 se unir al
promotor del gen de GHRH provocando su transcripcin y posterior
traduccin. De esta manera, GHRH es capaz de incrementar su propia expresin
y la de su receptor, tanto en clulas normales como tumorales. La GHRH
sintetizada de novo es liberada ejerciendo sus efectos mediante mecanismos
autocrinos y paracrinos. Por otro lado, la estimulacin de PKA por cAMP puede
activar la cascada de las MAPKs, a travs de la protena Ras que, a su vez,
activa a Raf /MEK/ERK (Kiaris y col., 2011b; Pombo y col., 2000; Siriwardana
y col., 2006). La sealizacin mediada por la protena Gs est esquematizada en
la figura 19.
GHRH-R
GTP AC
s
GTP ATP
GDP cAMP
Pit-1
Pit-1
Ras PKA
CREB
Raf p- CREB
Pit-1
MEK Jun
Fos
p300 Pit-1
p-
ERK CBP CREB Ghrhr
Ghrh
Pit-1
Figura 19. Sealizacin de GHRH a travs de protena Gs. (EP).
- 51 -
GHRH, a travs de su receptor, puede activar tambin a la protena Gq,

que libera la subunidad subunidad q capaz de activar la fosfolipasa C (PLC)
(Frohman y Kineman, 2002; Kiaris y col., 2011b). Esta enzima cataliza la
hidrlisis del fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) en diacilgliceril (DAG) e inositol
trifosfato (IP3). Por un lado, el DAG se queda unido a la membrana activando a
las PKCs, que a su vez, pueden activar a ERK a travs de Raf (Zeitler y
Siriwardana, 2000). Por otro lado, el IP3 se dirige al retculo endoplasmtico
unindose a su receptor y activando los canales de calcio, provocando un
incremento de la concentracin citoslica del mismo, que activa a protenas
dependientes de calcio como Ras (Siriwardana y col., 2006) (Figura 20).
El dimero , independientemente del tipo de subunidad a la que

acompae, es liberado tras la estimulacin de GHRH-R por su ligando, es capaz
de activar a PLC y regular la actividad de canales inicos (Pombo y col., 2000).
Mediante la PLC se produce a su vez, la activacin de PKC y con ello se
estimula la cascada de sealizacin de MAPK (Figura 20).
GHRH-R
q PIP2 DAG PKC

PLC-/

Ca2+
IP3 Ras Raf
Ca2+
Ca2+ Ca
2+
MEK
IP3
ERK
Retculo Endoplasmtico
Figura 20. Sealizacin de GHRH a travs de la subunidad Gq y del dmero
. (EP).
- 52 -
Un hecho destacable, es que, se ha comprobado que en ausencia del

ligando GHRH, el receptor SV1 es capaz de activar seales mitognicas en
clulas de cncer de endometrio, teniendo dicho receptor una activacin
dependiente e independiente de ligando (Kiaris y col., 2003); este hecho cobra
una mayor importancia en clulas tumorales ya que son las que sobre-expresan
el receptor SV1.
1.4.4 ANTAGONISTAS DE GHRH
En 1985, el Dr. P. Robberecht sintetiz el primer antagonista de la

GHRH, reemplazando en su estructura el aminocido Ala de la posicin 2, por la
D-Arg, de esta forma consegua bloquear la liberacin de GH en ratas
(Robberecht y col., 1985). Sin embargo, este antagonista no lograba bloquear
por completo la actividad del receptor. Dese 1994, el grupo del Dr. A.V. Schally
ha sintetizado antagonistas y agonistas de GHRH. Los primeros compuestos
antagonistas, MZ-4-71 y MZ-5-156, eran entre 7 y 19 veces ms potentes que el
antagonista de Robberecht (Zarandi y col., 1994). Posteriormente, se han
desarrollado varios antagonistas entre los que encontramos el JV-1-38 (Varga y
col., 1999), el JMR-132 (Buchholz y col., 2007), y la nueva serie de antagonistas
MIA-602, -606 y -690 (Fahrenholtz y col., 2014). Para la sntesis de estos
compuestos se han ido realizando diferentes sustituciones en los aminocidos de
la estructura de GHRH, que mejoraban distintos aspectos de los antagonistas
(Schally, 2008; Zarandi y col., 1994):
La sustitucin de Ala por D-Arg en posicin 2, que poseen todos los

antagonistas, les otorga la capacidad antagnica.
Las sustituciones realizadas al introducir la D-Arg, Har o Agm en los

aminocidos 28 y 29, proporcionan la estabilidad metablica de los
compuestos.
- 53 -
El intercambio de Gly por Abu, en posicin 15, estabiliza la estructura

central (hlice alfa) del antagonista.
La sustitucin del aminocido Met por Nle en posicin 27, ayuda a evitar
la inactivacin oxidativa del antagonista.
El resto de intercambios mejoran la afinidad por los receptores de

GHRH, la capacidad de inhibir la liberacin de GH y la duracin de este
efecto in vitro e in vivo.
En la tabla 5 vienen representadas las sustituciones producidas en los

antagonistas del Dr. Schally en comparacin con el antagonista de Robberech y
la estructura del pptido GHRH.
- 54 -
Tabla 5. Estructuras comparativas del fragmento funcional de GHRH (1-29)-NH2 y distintos
antagonistas. Los aminocidos que no varan entre las diferentes estructuras se representan con puntos. Los
sustituyentes son abreviados como: Abu, -aminobutirico; Ac, acetil; Ada, acido 12-aminododecanoico; Agm,
4-aminobutil-guanidina; Cpa, paracloro-fenilalanina; Fpa5, pentafluoruro-fenilalanina; Har, homoarginina;
Universidad de Alcal
Ibu, isobutiril; Me-Ala, N-metil-alanina; Nle, norleucina; Orn, ornitina; PhAc, fenilacetil; Tyr(Me), O-
metiltirosina.
hGHRH
(1-29)NH2 H Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg NH2
- 55 -
Antagonista
Ac D-Arg NH2
de Robberecht
MZ-4-71 Ibu D-Arg Phe(4-Cl) Abu Nle Agm
Phe(4-Cl)
MZ-5-156 PhAc D-Arg Abu Nle Agm
Phe(4-Cl)
JV-1-38 PhAc D-Arg Har Tyr (Me) Abu Nle D-Arg Har NH2
Phe(4-Cl)
JMR-132 PhAc D-Arg Ala Har Tyr (Me) His Abu His Nle D-Arg Har NH2
MIA-602 PhAc-Ada D-Arg Fpa5 Ala Har Tyr (Me) His Orn Abu His Orn Nle D-Arg Har NH2
MIA-606 PhAc-Ada D-Arg Fpa5 Me-Ala Har Tyr (Me) His Orn Abu His Orn Nle D-Arg Agm
MIA-690 PhAc-Ada D-Arg Cpa Ala Har Fpa5 His Orn Abu His Orn Nle D-Arg Har NH2
Introduccin
La eficacia antitumoral de los antagonistas ha sido probada mediante

estudios in vitro e in vivo, en los que se ha demostrado una significativa
supresin del crecimiento de varios cnceres experimentales: prstata
(Fahrenholtz y col., 2014), mama (Buchholz y col., 2007), ovario (Schally y
Varga, 2006), pncreas (Szepeshazi y col., 2000b), endometrio (Engel y col.,
2005) carcinomas de clulas renales (Schally y Varga, 2006), colorectal
(Szepeshazi y col., 2000a), de clulas pequeas y no pequeas de pulmn (Kiaris
y col., 1999), sarcomas de hueso (Braczkowski y col., 2002), glioblastomas
malignos (Kiaris y Schally, 1999) y linfoma no Hodgkin (Heath, 2005).
Actualmente, la nueva serie MIA muestra unos efectos mucho ms potentes, in
cluso uno de los antagonistas, en concreto MIA-602, se encuentra en la fase
inicial de un ensayo clnico para cncer de prstata, de mama y de ovario. Los
antagonistas de GHRH inhiben la secrecin de GH y bloquean la unin de
GHRH a sus receptores en clulas tumorales, de esta forma consiguen suprimir
la produccin heptica de IGF-I y la propia formacin de GHRH y sus
receptores por parte de la clula tumoral. Se ha visto que el bloqueo producido
por los antagonistas provoca consecuencias a diferentes niveles en la
sealizacin celular de las clulas tumorales:
Apoptosis: incrementan la expresin de factores pro-apoptticos como

Bax, caspasas -3,-8,-9, PARP y FAS, y disminuyen la expresin de la
protena anti-apopttica, Bcl2 (Hohla y col., 2009).
Ciclo celular: incrementan los niveles de p21 y p53 (Hohla y col., 2009;
Stangelberger y col., 2012).
Proliferacin: disminuyen la expresin de PCNA y Ki67 (Siejka y col.,

2010b).
Invasin y adhesin: reducen los niveles de las formas activas de MMP-

2 y -9, e incrementan los de la caveolina-1 (Bellyei y col., 2010).
- 56 -
Factores de transcripcin: disminuyen la expresin de NFB y

pSTAT3 (Bellyei y col., 2010).
Quinasas: reducen la expresin de ERK1/2, Akt, JAK, FAK y regulan las

distintas isoformas de PKC (Kanashiro y col., 2004; Siejka y col., 2010b).
Factores de crecimiento: disminuyen los niveles de IGF-I y II, GH,

VEGF y bFGF (Schally, 2008; Stangelberger y col., 2005a).
Receptores de factores de crecimiento: disminuyen la expresin de

EGFR, HER-2, HER-3, VEGF-R1 y VEGF-R2 (Guo y col., 2010).
Proto-oncogenes: reducen los niveles de K-Ras, c-fos y c-jun (Kanashiro

y col., 2004).
Enzimas: disminuyen la expresin de iNOS, COX-2 y COX-1v

(Barabutis y col., 2011).
Citoquinas: reducen los niveles de interfern- (IFN-) (Siejka y col.,

2004).
Actualmente, se estudian diferentes usos teraputicos de los antagonistas

de GHRH en enfermedades no tumorales. Los antagonistas de GHRH son
capaces de atravesar la barrera hematoenceflica, y reducir la agregacin de -
amiloide y filamentos T en la enfermedad de Alzheimer, restaurando el
metabolismo neuronal normal (Jaszberenyi y col., 2012). Adems, se ha
comprobado que en la acromegalia, el tratamiento con los antagonistas reduce la
secrecin de GH e IGF-I (Kovacs y col., 1997).
El grupo del Dr. Schally ha generado tambin varios agonistas de
GHRH, a los cuales se les ha atribuido diversos usos teraputicos, como,
mejorar la supervivencia y proliferacin de islotes pancreticos en ratones
diabticos (Ludwig y col., 2010) e inducir la supervivencia de los cardiomiocitos
(Granata y col., 2009).
- 57 -
2. OBJETIVOS
Objetivos Universidad de Alcal
En la introduccin de este trabajo se han mencionado aspectos clave para

el desarrollo y progresin tumoral del cncer de prstata, por tanto, profundizar
en los mecanismos de sealizacin implicados es una pieza clave en la bsqueda
de nuevas dianas teraputicas. En este sentido, se ha visto que el pptido GHRH
y sus receptores pueden estar implicados en la progresin tumoral, as como los
beneficios que muestran el tratamiento con antagonistas de GHRH sobre
tumores experimentales. En base a los antecedentes sealados nos proponemos
ahondar en los mecanismos de sealizacin a travs de los cuales, GHRH est
implicado en los diferentes procesos de la progresin del CP. Consideramos que
estas aproximaciones experimentales pueden contribuir a optimizar estrategias
teraputicas dirigidas a combatir el avance de la enfermedad.
Los objetivos de la presente Tesis Doctoral se resumen en los siguientes

apartados:
1. Determinar y comparar la presencia de GHRH y sus receptores, as

como la localizacin de estos en tres lneas celulares de prstata
representativas de un estado no tumoral, RWPE-1, y de un estado
tumoral andrgeno dependiente, LNCaP, e independiente, PC3.
2. Estudiar, en lneas celulares, el efecto de GHRH y de sus

antagonistas en procesos implicados en la progresin del cncer de
prstata:
2.1. Actividad metablica

2.2. Proliferacin celular
2.3. Ciclo celular y apoptosis
2.4. Adhesin celular
2.5. Migracin celular
2.6. Expresin y actividad de las principales MMPs
2.7. Angiognesis
- 61 -
Objetivos Universidad de Alcal
2.8. Neurodiferenciacin
3. Determinar la implicacin de GHRH y sus antagonistas sobre la

sealizacin de los receptores de la familia de los HER, en la lnea
celular PC3.
3.1. Expresin, transactivacin y heterodimerizacin de EGFR y

HER2.
3.2. Vas de sealizacin implicadas en la transactivacin de los

receptores EGFR y HER2.
3.3. Implicacin de la activacin de EGFR y HER2 por parte de

GHRH est implicada en procesos relacionados con la progresin
tumoral.
3.4. Transactivacin de receptores de GHRH por EGF.
4. Validar en modelos experimentales animales, la eficacia de los

antagonistas de GHRH y de su combinacin con un inhibidor de
EGFR de uso clnico.
5. Valorar la capacidad de GHRH de transformar la lnea celular no

tumoral mediante la formacin de tumores in vivo.
- 62 -
3. MATERIAL Y MTODOS
Universidad de Alcal Material y Mtodos
3.1 MATERIALES
3.1.1 REACTIVOS
Cultivos celulares
Medio RPMI-1640, Medio Keratynocite-SFM y sus suplementos, suero

fetal bovino (FBS), antibitico-antimictico, PBS (Tampn fosfato salino)
y tripsina de Gibco Life Technologies (Alcobendas, Espaa).
Antagonistas de GHRH: JMR-132, JV-1-38, MIA-602, MIA-606 y MIA-
690. Cedidos por el profesor A.V. Schally (Universidad de Miami, FL, EE
UU).
GHRH de PolyPeptide (Estrasburgo, Francia).
PD98059 y H89 de Alexis (Grnberg, Alemania).
PP2, AG-1478, GM6001 y TAPI-1 de Calbiochem Millipore (Darmstadt,
Alemania).
AG-825 de Tocris Bioscience (Bristol, Gran Bretaa).
Ioduro de propidio de InvitrogenTM Life Technologies.
Bromodesoxiuridina (BrdU) de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE
UU).
Colageno tipo I de Sigma Aldrich (Madrid, Espaa).
Frascos de cultivos, pipetas, placas, etc de CELLSTARR Greiner Bio-one
GmbH (Frickenhausen, Alemania).
Ensayos in vivo
Matrigel de Corning (New York, NY, EE UU).

Gefitinib (Iressa, ZD-1839) de Biorbyt (Cambridge, Gran Bretaa).
Sonda IRDye 800CW 2-DG de LI-COR GmbH (Lincoln, NE, EE UU).
Isofluorano de Abbot Laboratories Ltd. (Queensborough, Gran Bretaa).
Formaldehdo y Etanol de Panreac (Barcelona, Espaa).
- 65 -
Material y Mtodos Universidad de Alcal
Material quirrgico y microcalibrador de Fine Science Tools

(Heidelberg, Alemania).
Jeringas y agujas de BD Biosciences.
Extraccin de RNA y RT-PCR
TRI Reagent, cloroformo, isopropanol, dietilpolicarbonato (DEPC) de

Sigma Aldrich.
Transcriptasa reversa M-MuLV, OligoDT, desoxinucletidos trifosfato
(dNTPs), ditiotreitol (DTT) de InvitrogenTM Life Technologies.
RNasin de Promega (Madison, WI, EE UU).
Agarosa D1 de CONDA (Madrid, Espaa).
Taq polimerasa de Biotools B&M Labs (Madrid, Espaa).
Marcadores de peso molecular de NIPON Genetics Europe GmbH
(Dren, Alemania).
Gel Red TM Nucleic Acid Gel Stain de Biotium (Hayward, CA, EEUU).
Deteccin, cuantificacin y extraccin de protenas
Agente de tincin para Bradford (Dye-Reagent) y persulfato amnico de

BioRad (Richmond, CA, EE UU).
Acrilamida/Bis-acrilamida de National Diagnostics (Atlanta, GE, EE
UU).
Marcadores de peso molecular para SDS-PAGE de NIPON Genetics
Europe GmbH.
Membranas de nitrocelulosa Bio Trace NT de Pall Corporation (Madrid,
Espaa).
Supersignal West Pico sustrato de quimioluminiscencia de Pierce
(Rockford, IL, EE UU).
Pelculas fotogrficas CURIX RP2 PLUS de AGFA (Mortsei, Blgica)
- 66 -
Lquido de montaje para inmunocitoqumica FluorsaveTM Reagent de

Calbiochem Millipore.
Anticuerpos especficos:
Anticuerpo Casa comercial

STAT3 (F-2) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-STAT3 (F-2) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
-catenina Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
Bcl2 (100) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
Bax (N-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
EGFR (sc-3) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
HER-2 (sc-284) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-HER2 (Tyr1248) Upstate (Lake Placid, NY, EE UU)
p-EGFR (Tyr1173) Upstate (Lake Placid, NY, EE UU)
PKC- (C-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-I (C-16) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-II (C-18) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC- (C-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC- BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE UU)

TACE (C-15) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-Src (Tyr416) Calbiochem Millipore (Darmstadt, Alemania)
p44/42 (Erk1/2) Cell Signalling (Danvers, MA, EE UU)
p-p44/42 (Erk1/2)
Cell Signalling (Danvers, MA, EE UU)
(Thr202/Tyr204)
p53 Sigma Aldrich (Madrid, Espaa)
-actina Sigma Aldrich (Madrid, Espaa)
MMP9 Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
MMP2 Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
PCNA Zymed (Viena, Austria)
- 67 -
E-cadherina BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE UU)

HIF-1 Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
GHRH Abbiotec ( San Diego, CA, EE UU)
Anticuerpos especficos frente a p-GHRH-R (nmero 2321/5) y SVs

(contra SV1-SV2-Sv4, nmero 2317/7) cedidos por el profesor A.V.
Schally (Universidad de Miami, FL, EE UU).
Anticuerpos secundarios para Western blotting, anti-ratn, y anti-
cabra de Sigma y anti-conejo de Calbiochem. Anticuerpo secundario para
inmunocitoqumica, anti-conejo de Molecular Probes (Barcelona,
Espaa). Anticuerpo secundario universal para inmuhistoqumica (LSAB
+ System-HRP) de Dako.
Medio de montaje de inmunohistoqumica DePex (Probus, Barcelona,
Espaa).
Kit de ELISA para VEGF165 y Ig-H3 de R&D System (Minneapolis,
MN, EE UU).
Formaldehdo, metanol, hematoxilina de Carazzi y hematoxilina de
Mayer de Panreac.
Kit comercial NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents
Thermo Scientific (Rockford, IL, EE UU).
- 68 -
Tampones y disoluciones
cido actico, acetato potsico, metanol, etanol, cloruro sdico, hidrxido

sdico, cido clorhdrico, cido tricloroactico (TCA), butanol, Tris,
Glicina y SDS de Panreac.
Aprotinina, leupeptina, pepstatina, azida sdica, gelatina, azul brillante
(R-250), glicerol, dimetilsulfxido (DMSO), ortovanadato de sodio
(Na3VO4), -mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF),
Tritn X-100, Tween-20, TEMED, albumina srica bovina (BSA) de
Sigma Aldrich.
CaCl2, MgCl2, KCl, DTT, EDTA, EGTA, KHPO4, Na2S2O2 de Merk
(Madrid, Espaa).
3.1.2 MODELOS EXPERIMENTALES
3.1.2.1 Lneas celulares
Se utilizan tres lneas celulares prostticas humanas: RWPE-1,

representativa de clulas epiteliales control; y LNCaP y PC3 representativas de
un estadio temprano y tardo, respectivamente, del cncer de prstata humano.
Las tres lneas celulares proceden de ATCC (American Type Culture
Collection, Rockville, MD, EEUU). Las clulas RWPE-1 se cultivan en el
medio Keratinocyte-SFM que contiene 50 g/ml de extracto de hipfisis
bovino y 5 ng/ml de factor de crecimiento epidrmico. Las clulas LNCaP y
PC3 requieren el medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS. Ambos
medios de cultivo se suplementan con 1% de una mezcla de antibitico y
antimictico (penicilina/estreptomicina/anfotericina). Las clulas se mantienen
a 37 C en un ambiente hmedo y con un 5% de CO2. El medio se renueva cada
dos das y cuando llegan al 70-80% de confluencia se lavan las clulas con PBS,
se levantan con Tripsina/EDTA y se siembran en un flask de cultivo para
- 69 -
mantenerlas o bien en las diferentes placas de cultivo segn las necesidades del
experimento. Las diferencias morfolgicas de las tres lneas celulares se
observan en las fotos mostradas a continuacin.
RWPE-1 LNCaP PC3
3.1.2.2 Animales de experimentacin
Para los experimentos in vivo se utilizan ratones macho desnudos

atmicos (nu/nu) de 5 semanas de Harlan Ibrica (Barcelona, Espaa), como el
que se muestra en la imagen inferior. Los ratones se mantuvieron en la sala
protegida libre de patgenos (SPF) del Centro de Experimentacin Animal de la
Universidad de Alcal, distribuidos en grupos de 4 ratones por jaula, expuestos
a ciclos constantes de luz y oscuridad (12 h-12 h), con agua y comida estriles ad
libitum. Todos los experimentos con animales se realizan cumpliendo las
normativas actuales para el uso y cuidado de animales de experimentacin,
segn los criterios de la Unin Europea para la investigacin animal, y con la
aceptacin del Comit de tica de la Universidad de Alcal.
- 70 -
3.2 MTODOS
3.2.1 CLULAS
3.2.1.1 cidos nucleicos
Aislamiento de RNA
La extraccin del RNA se lleva a cabo mediante el uso del reactivo comercial
TRI Reagent. El RNA se aisla a partir de lneas celulares, tras los diferentes
tratamientos, se retira el medio y se aade 1 ml de TRI Reagent por cada 2-2,5
millones de clulas. A continuacin, se aade cloroformo para permitir la
disociacin de cidos nucleicos y protenas. Se mantiene durante 5-15 min a
temperatura ambiente y se centrifuga a 12.000 x g para conseguir una
separacin completa en fases. Se recoge la fase acuosa que es la que tiene el
RNA, descartando el resto y se aade isopropanol (1:1 vol/vol) para
precipitarlo. Finalmente, se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min para separar
el precipitado, que se lava con etanol 70% dos veces centrifugando entre cada
lavado. El precipitado se resuspende en agua estril tratada con 0,1% DEPC,
que evita la actividad de las ribonucleasas. Por ltimo, se determin la cantidad
y la calidad del RNA midiendo la relacin de absorbancias a 260 y 280 nm. Para
ver el grado de pureza se utiliz la relacin de la absorbancia 260/280,
utilizando muestras con una relacin superior a 1,8.
Retrotranscripcin de RNA (RT)
La reaccin de retrotranscripcin se realiza con la enzima transcriptasa

reversa M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) y 2 g de RNA de la
muestra previamente desnaturalizado. Dicha mezcla contiene:
- 71 -
Tampn de reaccin 5x (Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), KCl 37,5 mM, MgCl2

1,5 mM)
Desoxirinucletidos trifosfato (dNTPs) 10 M
Transcriptasa reversa M-MuLV 10 U/l
Oligo-dT 0,1 g/l
Ditiotreitol (DTT) 5 mM
Inhibidor de RNasa 0,5 U/l
Agua DEPC hasta un volumen final de 20 l
La reaccin se lleva a cabo en un termociclador (MiniCyclerTM) que se

programa a 37 C durante 1 h y posteriormente, 15 min a 70 C, para conseguir
la inactivacin de la enzima.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificacin del DNA se lleva a cabo a partir de 4 l de producto final

obtenido en la reaccin de retrotranscripcin, utilizando los siguientes reactivos:
Tampn de reaccin de PCR 10x (Tris-HCl 75 mM (pH 9), KCl 150 mM,
(NH4)2SO4 20 mM, MgCl2 2mM)
dNTPs 10 M
Taq polimerasa recombinante modificada de la homnima de la bacteria
Thermus thermophilus, 1 U/l
Agua tratada con DEPC hasta un volumen final de 30 l.
Cebadores especficos elegidos mediante el programa Primer3 v.0.4.0. del
gen a amplificar, detallados a continuacin en la tabla:
- 72 -
mRNA Secuencia 53 Nciclos

GHRH Sentido AATTGGAGAGCTCCTGGTG 40
Antisentido CCAGTTGCATTTTGGCTACA
GHRH-R Sentido CCTGATCCCACTCTTTGGAA 35

Antisentido CCTCTTGGTTGAGGAAGCAG
CD44 Sentido AAGGTGGAGCAAACACAACC 35

Antisentido ACTGCAATGCAAACTGCAAG
Ciclina D1 Sentido TTCGGGATGATTGGAATAGC 35

Antisentido TGTGAGCTGGTTCATTGAG
c-Myc Sentido AGCGACTCTGAGGAGGAACA 35
Antisentido CTCTGACCTTTTGCCAGGAG
p53 Sentido AGGCCTTGGAACTCAAGG 35
Antisentido TGAGTCAGGCCTTCTGTCT
p21 Sentido AGGTGAGGGGACTCCAAAGT 35
Antisentido ATGAAATTCACCCCCTTTCC
MMP2 Sentido ACCTGGATGCCGTCGTGGAC 30
Antisentido TGTGGCAGCACCAGGGCAGC
MMP9 Sentido TGGGCTACGTGACCTATGACA 30
Antisentido TGTGGCAGCACCAGGGCAGC
TIMP1 Sentido CTTCCACAGGTCCCACAACC 38
Antisentido TCCAGGGAGCCACGAAACT
TIMP2 Sentido CCTCTGTGACTTCATCGTGCC 38
Antisentido AGCGCGTGATCTTGCACTC
TIMP3 Sentido TGCCCCATGTGCAGTACATCA 38
Antisentido TAGACGCGACCTGTCAGCA
-actina Sentido AGAAGGATTCCTATGTGGGCG 25
Antisentido CATGTCGTCCCAGTTGGTGAC
- 73 -
El protocolo a seguir en la reaccin de PCR emplea las siguientes

condiciones de tiempo y temperatura: 5 min a 94 C y durante el n de ciclos
especificados en la tabla anterior, 1 min a 95 C, 1 min a 57-60 C, 1 min a 72 C
y 10 min a 72 C.
A los productos de PCR se les aade el tampn de carga que contiene:

azul de bromofenol (0,04%), xileno cianol FF (0,04%) y glicerol (5%). La
separacin de las bandas correspondientes a los genes amplificados se realiza
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizan con una tincin
con Gel RedTM y posterior exposicin a luz UV, usando el sistema de imagen
Gel Doc TM XR (BioRad).
3.2.1.2 Protenas
Aislamiento de protenas totales
Se siembran clulas RWPE-1 (500.000 clulas/pocillo), LNCaP (300.000

clulas/pocillo) y PC3 (300.000 clulas/pocillo) en placas P-6. Tras los
diferentes tratamientos, las clulas se lavan con PBS, a 4 C y se levantan con un
raspador. Se centrifugan a 500 x g, a 4 C, durante 5 min. El precipitado se
resuspende con tampn lisis 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM de EDTA; 0,5
M de NaCl; 2 mM de PMSF; 5 g/ml de inhibidores de proteasas (aprotinina,
leupeptina y pepstatina), durante 30 min en hielo y con agitacin ocasional. Tras
la incubacin, se centrifugan a 4.000 x g, 5 min a 4 C y se recoge el
sobrenadante que se guarda a -80 C para su posterior utilizacin. La
concentracin de protenas obtenida se valora mediante el mtodo de Bradford.
- 74 -
Aislamiento de citosoles y ncleos
Se siembran clulas PC3 (300.000 clulas/pocillo) en placas P-6. Una vez

realizados los diferentes tratamientos, las clulas se lavan con PBS a 4 C, se
levantan con un raspador y se centrifugan a 500 x g a 4 C durante 5 min. A
continuacin, se emplea un kit comercial NE-PER Nuclear and Cytoplasmic
Extraction Reagents de Thermo Scientific. Una vez eliminado el PBS se aade a
cada muestra 50 l de tampn de extraccin citoplasmtica I (CER I), y se
mantienen a 4 C durante 10 min, con agitacin ocasional. Tras la incubacin, se
aaden 2,3 l de tampn de extraccin citoplasmtica II (CER II), y se deja a 4
C, durante 1 min. La suspensin de clulas se centrifuga a 16.000 x g, 5 min a 4
C, obtenindose en el sobrenadante el extracto citoslico. A continuacin, el
precipitado se resuspende en 25 l de tampn de extraccin nuclear (NER), y se
incuba a 4 C durante 40 min, con agitacin cada 5 min. Tras este periodo, se
centrifuga a 16.000 x g, 10 min, obteniendo el sobrenadante que corresponde
con la fraccin nuclear. Ambas fracciones se guardan a -80 C para su posterior
utilizacin. La concentracin proteica se valora utilizando el mtodo de
Bradford.
Inmunodeteccin de protenas
Las protenas totales aisladas (20-50 g) se mezclan con tampn de carga

que contiene, 50 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% v/v de glicerol, 3% p/v de
SDS, 0,01% de azul de bromofenol y 0,7 M de -mercaptoetanol, y se
desnaturalizan durante 5 min, a 95 C. A continuacin, se separan por
electroforesis utilizando geles de acrilamida/bisacrilamida en geles al 8%, 10%
12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), a temperatura ambiente.
Finalmente, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa durante toda la
noche, a 4 C y 25 V o a 70 V, durante 1,5 h. La membrana se incuba, 5 min, con
- 75 -
una solucin con rojo Ponceau al 0,25% mezclada con TCA al 5% para verificar
la correcta transferencia de protenas del gel a la membrana, y a continuacin, se
lava para retirar el exceso con PBS.
La membrana se incuba con el tampn de bloqueo TBS (pH 7,6) o PBS,

5% leche desnatada y 0,05% Tween-20, para evitar las uniones inespecficas a la
misma, durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el bloqueo se incuba con el
anticuerpo primario durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante toda la
noche a 4 C. Transcurrido el tiempo, la membrana se lava con PBS y se incuba
con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de
rabano (1:4.000), 1 h a temperatura ambiente. Por ltimo, se lava de nuevo la
membrana y se incuba con el sustrato de la peroxidasa del sustrato de
quimioluminiscencia, durante 1 min. A continuacin, se expone la membrana
con pelculas fotogrficas CURIX. El anlisis densitomtrico de las bandas se
realiza con el programa Quantity One (BioRad). Los datos se normalizan con la
cantidad de -actina, utilizada como control de carga. Las concentraciones de los
anticuerpos primarios, as como el anticuerpo secundario correspondiente
aparecen en la siguiente tabla:
Anticuerpo 1 Dilucin 1 Anticuerpo 2

STAT3 (F-2) 1:100 Ratn
p-STAT3 (F-2) 1:100 Ratn
-catenina 1:2.000 Ratn
Bcl2 (100) 1:1.000 Ratn
Bax (N-20) 1:500 Conejo
EGFR (sc-3) 1:1.000 Conejo
HER-2 (sc-284) 1:500 Conejo
p-HER2 (Tyr1248) 1:1.000 Conejo
- 76 -
p-EGFR (Tyr1173) 1:500 Ratn

PKC- (C-20) 1:500 Conejo
PKC-I (C-16) 1:500 Conejo
PKC-II (C-18) 1:500 Conejo
PKC- (C-20) 1:500 Conejo
PKC- 1:250 Ratn

TACE (C-15) 1:500 Conejo
p-Src (Tyr416) 1:2.000 Conejo
p44/42 (Erk1/2) 1:1.000 Conejo
p-p44/42 (Erk1/2) 1:1.000 Ratn
(Thr202/Tyr204)
p53 1:2.000 Conejo
GHRH 1:100 Conejo
p-GHRH-R 1:2.000 Conejo
SVs (SV1-SV2-SV4) 1:2.000 Conejo
MMP9 1:5.000 Conejo
MMP2 1:2.000 Conejo
PCNA 1:10.000 Ratn
E-cadherina 1:2.000 Ratn
-actina 1:20.000 (Toda la noche) Ratn
1:8.000 (1 h)
Inmunocitoqumica
Se siembran 40.000-60.000 clulas/pocillo sobre cristales tratados y

estriles de 12 mm2, colocados en placas P-24, y se mantienen durante 24 h para
- 77 -
que se adhieran. Se realizan los diferentes tratamientos y, a continuacin se

retira el medio de cultivo de los pocillos y se lavan con PBS. Para fijar las
clulas a los cristales, se utiliza p-formaldehido al 4% (pH 7,4) durante 25 min a
temperatura ambiente. Una vez fijadas, se lavan con PBS y se permeabilizan con
Tritn X-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se
lavan con PBS y se procede a la inmunodeteccin con los anticuerpos
especficos. Las clulas se someten a un bloqueo con BSA al 3%, en PBS a 37 C,
para prevenir las uniones inespecficas. Tras el bloqueo, se incuba con los
anticuerpos primarios frente a p-GHRH-R y SVs (dilucin 1:500) durante 2 h, a
37 C, en atmsfera hmeda.
Seguidamente, se realizan lavados con PBS y se incuban con el anticuerpo

secundario anti-conejo conjugado con Alexa 488 durante 1 h en oscuridad y en
las mismas condiciones que los anticuerpos primarios. A las muestras que se
utilizan como control negativo no se les aade el anticuerpo primario. Una vez
finalizada la inmunodeteccin, los cristales se colocan en un portaobjetos
adheridos con lquido de montaje con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol)
Fluorsave ReagentTM de Invitrogen, que se une al DNA y tie los ncleos de
color azul. Las preparaciones se visualizan en un microscopio confocal de
fluorescencia Leica TCD SP5 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania)
para su posterior anlisis.
Zimografa
Se siembran 50.000 clulas/pocillo en placas P-6. Transcurridas 24 h, se

retira el medio, se les aade medio condicionado y se realizan los diferentes
tratamientos. Una vez finalizados, el medio secretado se recoge y se guarda a
80 C hasta su uso.
- 78 -
A continuacin, se realiza una electroforesis de acrilamida/bisacrilamida

SDS-PAGE al 10% con 3 g de protenas, cuyo gel se copolimeriza con 0,1% de
gelatina (Sigma Aldrich). Posteriormente, se realizan cuatro lavados del gel para
conseguir eliminar el SDS: dos de 30 min cada uno, con Tris- HCl 50 mM (pH
7,4) y 2,5% de Tritn X-100 y dos lavados de 10 min cada uno, con Tris-HCl
50 mM. Una vez finalizados, el gel se incuba toda la noche a 37 C, en agitacin,
con un tampn de incubacin que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), CaCl2 10
mM, NaCl 0,15 M, 0,1% de Tritn X-100 y 0,02% de azida sdica. Despus de la
incubacin, los geles se tien durante 30 min con 0,25% de azul Coomassie R-
250, y se destien con la solucin de destincin que contiene 7,5% de cido
actico y 20% de metanol, apareciendo las bandas blancas sobre un fondo azul,
donde las enzimas han degradado la gelatina. El anlisis densitomtrico de la
actividad de las metaloproteasas 2 y 9 se realiza con el programa Quantity One
(BioRad).
ELISA para valorar VEGF
Se siembran 40-80.000 clulas/pocillo en placas P-24. Una vez

finalizados los diferentes tratamientos, se recoge el medio de cultivo y se
procede a cuantificar los niveles de VEGF165. Para ello, se emplea un kit de
ELISA (R&D system), donde se incuba el anticuerpo primario en una placa de
96 pocillos, durante toda la noche a temperatura ambiente, para que se adhiera a
la base. A continuacin se lava con PBS y Tween-20 al 0,05%; los lavados se
deben repetir despus de cada uno de los pasos del ELISA. A continuacin, se
procede al bloqueo de las uniones inespecficas incubando, durante 1 h, con BSA
al 1% en PBS. Para cuantificar los niveles de expresin se realiza una curva
patrn cuyo rango oscila entre 0-4.000 pg/ml siguiendo las indicaciones del
fabricante. Una vez finalizado el bloqueo y los sucesivos lavados, se aaden las
diluciones conocidas del patrn y las muestras a analizar. Todos los ensayos se
- 79 -
realizan por duplicado. Tras 2 h de incubacin, se lavan los pocillos y se aade el

anticuerpo secundario conjugado con biotina, que reconocer a la isoforma
VEGF165, durante 2 h. A continuacin y en ausencia de luz, se aade el complejo
estreptavidina-peroxidasa durante 20 min. Una vez finalizado este tiempo, se
aade la solucin sustrato de la enzima peroxidasa durante 1 h, que contiene
H2O2 y ABTS (2,2-acinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfnico]) que
permite visualizar la reaccin. La absorbancia se mide a 405 nm en un
espectofotmetro.
3.2.1.3 Ensayo de incorporacin de la bromodesoxiuridina
La bromodesoxiuridina (BrdU), es un derivado de uridina que se puede

incorporar al DNA en lugar de timidina. Para la realizacin de la tcnica se
siembran 300.000 clulas/pocillo en placas P-6. Una vez adheridas a la placa, las
clulas se deprivan de suero durante 24 h. Transcurrido ese tiempo, a las clulas
se aplican los diferentes tratamientos en medio sin suero. Para medir la
proliferacin se aade BrdU 10 M, 1 h antes de finalizar el tratamiento.
Posteriormente, las clulas se lavan con PBS, se levantan con tripsina y se
centrifugan a 500 x g durante 5 min, para eliminar el sobrenadante. Las clulas
se fijan con etanol absoluto fro, a -20 C, durante 30 min, o a 4 C 24 h.
Transcurrido este tiempo, se centrifugan de nuevo y se lavan con PBS. Las
clulas se incuban, durante 30 min, a temperatura ambiente, con 2 N de HCl,
con el fin de desnaturalizar el DNA. Este paso es imprescindible, ya que el
anticuerpo Anti-BrdU se une a las molculas de BrdU incorporadas cuando el
DNA es de cadena sencilla. A continuacin, se centrifugan y se lavan dos veces
con PBS, y una tercera vez con PBS que contena 0,05% de Tween-20 (pH 7,4) y
0,1% de BSA. Finalmente, las clulas se incuban con 20 l de anti-BrdU,
anticuerpo monoclonal con FITC (BD Bioscience), en condiciones de oscuridad,
durante 30 min como mnimo y pasado el tiempo de incubacin, se realiza un
- 80 -
ltimo lavado y se centrifuga para retirar el sobrenadante, quedando las clulas

en el precipitado. Las clulas se tien con una solucin de PBS, que contiene 50
mg/ml de ioduro de propidio (IP) y 10 g/ml de RNasa, antes del anlisis por
citometra de flujo con el FACSCalibur de BD Biosciences. La cantidad deBrdU
incorporada al DNA celular se analiza con el programa Cyflogic v 1.2.1. Se
muestra a continuacin una imagen de la localizacin en un dot plot de las clulas
que han incorporado BrdU.
Clulas que han

incorporado la BrdU
BrdU
PI
3.2.1.4 Ensayo de viabilidad con MTT
El ensayo MTT, es un mtodo basado en la capacidad de las

deshidrogenasas mitocondriales de las clulas vivas para reducir la sal de
tetrazolio, MTT (Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazol).
Este compuesto es una sal amarilla y soluble, que se reduce en cristales
insolubles de formazn de color azul oscuro retenidos en el interior celular. La
cantidad de MTT reducido se puede medir colorimtricamente, presentando su
mximo de absorcin a 570 nm.
Para realizar el experimento, se siembran 25.000 clulas/pocillo en

placas P-96, y una vez adheridas, se deprivan con medio sin suero durante 24 h.
Posteriormente, se realizan los distintos tratamientos, y 1-1,5 h antes de
- 81 -
finalizar se incuban con 0,3 mg/ml de MTT, a 37 C y en condiciones de

oscuridad. Los cristales obtenidos se solubilizan con 50-100 l de isopropanol
fro y agitacin suave. Posteriormente, se procede a su lectura en un
espectrofotmetro a 570 nm, a la cual restaremos la obtenida a 620 nm como
fondo.
3.2.1.5 Ensayo de ciclo celular
Se siembran 75.000-100.000 clulas/pocillo en placas P-6 y se mantienen

durante 24 h para conseguir su adherencia, momento en el que se deprivan con
medio sin suero, durante 24 h. Transcurrido este tiempo, se realizan los
distintos tratamientos y despus, las clulas se lavan con PBS, se levantan con
tripsina y se centrifugan. El precipitado de clulas se fija y se permeabiliza con
etanol fro al 70%, durante 30 min a -20 C. Despus, las clulas se centrifugan
para retirar el etanol y se lavan con PBS. Finalmente, se resuspenden en una
solucin de tincin que contiene PBS, 50 mg/ml de IP y 10 g/ml de RNasa,
antes del anlisis por citometra de flujo con FACSCalibur. La cantidad de DNA
que se distribuye en las diferentes fases del ciclo celular se analiza con el
programa Cyflogic v 1.2.1., obteniendo el siguiente perfil en un ciclo normal:
G1
SubG0
N de eventos
G2/M
S
PI
- 82 -
3.2.1.6 Ensayo de adhesin
Previamente a la realizacin del ensayo de adhesin, las clulas se

deprivan de suero durante 24 h. A continuacin, se levantan por tripsinizacin
que se neutraliza con medio sin suero suplementado con 0,1% de inhibidor de
tripsina. Las clulas se centrifugan a 500 x g, durante 5 min y se resuspenden en
medio sin suero suplementado con 0,1% de BSA, hasta alcanzar una
concentracin de 250.000 clulas/ml. Las clulas se mantienen en suspensin,
durante 1 h, antes de realizar los diferentes tratamientos.
La suspensin de clulas se separa en varias fracciones que dependern del

nmero de tratamientos a realizar y se mantienen en suspensin, durante 1 h, a
37 C, con agitaciones cada 5 min. Por otro lado, se preparan las placas con el
colgeno que acta como matriz. Se aaden 100 l de colgeno tipo I (8 g/cm2)
diluido en cido actico 10 mM/pocillo, en placas de 96 pocillos, durante 1 h, a
37 C en atmsfera seca para conseguir una fijacin completa al pocillo. Pasado
ese tiempo, se aspira el colgeno y se lava tres veces la placa con PBS. Se
adicionan 100 l de la suspensin celular previamente tratada a cada pocillo y se
aspira el medio en el tiempo correspondiente. Finalmente, se contina la
valoracin de las clulas adheridas al colgeno mediante un ensayo de MTT,
donde se aaden 100 l de medio sin suero y 0,3 mg/ml de MTT a cada pocillo.
3.2.1.7 Ensayo de migracin
Se basa en un ensayo de cierre de heridas o wound healing que se

realiza sobre una monocapa de clulas confluentes. Las clulas se siembran en
placas P-24 y se dejan hasta que alcancen la confluencia, momento en el que se
llevan a cabo los diferentes tratamientos. La herida se realiza mediante una
incisin con un raspador manual, como se indica en la imagen. Para valorar la
migracin celular, se realizan fotos de la herida, desde el momento en el que se
produce, en un microscopio invertido acoplado a una cmara Nikon (40x). El
- 83 -
seguimiento se distribuye en diferentes tiempos (0-24 h), hasta conseguir el

cierre completo de la herida y se mide al espacio sin cerrar, para comparar
respecto al tiempo cero de cada tratamiento.
3.2.2 RATONES
3.2.2.1 Induccin de tumores con clulas PC3
Para la obtencin de los xenoinjertos se prepara una suspensin de

clulas PC3 (5 x 106 clulas/ratn) mezclada con la membrana basal sinttica,
MatrigelTM Matrix (1:1, v/v), a 4 C. La mezcla se inyecta subcutneamente en el
flanco derecho del animal. Tras 10 das de crecimiento de los tumores, se
establecen los grupos de trabajo en cada experimento:
Experimento 1: se establecen 3 grupos de animales para evaluar los

tratamientos con los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38. El
experimento finaliza a los 52 das de la inoculacin de las clulas.
- 84 -
Inicio
tratamiento
CONTROL
0,1% DMSO +10% PG/da
Grupo I
5 x106 10 ratones
clulas PC3
Formacin JMR-132: 10 g/da
tumor Grupo II
8 ratones
JV-1-38: 20 g/da
Grupo III
7 ratones
Experimento 2: se establecen 4 grupos de animales para evaluar el

antagonista de GHRH MIA-690; el inhibidor de EGFR, Gefitinib y;
ambos en combinacin. El experimento finaliza a los 52 das de la
inoculacin de las clulas.
CONTROL
0,1% DMSO +10% PG/da
Grupo I
15 ratones
5 x106
clulas PC3 MIA-690: 5 g/da
Grupo II
Formacin 9 ratones
tumor
GEFITINIB
(3 mg/da)
Fin
tratamiento
Descanso
Grupo III 5 das 2 das 5 das
9 ratones
GEFITINIB
(3 mg/da) Fin
tratamiento
Descanso
Grupo IV 5 das 2 das 5 das
9 ratones
- 85 -
Al finalizar el tratamiento, se procede a la extraccin de la sangre del

animal y a su posterior sacrificio por dislocacin cervical. Finalmente, se
recogen los tumores, se pesan y una parte se almacena a -80 C para la posterior
utilizacin de los mismos, otra parte se prepara para inmunohistoqumica.
3.2.2.2 Induccin de tumores con clulas RWPE-1
En primer lugar, se forman dos grupos de clulas RWPE-1, el grupo I

control que no recibe tratamiento, y el grupo II cuyas clulas se incuban con
GHRH 0,1 M durante 24 h. Tras el tratamiento se realiza una suspensin con
1 x 107 clulas/ratn mezclada con la membrana basal sinttica, MatrigelTM
Matrix (1:1, v/v), a 4C. La mezcla se inyecta subcutneamente en el flanco
derecho del animal. El experimento finaliza a las 11 semanas del inicio del
mismo.
1 x107 clulas RWPE-1
Grupo I
7 ratones
24 h CONTROL
GHRH 0,1 M 1 x107 clulas RWPE-1
Grupo II
7 ratones 24 h
3.2.2.3 Seguimiento de los experimentos de tumorigenicidad
En todos los experimentos, se hace un examen visual de la salud de los

ratones y se pesan dos veces a la semana, anotando adems cualquier anomala
en su comportamiento. El estado de los animales se evala mediante las hojas de
- 86 -
evaluacin de la severidad en oncologa para la eficacia de nuevos frmacos

antitumorales entregadas por el Centro de Experimentacin Animal,
estableciendo de esta forma los criterios de punto final.
El volumen del tumor se mide con un microcalibrador y se calcula con la

frmula: Volumen= Alto x Ancho x Profundo x 0,5236 (Tomayko y col., 1989).
3.2.2.3 Aislamiento de RNA y RT-PCR
Se toma un pequeo trozo del tejido tumoral, se trocea y homegeniza con

un Potter aadiendo 200 l de Tri Reagent. A continuacin, se sigue con el
protocolo de aislamiento y de RT-PCR utilizado para las clulas (apartado
3.2.1.1).
3.2.2.4 Inmunohistoqumica
Las piezas reservadas para inmunohistoqumica se lavan con suero

fisiolgico y se fijan con formol al 10% durante 1 da. Tras lavar con PBS
durante 1 h, las piezas se deshidratan mediante su inmersin en concentraciones
crecientes de etanol: 50 1 h, 70 toda la noche, 80 1 h, 90 1 h y 100 1 h; y por
ltimo las piezas se dejan en una solucin de butanol. A continuacin se pasan
por tres soluciones de parafina durante 1, 12 y 3 h. Los bloques se realizan con
moldes de 2x1x1 cm donde se pone parafina nueva y se incluye la pieza,
mantenindolos a temperatura ambiente hasta que se enfran. Se realizan
secciones de 5-7 m con un micrtomo MICROM HM 30. Los cortes se montan
sobre portaobjetos pretratados con 3-aminopropil-trietoxixylane (TESPA) al
1% en acetona. A continuacin, se desparafina y rehidrata el tejido. Para
exponer los antgenos, los cortes se incuban en tampn citrato 0,01 M (pH 6)
durante 2 min en una olla exprs convencional y se dejan enfriar en la olla sin
- 87 -
destapar durante 20 min y se lavan durante 5 min con agua destilada. La

actividad peroxidasa endgena se inhibe, incubando los cortes durante 20 min,
con H2O2 al 0,3% a temperatura ambiente y se lavan de nuevo 5 min con agua
destilada. Se contina con dos lavados con PBS de 10 min. Las uniones
inespecficas se bloquean al incubar los cortes en TBS con un 3% de NDS y 0,5%
de Triton X-100 durante 1 h. Posteriormente, se incuban con el anticuerpo
primario diluido en el tampn de bloqueo diluido (0,3% NDS y 0,05% Tritn X-
100), durante toda la noche, siguiendo las siguientes diluciones:
Anticuerpo 1 Dilucin
p-HER2 (Tyr1248) 1:100
p-EGFR (Tyr1173) 1:100
GHRH 1:50
p-GHRH-R 1:2.000
SVs (SV1-SV2-SV4) 1:2.000
MMP9 1:200
MMP2 1:100
PCNA 1:300
E-cadherina 1:500
HIF-1 1:100
Las muestras se lavan dos veces con TBS durante 10 min, y se incuban
con el anticuerpo secundario universal unido a biotina (Dako) durante 20 min y
se vuelven a lavar. Finalmente, la deteccin se realiza mediante la tcnica clsica
de marcaje con el complejo de estreptavidina-biotina peroxidasa (LSAB -kit,
Dako). Para revelar se utiliza diamino-benzidina con el mtodo de
intensificacin de la glucosa oxidasa. Se comprueba la tincin con el microscopio
y, cuando se obtiene una seal intensa, la reaccin se detiene con tampn
- 88 -
acetato. Por ltimo, se deshidratan, se limpian con xileno y se procede al

montaje de la preparacin en DePex (Probus). Como controles positivos se
utilizan secciones de la piel, la glndula suprarrenal y rin de rata.
3.2.2.6 Tricrmico de Masson
Tras desparafinar y rehidratar los cortes realizados de los tumores

incluidos en parafina, se someten a una tincin con hematoxilina frrica de
Weigert, durante 5 min, seguido de un lavado en agua durante 4 min. Los cortes
se tienen con fucsina acida-Ponceau (33% de Fucsina cida y 66% de Ponceau)
durante 8 min y se aclaran con agua actica al 1%. A continuacin se sumergen
en una solucin de Orange G (2,5% de cido fosfomolbdico y 2% de Orange G)
durante 5 min, volviendo a aclararlos con agua actica al 1%, y se sumergen en
una solucin de verde luz (0,2% de verde luz y 0,2% de actico), volviendo a
lavar tras 3 min de inmersin. Por ltimo se vuelven a deshidratar y se montan
con Entelln para su posterior visualizacin.
3.2.2.7 Lisados de tejido tumoral y Western blotting
Se trocea y homogeniza con ayuda de un Polytron PT-20 una pequea

parte del tejido tumoral en hielo con un tampn que contiene: Tris-HCl 1M (pH
7,4), NaCl 150 mM, Nonidet-P40 1%, Ortovanadato 2 mM, y leupeptina,
aprotinina y pepstatina 5 g/ml. El homogenado se incuba 30 min, a 4 C.
Posteriormente, se centrifugan a 17.000 x g, durante 30 min, a 4 C, y el
sobrenadante se recoge y almacena a -80 C, para su posterior utilizacin en
ensayos de inmunodeteccin segn aparece en el apartado 3.2.1.2.
- 89 -
3.2.2.8 Estudio de la expresin de VEGF y de la actividad gelatinoltica de

MMPs
Se toma una parte del tejido tumoral extraido y se homogeniza con un

Potter a 4 C en un tampn que contiene Tris HCl (pH 7,6) a 50 mM, Tritn
X-100 al 1%, NaCl a 200 mM y CaCl2 a 10 mM e inhibidores de proteasas:
PMSF 0,5 mM y 2 g/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Todo ello se
mantiene durante 30 min, a 4 C, con agitaciones ocasionales. Pasado el tiempo,
se centrifuga a 12.000 x g durante 20 min, se recoge el sobrenadante y se
conserva a -80 C hasta su uso posterior para los ensayos de ELISA de VEGF y
de zimografa (apartado 3.2.1.2.).
3.2.2.9 Aislamiento de membranas y ncleos
Se trocea y homogeniza con ayuda de un Polytron PT-20 una pequea

parte del tejido tumoral en hielo con PBS e inhibidores de proteasas (PMSF 0,1
mM y 10 g/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina). El homogenado se filtra
con una gasa doble para eliminar restos de tejido, y se centrifuga a 500 x g 10
min, a 4 C. El sobrenadante se mezcla a partes iguales con un tampn que
contiene 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT,
0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF 0,1 mM y 10 g/ml de
aprotinina, pepstatina y leupeptina. Tras 10 min de incubacin se centrifuga a
1.000 x g 15 min a 4C:
Sobrenadante: se utiliza para aislar las membranas. Se centrifuga a 50.000

x g 30 min a 4 C. El precipitado obtenido se resuspende en un tampn
que contiene 50 mM TEA (trietanolamina) (pH 7,4), 0,5 mM sacarosa, 1
mM EDTA, 20 mg/l de bacitracina e inhibidores de proteasas: PMSF 0,1
mM y 10 g/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. La mezcla se
- 90 -
centrifuga a 100.000 x g 20 min a 4 C, el precipitado se resuspende en el

tampn anterior y se conserva a -80 C.
Precipitado: se emplea para la extraccin de ncleos. El precipitado se
resuspende en un tampn que contiene 0,3 mM HEPES (pH 7,9), 1,5 mM
KCl, 0,03 mM MgCl2, 0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF
0,1 mM y 10 g/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Tras 10 min de
incubacin se centrifuga a 2.000 x g, 15 min, a 4 C. El precipitado se
resuspende en un tampn que contiene 20 mM HEPES (pH 7,9), 25% de
Glicerol, 0,42 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA,
0,5 mM DTT, 0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF 0,5 mM
y 10 g/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Se centrifuga a 20.000
x g 15 min a 4 C. El sobrenadante es la fraccin nuclear y se conserva a -
80 C.
3.2.2.10 Sonda 2-desoxi-D-glucosa
Previo al sacrificio de los animales se procede a realizar el ensayo con la

sonda 2-desoxi-D-glucosa (IRDye 800CW 2DG Optical Probe) que se
encuentra unida a un fluorocromo que emiten a 800 nm. Las clulas tumorales
presentan un elevado metabolismo glucosdico y captan glucosa del medio con
avidez. La sonda 2-desoxi-D-glucosa entra por el mismo transportador de
membrana que la glucosa, pero no es metabolizada por la va glucoltica, de esta
forma la sonda se va acumulando en dichas clulas, lo que nos permite
detectarlas con un escaner de fluorescencia para animales. Un da antes de
valorar la presencia de fluorescencia, se inyecta de forma intravenosa 20 nmoles
de la sonda 2-desoxi-D-glucosa en la vena de la cola de los ratones. Al da
siguiente los ratones se mantienen en ayunas durante 6 h, pasado este tiempo se
anestesia a los animales y se les escanea con el sistema de anlisis Licor Odissey
de LI-COR. En el anlisis de las imgenes, el color azul representa una baja
- 91 -
presencia de la sonda en el animal, y el color rojo indica una elevada presencia

de la misma.
3.2.2.11 Rayos X
Una vez extrado el tejido tumoral de los animales se procede a realizar

radiografas de los cuerpos enteros de los ratones con X-ray system (Faxitron
Bioptics, Tucson, AZ). Las radiografas obtenidas fueron analizadas gracias a la
colaboracin del Servicio de Traumatologa del Hospital Universitario Prncipe
de Asturias. Posteriormente, se clasifican los animales segn una serie de
estadios realizados atendiendo al nmero y localizacin de dichas lesiones
metastsicas:
Estadio 0: Sin cambios
Estadio 1: Pequeos focos metastsicos
Estadio 2: Focos metastsicos en hueso o pulmn
Estadio 3: Focos metastsicos en hueso y pulmn
- 92 -
3.2.3 ANLISIS ESTADSTICO
Los anlisis estadsticos se realizan con el programa GraphPad Prism,

utilizando el test de Bonferroni para comparaciones mltiples despus de
realizar un anlisis de varianza (ANOVA). El resultado obtenido se considera
significativo a partir de p<0,05.
- 93 -
4. RESULTADOS
Universidad de Alcal Resultados
4.1 ESTUDIO DE LOS RECEPTORES DE GHRH EN CLULAS

PROSTTICAS HUMANAS
En este apartado se analiza la expresin de GHRH, as como, los niveles

y localizacin de los receptores de GHRH en clulas de epitelio prosttico
humano, RWPE-1, de carcinoma prosttico humano en estadio temprano al ser
dependiente de andrgenos, LNCaP, o en estadio avanzado, independiente de
andrgenos, PC3.
4.1.1 EXPRESIN DE GHRH
En primer lugar se valoran los niveles proteicos de GHRH por

inmunodeteccin. Los resultados se representan en la figura 21, indican que las
tres lneas celulares de prstata expresan GHRH con un patrn diferente segn
el tipo celular. As, las clulas tumorales tienen mayores niveles de GHRH que
la no tumoral, un 38% y un 45% mayor para LNCaP y PC3, respectivamente.
GHRH
-Actina
150 ***
***
Niveles de protena
(% vs. RWPE-1)
100
50
0
RWPE-1 LNCaP PC3
Figura 21. Expresin GHRH en las lneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3
medida por ensayos de Western blot. Los resultados se representan como el
porcentaje de expresin respecto a la expresin en RWPE-1. Los datos corresponden a
la media E.S.M. de tres experimentos independientes; ***, p<0,001.
- 97 -
Resultados Universidad de Alcal
4.1.2 EXPRESIN DE LOS RECEPTORES DE GHRH
La valoracin de la expresin de los receptores de GHRH se realiza

mediante inmunodeteccin con anticuerpos especficos para el receptor
hipofisario, p-GHRHR, y sus variantes de splicing, SVs (Figura 22). Los
resultados obtenidos indican que los niveles de expresin para el p-GHRHR
son un 24% ms elevados en el caso de la lnea celular LNCaP, y un 34%
menores para la lnea celular PC3, con respecto a la expresin en clulas
controles RWPE-1. Por el contrario, los receptores SVs presentan una mayor
expresin en PC3 (40%), y una menor expresin en LNCaP (19%) respecto a la
expresin en RWPE-1.
p-GHRHR SVs
-Actina -Actina
150 ***
*
Niveles de protena
(% vs RWPE-1)
100
*
**
50
Figura 22. Expresin de los receptores p-GHRH y SVs en las lneas celulares
RWPE-1, LNCaP y PC3 medida por ensayos de Western blot. Los resultados se
representan como el porcentaje de expresin respecto a la expresin en RWPE-1. Los
datos corresponden a la media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05;
**, p<0,01; ***, p<0,001.
- 98 -
4.1.3 LOCALIZACIN DE LOS RECEPTORES DE GHRH
La localizacin subcelular de los receptores de GHRH se determina por

inmunocitoqumica. Las imgenes obtenidas por microscopia de fluorescencia de
la figura 23, indican que en las tres lneas celulares hay expresin de los dos
tipos de receptores, p-GHRHR y SVs, y estn localizados en membrana
plasmtica y citoplasma. Las clulas RWPE-1 tienen una expresin menor de
ambos receptores comparando con las clulas tumorales. Las LNCaP presentan
para el receptor p-GHRHR una mayor intensidad de fluorescencia que para los
receptores SVs. En cambio, en la lnea celular PC3 se observa una expresin
mayor de los receptores SVs. Resultados concordantes con los observados en la
figura 22.
p-GHRHR SVs Negativo
RWPE-1
LNCaP
PC3
Figura 23. Inmunocitoqumica de los receptores p-GHRH y SVs en las lneas

celulares RWPE-1, LNCaP y PC3. Como control negativo se realizan preparaciones
en ausencia de anticuerpo primario. Las imgenes son representativas de cuatro
experimentos independientes. Imgenes aumentadas 1000 veces.
- 99 -
4.1.4 EFECTO DE LOS ANTAGONISTAS DE GHRH SOBRE LA

EXPRESIN DE SUS RECEPTORES
Como se menciona en la introduccin, los antagonistas de GHRH

reducen la expresin de novo de GHRH, sin embargo, no se han comprobado sus
efectos sobre los receptores de GHRH. En este sentido, se evala la expresin
del mRNA en funcin del tiempo de todas las variantes de los receptores de
GHRH tras el tratamiento con sus antagonistas, JMR-132 y JV-1-38. La figura
24 indica como el tratamiento con los antagonistas incrementa la expresin de
mRNA de manera tiempo-dependiente en las clulas PC3, llegando hasta casi
un 100% de aumento en su expresin
A) B)
JMR-132 JV-1-38
GHRHR
-Actina
*** 200 ***

200 *** **
**
* **
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
150 *
150
(% vs. 0 min)
(% vs. 0 min)
100 100
50 50
0 0
0 5 15 30 60 120 0 5 15 30 60 120
Tiempo (min) Tiempo (min)
Figura 24. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, sobre la

expresin de mRNA de los receptores de GHRH en la lnea celular PC3. Los
resultados se obtienen mediante ensayos de RT-PCR, y se representan como el
porcentaje de expresin respecto a la expresin a los 0 min. Los datos corresponden a la
media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***
p<0,001.
- 100 -
4.2 EFECTO DE GHRH Y SUS ANTAGONISTAS EN PROCESOS

IMPLICADOS EN LA PROGRESIN DEL CNCER DE
PRSTATA
Para determinar el efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la

progresin del cncer prosttico se estudia su papel sobre los siguientes
procesos:
Viabilidad celular
Proliferacin
Ciclo celular y apoptosis
Adhesin celular
Migracin
Degradacin de la matriz extracelular
Neurodiferenciacin
Angiognesis
Adems, para cada uno de los fenotipos estudiados se analizan las

variaciones producidas en diferentes protenas marcadoras de cada proceso.
4.2.1 VIABILIDAD CELULAR Y CITOTOXICIDAD
En este apartado se estudia el efecto de GHRH y sus antagonistas sobre

la viabiblidad de clulas RWPE-1, LNCaP y PC3, mediante ensayos de MTT.
En primer lugar, se determina la concentracin ptima de los pptidos a

utilizar en posteriores estudios; para ello, se ensaya el efecto de diferentes
concentraciones (0,001-0,1 M) de GHRH y de sus antagonistas, tras 24 h de
tratamiento, sobre la actividad metablica en la lnea celular control, RWPE-1,
y la tumoral ms agresiva, PC3. Los resultados (Figura 25A y 25B) indican que
- 101 -
GHRH produce un aumento de la viabilidad celular dosis-dependiente en ambas

lneas celulares. Se elige para posteriores tratamientos una concentracin de 0,1
M para GHRH, ya que es la nica concentracin ensayada que aumenta la
viabilidad de ambas lneas celulares. En cambio, en el ensayo con los
antagonistas se observa un efecto citotxico dosis dependiente. Se elige como
concentracin ptima de antagonista 0,1 M, ya que provoca una reduccin
importante de la actividad metablica de las clulas tumorales sin ser
excesivamente citotxica para las clulas no tumorales.
A)
**
120 120 120
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100
(% vs. Control)
100 100
(% vs. Control)
(% vs. Control)
* *** ***
80 80 80 *** *** ***
***
60 60 60
40 40 40 ***
20 20 *** 20
0 0 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
GHRH (M) JMR-132 (M) JV-1-38 (M)
120 120 120

Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100 100 100

(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
80
* ** 80 * 80 **
60 60 *** *** 60
*** ***
***
40 40 40
***
20 20 20 ***
***
0 0 0
MIA-602 (M) MIA-606 (M) MIA-690 (M)
B)
120 *** **
*** 120 120
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100
(% vs. Control)
100
(% vs. Control)
100
(% vs. Control)
80 * * ** ***
80 80
*
60 60 60
40 40 40 ***
20 20 20
0 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
GHRH (M) JMR-132 (M) JV-1-38 (M)
120 120 120

Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100 100 100

(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
80 *** 80 ** 80
*** ***
60 *** *** 60 *** 60 *** ***
***
40 40 *** 40 ***
*** ***
20 20 20
0 0 0
MIA-602 (M) MIA-606 (M) MIA-690 (M)
Figura 25. Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la viabilidad celular en

clulas RWPE-1 (A) y PC3 (B) valorado por ensayo MTT. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a la media
E.S.M. de diez experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 102 -
La figura 26 muestra de manera conjunta el resultado de la viabilidad en

las tres lneas celulares con cada uno de los pptidos. Tras el tratamiento con
GHRH (0,1 M) se produce un incremento de la viabilidad en los tres tipos
celulares (10-19% frente al control), siendo mayor en las clulas PC3. Por el
contrario, cuando se incuban las clulas solo con los antagonistas de GHRH la
viabilidad celular disminuye de forma significativa. En el caso de las RWPE-1,
el antagonista MIA-606 es el que produce el mayor efecto, en torno a un 43% de
disminucin del metabolismo celular. Para la lnea celular LNCaP los
antagonistas de GHRH producen una reduccin en su viabilidad celular en
torno a un 27%, excepto el antagonista JV-1-38 con el que no se obtiene
resultados significativos. La lnea celular PC3, tras el tratamiento con los
antagonistas, muestra una reduccin significativa, destacando el antagonista
MIA-690 con el que se consigue una reduccin de un 44%.
RWPE-1 LNCaP PC3

125 125 125
** * ***
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100 100

*** *** ***
*
75
*** 75 *** *** *** 75 *** ***
*** ***
*** ***
50 50 50
25 25 25
0 0 0
Figura 26. Efecto de 0,1 M de GHRH y 0,1 M de antagonistas de GHRH sobre

la viabilidad celular de las tres lneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3, valorado
por ensayo MTT. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control.
Los datos corresponden a la media E.S.M. de diez experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 103 -
4.2.2 PROLIFERACIN CELULAR
En este apartado se compara como afecta el tratamiento con GHRH,

JMR-132, JV-1-38, MIA-602, MIA-606 y MIA-690 a la proliferacin de
clulas prostticas. Para ello se utiliza la tcnica de incorporacin de BrdU en
las lneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3, tras 24 h de tratamiento con los
distintos pptidos. Posteriormente, se mide el efecto sobre el PCNA, protena
nuclear requerida para la sntesis de DNA y, por ende, marcadora de la
proliferacin celular.
4.2.2.1 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en la proliferacin en

clulas RWPE-1, LNCaP y PC3
En primer lugar se realiza un ensayo dosis-respuesta en clulas PC3 y as

poder comprobar que la concentracin de GHRH elegida en el ensayo de MTT
es la adecuada para valorar el nivel de incorporacin de BrdU. En la figura 27,
se observa que la concentracin 0,1 M provoca un aumento significativo de un
25% en la incorporacin de BrdU en las clulas tumorales PC3, corroborando la
concentracin ptima elegida en el anterior apartado.
40
Incorporacin de BrdU
(% del total de clulas)
*** **
30
20
10
Control 10-9 10-7 10-5
GHRH (M)
Figura 27. Efecto de GHRH en la incorporacin de BrdU en clulas PC3. Los

resultados se expresan en porcentaje respecto al control. Los datos corresponden a la
media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 104 -
La comparacin del efecto de GHRH y antagonistas sobre la proliferacin

en las tres lneas celulares se representa en la figura 28; en ella se observa que el
tratamiento con la hormona incrementa la incorporacin de BrdU en las tres
lneas, siendo el efecto significativamente mayor en las clulas no tumorales
respecto a su control (72%). Por otro lado, el tratamiento con los antagonistas
ocasiona un efecto diferente sobre la proliferacin de cada lnea celular. En las
clulas RWPE-1, el tratamiento con los antagonistas JMR-132, JV-1-38, MIA-
606 y MIA-690 no produce cambios en el porcentaje de incorporacin de BrdU
de esta lnea celular. Sin embargo, el antagonista MIA-602 provoca una
reduccin del 42%. En el caso de las LNCaP, todos los antagonistas disminuyen
significativamente el porcentaje de incorporacin de BrdU entre 26-40%, siendo
el antagonista MIA-690 el que provoca la mayor reduccin. El tratamiento con
cada uno de los antagonistas en las clulas PC3, provoca una reduccin en la
proliferacin, destacando los antagonistas MIA-602 y MIA-690 al provocar una
disminucin de hasta un 50% frente a su valor control.
RWPE-1 LNCaP PC3

40 40 40
***
***
30 30 30
**
**
20 20 20 ***
** *** ***
** *** *** *** *** ***
10 10 10
Figura 28. Efecto de GHRH y sus antagonistas en la incorporacin de BrdU en

clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
control tras 24 h de tratamiento. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cinco
experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 105 -
4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la proliferacin

inducida por GHRH en clulas PC3
Para poder estudiar con que magnitud los antagonistas bloquean el efecto
producido por GHRH sobre la proliferacin celular, se realiza un pre-
tratamiento de 1 hora con 0,1 M de GHRH en clulas PC3, y a continuacin se
trata con concentraciones crecientes de los antagonistas de GHRH y se mide
la incorporacin de BrdU, tras 24 h de tratamiento. Los resultados se
representan en la figura 29, en ella se observa que los antagonistas bloquean
totalmente el efecto de GHRH sobre la incorporacin de la BrdU desde 0,01
M. Adems, a partir de 0,1 M los resultados muestran una disminucin de la
proliferacin con respecto al valor control (sin tratar con GHRH), lo que indica
que los antagonistas tienen tambin un efecto independiente de GHRH. Otro
dato interesante es el que se observa con los antagonistas de la serie MIA, ya
que estos provocan el bloqueo total a partir de 0,001 M, concentracin menor
que la de los otros antagonistas.
- 106 -
Pre-tratamiento GHRH 0,1 M Pre-tratamiento GHRH 0,1 M

40 40
***

***
30 ++ ++ 30
+++ +++ +++
+++
20 +++ 20 +++ +++
10 10
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0 10 -9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento JMR-132 (M) Tratamiento JV-1-38 (M)
Pre-tratamiento GHRH 0,1 M Pre-tratamiento GHRH 0,1 M

40 40
*** (% del total de clulas) ***

30 +++ +++ +++ 30 +++

+++ +++ +++
+++
20 20
+++
+++
10 10
0 0
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento MIA-602 (M) Tratamiento MIA-606 (M)
Pre-tratamiento GHRH 0,1 M

40
***
30
+++ +++
+++
+++
20
10 +++
0
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento MIA-690 (M)
Figura 29. Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la incorportacin de BrdU

en clulas PC3 pretratadas con GHRH. Los resultados se expresan en porcentaje
respecto al valor control, tras 1 h de pre-tratamiento con GHRH (0,1 M) y 24 h de
tratamiento con los antagonistas a distintas concentraciones. Los datos corresponden a
la media E.S.M. de seis experimentos independientes; ***, p<0,001 con respecto al
control; ++, p<0,01; +++, p<0,001 con respecto a GHRH.
- 107 -

PCNA en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3
A continuacin, se evala como vara la expresin de una molcula

implicada directamente en la proliferacin celular, PCNA, tras el tratamiento
con GHRH y sus antagonistas, en las tres lneas celulares.
En primer lugar, se realiza un ensayo tiempo-respuesta del tratamiento

con GHRH (0,1 M) en las tres lneas celulares. Los resultados se muestran en
la figura 30; en ella se observa que las clulas no tumorales, RWPE-1,
incrementan la expresin de PCNA un 53%, a las 8 h; LNCaP lo hace a partir de
las 4 h, presentando un valor mximo de expresin, a las 8 h, de un 47% ms
respecto a su valor control; y las clulas PC3 presentan una expresin de PCNA
ms temprana, siendo significativo a partir de tan solo una hora de tratamiento
y mantenindose hasta las 8 h, el valor mximo de la expresin (65%) se observa
a las 4 h.
RWPE-1
PCNA
-Actina
175
***
**
Niveles de protena
150
(% vs. Control)
125
100
75
50
0 1 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
LNCaP PC3
PCNA PCNA
-Actina -Actina
175 175
***
Niveles de protena
Niveles de protena
150 *** 150 ***

(% vs. Control)
(% vs. Control)
***
125 125 **
100 100
75 75
50 50
0 2 4 8 16 24 0 1 2 4 8 16 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
- 108 -
Figura 30. Estudio cintico del tratamiento de GHRH (0,1 M) sobre la

expresin de PCNA en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Se realiza un ensayo de
Western blot. Los resultados se expresan en porcentaje respecto a su correspondiente
valor control, tras 24 h de tratamiento. Los datos corresponden a la media E.S.M. de
cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuacin se determina como afectan los antagonistas a la expresin

de PCNA tras 8 h de tratamiento. Los resultados se representan en la figura 31,
en ella se observa que en las clulas no tumorales, RWPE-1, la expresin de
PCNA se reduce significativamente un 22% al realizar el tratamiento con el
antagonista MIA-690. En la lnea celular LNCaP, el antagonista MIA-690
provoca un 32% menos de expresin del PCNA, el resto de antagonistas no
inducen cambios significativos en la protena; sin embargo, todos los
antagonistas provocan cambios en la expresin del PCNA en las clulas PC3,
donde el mayor descenso se observa para el tratamiento con MIA-690, un 37%,
con respecto a su valor control.
RWPE-1 LNCaP PC3

PCNA
-Actina
*** * ***
150 150 150
Niveles de protena
Niveles de protena
Niveles de protena
(% vs. Control)
(% v s. Control)
(% vs. Control)
100 100 100

* *
* * *
***
50 50 50
0 0 0
Figura 31. Efecto de GHRH (0,1 M) y de sus antagonistas (0,1 M) sobre la

expresin de PCNA en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. El efecto fue evaluado por
ensayos de Western blot. Los resultados se expresan en porcentaje respecto a su
correspondiente valor control tras 8 h de tratamiento. Los datos corresponden a la
media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 109 -
4.2.3 CICLO CELULAR Y APOPTOSIS EN PC3
En este apartado se estudia si GHRH o sus antagonistas provocan

variaciones en las distintas fases del ciclo celular, para a continuacin
determinar si tiene efecto sobre la muerte celular por apoptosis, ambos estudios
se realizan en clulas de CP independiente de andrgenos, PC3. Se valora
tambin su efecto sobre las protenas nucleares p53 y p21, y sobre protenas
mitocondriales pro- y anti-apoptticas, Bax y Bcl2, respectivamente.
4.2.3.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular
Las variaciones producidas por el neuropptido y sus antagonistas sobre

el ciclo celular, se determinan mediante ensayos de citometra de flujo, tras
tratamientos de 8 h. En este ensayo se estudia el contenido de DNA de la clula
mediante una tincin con yoduro de propidio, de este modo, las clulas en fase
G1 son diploides (2n), en fase G2/M, son tetraploides (4n), la fase S es
intermedia a G1 y G2/M y por ltimo la fase SubG0 est formada por las
clulas muertas con dotacin menor a 2n. Los resultados de la figura 32
muestran que el tratamiento con GHRH provoca una disminucin en el
porcentaje de clulas en fase G1 de un 28%, as como un incremento en la fase
G2/M de un 27%. En el caso de los antagonistas se observa un cambio en todas
las fases del ciclo, el ms importante en la fase SubG0, donde el nmero de
clulas muertas aumenta hasta 5 veces y en la fase G2/M donde las clulas se
reducen algo ms de la mitad, comparando con las clulas sin tratar. Adems las
clulas de la fase G1 disminuyen un 20% y las de la fase S aumentan hasta un
100%. Estos interesantes resultados muestran que los antagonistas de GHRH
provocan por si solos un aumento de la muerte celular y una parada de ciclo en
la fase S, lo que justifica en parte, la disminucin de la proliferacin mostrada en
la figura 28.
- 110 -
G1
CONTROL G1 GHRH
130
130
SubG0
SubG0 G2/M
G2/M S
S
FL2A FL2A
130
130
G1 JMR-132 G1 JV-1-38
SubG0 SubG0
S S
G2/M G2/M
FL2A FL2A
130
130
130
MIA-602 G1
MIA-606 G1 MIA-690
G1
SubG0 SubG0 SubG0
S S S
G2/M G2/M G2/M
FL2A FL2A FL2A
SubG0
60 G1
S
*** *** *** G2/M
***
%Clulas / fase
*** ***
40
***
*** *** *** *** ***
20
*** *** *** *** *** ***
*** *** *** ***
0
Control GHRH JMR-132 JV-1-38 MIA-602 MIA-606 MIA-690
Figura 32. Estudio del ciclo celular tras los tratamientos con 0,1 M GHRH y con
0,1 M de los antagonistas de GHRH, a las 8 h. El estudio se realiza mediante
ensayos de citometra de flujo. Los resultados que aparecen en la grfica inferior se
expresan en porcentaje de clulas presentes en cada fase del ciclo celular. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; ***, p<0,001
en comparacin con los valores control.
- 111 -
4.2.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre el factor de

transcripcin p53 en PC3
Como se ha visto en la introduccin, una de las protenas ms

importantes implicadas en ciclo celular es p53. Para comprobar si las
variaciones producidas en el ciclo celular por GHRH y sus antagonistas se
deben a variaciones en los niveles de p53, se analiza su expresin tras los
correspondientes tratamientos en clulas PC3. Los resultados representados en
la figura 33A muestran que GHRH produce una disminucin de los niveles de
mRNA de un 15% tras 30 min de tratamiento. Asimismo, se reduce un 30% la
expresin proteica de p53 tras 45 min de tratamiento, siendo mayor a los 60 min
de tratamiento (42%) (Figura 33B), comparando con los valores de clulas sin
tratar.
A) B)
p53 p53
-Actina -Actina
100
100
Niveles de protena
Niveles mRNA
(% vs. 0 min)
(% vs 0 min)
** 75 ***
80 ***
50
60
25
0 5 15 30 45 60 0 5 15 30 45 60
Figura 33. Estudio del mRNA (A) y de los niveles proteicos (B) de p53 tras el
tratamiento con 0,1 M GHRH a diferentes tiempos en clulas PC3. El estudio se
realiza mediante ensayos de RT-PCR y Western blot, respectivamente. Los resultados
se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a la media
E.S.M. de cuatro experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuacin, se estudia cmo afecta a los niveles de p53 el tratamiento

con los antagonistas en clulas PC3. En la figura 34A, se observa como solo los
- 112 -
tres antagonistas de la serie MIA producen un incremento significativo del

mRNA de p53 a los 30 min. Asimismo, JMR-132, MIA-606 y MIA-690
incrementan significativamente los niveles proteicos de p53 tras 45 min (Figura
34B).
A) B)
p53 p53
-Actina -Actina
150 150
* ** **
* * *
Niveles de protena
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100
50 50
0 0
Figura 34. Estudio de los niveles de mRNA (A) y proteicos (B) de p53 tras el
tratamiento con 0,1 M de los antagonistas de GHRH a 30 y 45 min,
respectivamente, en clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR y
Western blot, respectivamente. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
valor control. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos
independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.3.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre p21 en PC3
Se sabe que p53 regula directamente los niveles del mRNA de p21,
influyendo as sobre protenas implicadas en ciclo celular. En este apartado se
valoran los niveles de mRNA de p21 tras el tratamiento con GHRH y sus
antagonistas, mediante ensayos de RT-PCR. Los resultados de la figura 35A
muestran que el neuropptido disminuye un 27% los niveles de p21 tras 2 h de
tratamiento. Por el contrario, los antagonistas JV-1-38 y MIA-690
incrementan un 38% los niveles de p21 tras 2 h de tratamiento (Figura 35B).
- 113 -
A) B)
p21 p21
-Actina -Actina
150
** ***
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
100
50
Figura 35. Efecto de los tratamientos con 0,1 M de GHRH (A) a diferentes
tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, sobre los niveles
de mRNA de p21 en clulas PC3 El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre las protenas Bcl2 y

Bax implicadas en apoptosis en PC3
La variacin del nmero de clulas observada en los estudios de

proliferacin y ciclo celular tras tratar con los antagonistas apunta como una
posible causa a la muerte programada (apoptosis). Por ello, en este apartado se
estudia si el tratamiento con GHRH o con sus antagonistas afecta a la apoptosis
celular, analizando los niveles de expresin de las protenas Bax (pro-
apopttica) y Bcl2 (anti-apopttica), en clulas PC3.
Los resultados de la figura 36A muestran que tras 16 h de tratamiento

con el neuropptido disminuyen los niveles de Bax y aumentan los de Bcl2.
Adems, el ratio de ambas molculas (Bax/Bcla2) es menor lo que supone una
disminucin de la apoptosis. Por el contrario, el tratamiento con los
antagonistas (Figura 36B) induce una disminucin en la expresin de Bcl2
- 114 -
junto con un aumento de Bax, provocando un incremento en el valor del ratio

Bax/Bcl2, lo que indica un aumento en la apoptosis celular.
A) Bax B) Bax
Bcl2 Bcl2
-Actina -Actina
2,0
***
**
Ratio BAX / BCL2

1,5
*
1,0
0,5
tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 16 h, sobre los
niveles de Bax y Bcl2 en clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de
Western blot. Los resultados se expresan como ratio de Bax/Bcl2. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001, respecto a tiempo 0 (A) y al control (B).
4.2.4 ADHESIN CELULAR
Otro proceso importante en el estudio de la progresin tumoral es la

adhesin celular, que mide la capacidad que presentan las clulas para adherirse
a la matriz extracelular e impedir su migracin. Para evaluar este fenotipo se
realizan ensayos tiempo-respuesta de adhesin a un fondo de colgeno tipo I,
tras los diferentes tratamientos. Se estudia adems el efecto sobre las protenas
E-cadherina y -catenina, marcadoras del fenotipo de adhesin.
- 115 -
4.2.4.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la adhesin celular de

RWPE-1, LNCaP y PC3
Los resultados de la figura 37 muestran que el tratamiento con GHRH

provoca una disminucin de la adhesin en las tres lneas celulares. El valor de
la absorbancia encontrado solo es significativo para la lnea celular PC3, donde
se reduce en un 42% desde los 10 min de tratamiento. Por otro lado, los
tratamientos con los antagonistas provocan, en las tres lneas celulares, un
incremento significativo de la adhesin a colgeno, de modo tiempo-
dependiente, alcanzando un valor mximo a los 80 min. (Densidad ptica vs. Control)
(Densidad ptica vs. Control)
Control Control
0,15 0,15
GHRH MIA-602
Adhesin celular
Adhesin celular
JMR-132 MIA-606
***
0,10 *** *** JV-1-38 0,10 *** ** MIA-690
*** GHRH
***
RWPE-1 *** ** *** ***
***
0,05 *** 0,05 *** *
*** ***
****** ***
*
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
*** Control Control

0,15 0,15 ***
GHRH GHRH
Adhesin celular
*** ***
Adhesin celular
* JMR-132 MIA-602
0,10 JV-1-38 0,10 *** MIA-606
***
LNCaP *** MIA-690
**
0,05 0,05
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
CTRL
0,15 GHRH ***

0,15
JMR132 Control
***
Adhesin celular
*** *** JV-1-38

*** *** GHRH
***
Adhesin celular
*** MIA-602
0,10 *** ***
*** 0,10 *** *** MIA-606
PC3 ***
** ** MIA-690
***
0,05 *** ***
0,05
*** *** ***
*** *** *** *** ***
***
****** *** ***
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (min)
Tiempo (min)
- 116 -
Figura 37. Efecto de GHRH (0,1 M) y sus antagonistas (0,1 M), sobre la
adhesin celular a colgeno en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto a su correspondiente valor control. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de diez experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
A modo comparativo se muestra en la figura 38 el efecto sobre la

adhesin de las tres lneas celulares, tras el tratamiento con los pptidos durante
80 min. Los datos indican que las clulas RWPE-1 son las que presentan mayor
adhesin celular con el antagonista JV-1-38 (96%), seguido de cerca por el resto
de antagonistas (entre 58 y 86% de aumento en la adhesin celular con respecto
al control). Los resultados en las LNCaP indican que el tratamiento con los
antagonistas de GHRH provoca un aumento de la adhesin celular entre 47% y
87%, siendo el antagonista JV-1-38 el que present un mayor incremento, al
igual que ocurre con los resultados obtenidos en las clulas RWPE-1. Para las
PC3 las diferencias entre las clulas tratadas y no tratadas fueron de hasta un
84% de incremento en la adhesin celular, obteniendo el mayor valor tras el
tratamiento con el antagonista MIA-690.
RWPE-1 LNCaP PC3

0,15 0,15 *** *** ***

*** 0,15
*** ***
*** *** *** *** ***
Adhesin celular
Adhesin celular
***
Adhesin celular
** ** ***
0,10 0,10 0,10
0,05 0,05 0,05 ***
0 0 0
Figura 38. Efecto de GHRH (0,1 M) y sus antagonistas (0,1 M) en la adhesin a

colgeno de clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto a su correspondiente valor control tras 80 min de tratamiento. Los
datos corresponden a la media E.S.M. de diez experimentos independientes; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
- 117 -
4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de E-

cadherina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3.
Tras comprobar las variaciones en la adhesin celular producidas por

GHRH y sus antagonistas, se estudia si dichas variaciones afectan a E-
cadherina, protena marcadora de la adhesin, en sentido inverso, es decir, que
un aumento de E-cadherina supone una menor adhesin, y viceversa.
Se tratan las clulas a diferentes tiempos con GHRH (0,1 M), y se

valoran los niveles de E-cadherina por Western blot. Los resultados
representados en la figura 39 indican que la lnea celular no tumoral, RWPE-1,
no presenta variacin en la expresin de la protena E-cadherina para ninguno
de los tiempos examinados. Sin embargo, las lneas celulares tumorales, LNCaP
y PC3, muestran una disminucin significativa de los niveles de E-cadherina.
Las primeras sufren una reduccin del 38% a las 4 h de tratamiento que se
mantiene hasta las 8 h. En las PC3, la hormona provoca a partir de las 2 h una
mayor disminucin, llegando hasta un 70% a las 8 h, comparando con los
valores controles.
- 118 -
RWPE-1
E-cadherina
-Actina
100
Niveles de protena
80
(% vs. 0 h)
60
40
20
0
0 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
LNCaP PC3
E-cadherina E-cadherina
-Actina -Actina
100 100
Niveles de protena
Niveles de protena
*
80 * 80
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
** *
60 60
***
40 40 ***
20 20
0 0
0 2 4 8 16 24 0 2 4 8 16 24
Figura 39. Efecto de GHRH (0,1 M) en la expresin de la protena E-cadherina

en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados medidos por Western blotting se
expresan en porcentaje respecto al valor del tiempo cero para cada lnea celular. Los
datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuacin, se evala el efecto sobre la expresin de E-cadherina, tras

el tratamiento con los antagonistas, a los tiempos en los que GHRH provoca un
mayor descenso en los niveles de E-cadherina. Los resultados que se observan
en la figura 40 muestran que en las clulas RWPE-1, tras 8 h de tratamiento,
solamente el antagonista MIA-690 provoca un aumento significativo de un 25%.
Las clulas LNCaP muestran un incremento significativo de los niveles de E-
cadherina, tras 4 h de tratamiento con JMR-132 y MIA-690 (18% y 22%,
respectivamente). En las clulas PC3, el incremento de la E-cadherina es
- 119 -
bastante acusado llegando a un 72% para clulas tratadas con el MIA-690, por
encima de los niveles de la protena en clulas sin tratar, tras 8 h de tratamiento.
RWPE-1 LNCaP PC3
E-cadherina
-Actina
200 200 200

***
Niveles de protena
Niveles de protena
Niveles de protena
150 ** **
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
150 150
* ** **
100 ** 100 ** 100
50 50 50
***
0 0 0
Figura 40. Efecto de GHRH (0,1 M) y sus antagonistas (0,1 M) en la expresin de

la protena E-cadherina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados medidos por
Western blotting se expresan en porcentaje respecto al valor control para cada lnea
celular. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos
Por ltimo, se analiza a diferentes tiempos el comportamiento del

antagonista con mayor efecto, MIA-690, sobre la expresin de la E-cadherina.
En la figura 41, se muestra que en las clulas no tumorales, RWPE-1, el
antagonista provoca un aumento significativo (24%) en los niveles de E-
cadherina a las 8 h de tratamiento. En las LNCaP se produce un 26% de
incremento en la expresin de la protena a las 4 h que prcticamente se
mantiene hasta las 24 h. El efecto ms acusado se observa en las clulas PC3
donde se produce un aumento de hasta un 43% a las 24 h del tratamiento con
MIA-690, en comparacin con los valores controles.
- 120 -
RWPE-1
E-cadherina
-Actina
LNCaP PC3
E-cadherina E-cadherina
-Actina -Actina
Figura 41. Estudio cintico del tratamiento con el antagonista MIA-690 (0,1 M)
sobre los niveles de expresin de la protena E-cadherina en clulas RWPE-1,
LNCaP y PC3. Los resultados medidos por Western blotting se expresan en
porcentaje respecto al valor control para cada lnea celular. Los datos corresponden a la
media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de -

catenina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3.
Como se ha visto en la introduccin, E-cadherina est directamente

relacionada con -catenina en el interior celular. La reduccin que provoca
GHRH sobre los niveles de E-cadherina puede afectar a la localizacin de -
catenina. Para poder estudiar esta posible interaccin, se valora la expresin de
- 121 -
-catenina por Western blot, realizando un ensayo tiempo-respuesta con

GHRH (0,1 M) en las tres lneas celulares.
Los resultados representados en la figura 42 muestran los niveles de

expresin de -catenina tras distintos tiempos de tratamiento con 0,1 M de
GHRH en lisados celulares totales. En ellos se observa que la expresin de la
protena no vara significativamente en el caso de las clulas RWPE-1 en
ninguno de los tiempos evaluados. Por el contrario, los niveles de -catenina
aumentan significativamente en ambas lneas celulares tumorales a partir de las
2 h de tratamiento. En LNCaP el valor mximo en la expresin de la protena se
produce a las 8 h (21%), mientras que en PC3 es a las 2 h de tratamiento (29%),
en comparacin con los valores controles, correlacionndose estos efectos con la
disminucin producida en la E-cadherina.
RWPE-1
-catenina
-Actina
LNCaP PC3
-catenina -catenina
-Actina -Actina
- 122 -
Figura 42. Estudio cintico del tratamiento con GHRH (0,1 M) sobre los niveles
de expresin de -catenina en clulas RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados
medidos por Western blot se expresan en porcentaje respecto al valor control para
cada lnea celular. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos
A continuacin, se valora el efecto de los antagonistas sobre la expresin

de -catenina a las 8 y 2 h, para LNCaP y PC3, respectivamente. Como se
observa en la figura 43, todos los antagonistas reducen la expresin de -
catenina en ambas lneas celulares. En las clulas LNCaP los antagonistas JMR-
132 y JV-1-38 provocan la mayor reduccin de hasta un 37%. Por otro lado, en
PC3, los antagonistas de la serie MIA reducen ms acusadamente la expresin
de la protena alrededor de un 42%, comparando con los valores controles.
LNCaP PC3
-catenina
-Actina
100 100
Niveles de protena
Niveles de protena
** ** * *
(% vs. Control)
(% vs. C ontrol)
*
*** *** *** *** ***
50 50
0 0
Figura 43. Efecto del tratamiento con los antagonistas de GHRH (0,1 M) sobre
los niveles de -catenina en clulas LNCaP y PC3. Se realizan ensayos de Western
blot, tras 8 y 2 h de tratamiento en LNCaP y PC3, respectivamente. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control para cada lnea celular. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
- 123 -
La localizacin subcelular de la -catenina es clave en su sealizacin

celular, por ello se analiza su expresin en citosol y en ncleo tras el tratamiento
con GHRH y sus antagonistas. Para este objetivo se selecciona la lnea celular
PC3, en la que se produce un mayor incremento de la expresin de -catenina
tras el tratamiento con GHRH. Los resultados de la figura 44A, muestran como
a medida que disminuye la expresin citoslica de -catenina aumenta la
nuclear, tras el tratamiento con el neuropptido. Por otro lado, se analiza si los
antagonistas son capaces de realizar la accin contraria, tras 8 h de tratamiento.
Como se muestra en la figura 44B, exceptuando al MIA-606, los antagonistas
provocan un aumento de la expresin citoslica junto con una disminucin de la
nuclear.
A) Citosoles Ncleos
-catenina
-Actina
150 150 ***

Niveles de protena
Niveles de protena
** * *
125 125
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
100 100
** *** ***
75 75
50 50
0 0,5 1 2 4 8 16 24 00,51 2 4 8 16 24
B) Citosoles Ncleos
-catenina
-Actina
150 150
*** ***
** **
Niveles de protena
Niveles de protena
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100
*** *** ** ***
50 50
0 0
- 124 -
Figura 44. Efecto de los tratamientos con 0,1 M GHRH (A) a diferentes tiempos
y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 8 h, sobre la localizacin
subcelular de la protena -catenina en clulas PC3. Los resultados medidos por
Western blotting se expresan en porcentaje respecto al valor control para cada lnea
celular. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cinco experimentos

CD44, c-Myc y Ciclina D1 en clulas PC3.
El aumento de -catenina en el ncleo de las clulas PC3 puede inducir la

transcripcin de genes diana como CD44, c-myc y ciclina D1. Por ello, se analizan
los nveles de mRNA de dichos genes mediante un ensayo de RT-PCR tiempo-
respuesta tratando las clulas PC3 con GHRH (0,1 M). Los resultados
representados en la figura 45A muestran que tras el tratamiento se produce un
aumento tiempo-dependiente en los niveles de mRNA de los tres genes
evaluados, siendo mximo para CD44 y ciclina D1 a las 2 h (22-24%). Hay que
destacar que los niveles de c-myc varan de una forma ms notable tras el
tratamiento con el neuropptido. As, se observa un incremento en los niveles de
mRNA a partir de los 15 min, con un 46% como valor mximo a las 6 h.
A continuacin, se estudia el efecto de los antagonistas sobre los genes

diana tras 2 h de tratamiento (Figura 45B). En los resultados se observa que los
antagonistas reducen los niveles de mRNA de los tres genes diana de manera
muy significativa. El tratamiento ms efectivo fue con el antagonista MIA-690
que disminuye los niveles de los tres genes por debajo de un 50%, comparando
con los valores control.
- 125 -
A)
CD44 c-myc ciclina D1
-Actina -Actina -Actina
150 ** 150
150
*
Nivel de mRNA
* *
Nivel de mRNA
Nivel de mRNA
* *
(% vs. 0 h )
* * *
(% vs. 0 h )
(% vs. 0 h )
100 100 100
50 50 50
0 0,25 0,5 1 2 4 6 0 0,25 0,5 1 2 4 6 0 0,250,5 1 2 4 6
Tiempo (h) Tiempo (h) Tiempo (h)
B)
CD44 c-myc ciclina D1
-Actina -Actina -Actina
100 100
100
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
Niveles demRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
**
**
* * * *** ***
50 50 50 ***
** ** ***
*** ***
0 0 0
tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, sobre los niveles
de mRNA de CD44 , c-myc y ciclina D1 , en clulas PC3. El estudio se realiza
mediante ensayos de RT-PCR. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
valor control para cada lnea celular. Los datos corresponden a la media E.S.M. de
cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.5 MIGRACIN CELULAR.
La migracin celular es uno de los procesos ms importantes en la

progresin tumoral prosttica. Por ello, evaluamos la capacidad migratoria de
las clulas RWPE-1 y PC3 tras ser tratadas con GHRH y sus antagonistas,
mediante un ensayo de cierre de heridas tal como se indica en materiales y
mtodos. Los resultados mostrados en la figura 46, indican como en las clulas
no tumorales, RWPE-1, GHRH provoca un cierre de herida ms rpido que en
las clulas no tratadas, y todos los antagonistas retrasan el cierre de la herida.
- 126 -
En las clulas PC3 (Figura 47) el efecto de los tratamientos es ms

acusado. Tras 24 h en presencia del neuropptido se produce un cierre total,
mientras en las clulas no tratadas se mantiene casi un 25% de la herida sin
cerrar. Por el contrario, el tratamiento con los antagonistas provoca un mayor
retraso en la migracin de las clulas PC3, dejando alrededor de un 50% de la
herida sin cerrar tras 24 h.
- 127 -
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
75 **
Control
(% vs. 0 h)
***
50
25
Control ***
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
75 ***
(% vs. 0 h)
GHRH 50 ***
25
GHRH
0 ***
0h 4h 8h 24 h
100
**
Migracin celular
75 ***
(% vs. 0 h)
JMR-132 50 ***
25 JMR-132
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migracin celular
75 ***
(% vs. 0 h)
JV-1-38 50 ***
25 JV-1-38
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migracin celular
75 ***
(% vs. 0 h)
MIA-602 50 ***
25 MIA-602
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migracin celular
75
(% vs. 0 h)
***
MIA-606 50 ***
25 MIA-606
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
75 ***
MIA-690
(% vs. 0 h)
***
50
25 MIA-690
0
0h 4h 8h 24 h
0h 4h 8h 24 h
100 100 100 100
Migracin celular
*
(% vs. Control)
80
Migracin celular
Migracin celular
Migracin celular
75
(% vs. Control)
75 *
(% vs. Control)
75
(% vs. Control)
* * *
60 ***
50 ***
50 50 ** * *
40
25 25 25
20
0 0 0 0 ***
Figura 46. Microfotografas representativas del cierre de herida producido tras los
tratamientos con 0,1 M de GHRH y con 0,1 M de sus antagonistas, a diferentes
tiempos en clulas RWPE-1. Las fotografas se toman en un microscopio invertido
(20X). En la parte de la derecha se representan los porcentajes de cierre de la herida que
cada tratamiento provoca a distintos tiempos. En la parte inferior de la figura se
- 128 -
comparan los diferentes tratamientos realizados en cada uno de los tiempos evaluados.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control o el valor a las 0 h.
Los datos corresponden a la media E.S.M. de seis experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
** ***
75
Control
(% vs. 0 h)
50
Control ***
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
75 **
(% vs. 0 h)
GHRH 50
GHRH
25
***
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migracin celular
75
(% vs. 0 h)
***
JMR-132 50
JMR-132
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
**
75
(% vs. 0 h)
50 ***
JV-1-38 25 JV-1-38
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
**
75
(% vs. 0 h)
50 ***
MIA-602 25 MIA-602
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
75
(% vs. 0 h)
***
MIA-606 50
MIA-606
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migracin celular
**
75
MIA-690
(% vs. 0 h)
***
50
25
MIA-690
0
0h 4h 8h 24 h
0h 4h 8h 24 h
100 100 100 100
Migracin celular
Migracin celular
Migracin celular
Migracin celular
80
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
75 75 75
60 *
50 50 50
40
25 20 25 25
***
0 0 0 0
- 129 -
Figura 47. Microfotografas representativas del cierre de herida producido tras los
tratamientos con 0,1 M de GHRH y con 0,1 M de sus antagonistas, a diferentes
tiempos en clulas PC3. Las fotografas se toman en un microscopio invertido (20X).
En la parte de la derecha se representan los porcentajes de cierre de la herida que cada
tratamiento provoca a distintos tiempos. En la parte inferior de la figura se comparan los
diferentes tratamientos realizados en cada uno de los tiempos evaluados. Los resultados
se expresan en porcentaje respecto al valor control o el valor a las 0 h. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de seis experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.6 DEGRADACIN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR.
Las metaloproteasas son las encargadas de degradar la matriz

extracelular y as las clulas tumorales inician el proceso metastsico. En este
apartado, se valora la actividad gelatinoltica y la expresin de dos de las
metaloproteasas ms implicadas en dicho proceso, MMP9 y MMP2, en la lnea
celular PC3, representativa del estadio ms avanzado del CP. La actividad
gelatinoltica se determina mediante ensayos de zimografa y, la expresin de
mRNA mediante RT-PCR, en ambos casos tras el tratamiento con GHRH o sus
antagonistas.
Los resultados de la figura 48A, muestran un incremento en la actividad

gelatinoltica de ambas metaloproteasas tras 2 h de tratamiento con GHRH. La
pro-MMP9 aumenta hasta un valor mximo de 43% a las 2 h, mientras que, la
pro-MMP2 lo hace hasta un 90% a las 4 h de tratamiento, comparando ambas
con los valores controles. Por otro lado, en la figura 48B se observa que se
reduce la actividad gelatinoltica de ambas pro-MMPs tras 2 h de tratamiento
con los antagonistas. MIA-690 es el antagonista de GHRH que provoca una
disminucin ms acusada en ambas pro-MMPs, de hasta un 40%. Las formas
activas de las MMPs no se aprecian lo suficiente como para analizar posibles
variaciones de las mismas.
- 130 -
A)
Pro-MMP9 Pro-MMP2
***
175 200
Actividad gelatinoltica
**
150 ***
** * ***
(% vs. 0 h)
150
(% vs. 0 h)
125
100 100
75
50
50
0 2 4 8 16 24
0 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
Tiempo (h)
B)
Pro-MMP9 Pro-MMP2
100 100
* *
** ***
(% vs. Control)
***
(% vs. Control)
*** *** *** ***

50 50
0 0
Figura 48. Actividad gelatinoltica tras los tratamientos con 0,1 M de GHRH (A)
a diferentes tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, en
clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de zimografa. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control para cada lnea celular. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05;
**, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuacin se estudian los niveles de mRNA de ambas

metaloproteasas tras el tratamiento con GHRH y se compara el efecto de sus
antagonistas. Los resultados mostrados en la figura 49A muestran que tras el
tratamiento con GHRH se produce un significativo incremento a los 45 min
para el mRNA de MMP9 y MMP2, y a los 15 min para MMP2. Por el
contrario, tras 45 min de tratamiento con los antagonistas el mRNA de ambas
- 131 -
metaloproteasas disminuye (Figura 49B), siendo, de nuevo, el MIA-690 el

tratamiento ms efectivo.
A)
MMP9 MMP2
-Actina -Actina
B)
MMP9 MMP2
-Actina -Actina
100 100
**
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
**
(% vs. Control)
(% vs. Control)
** ** ***
50 50
0 0
tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 45 min, sobre los
niveles de mRNA de MMP9 y MMP2 en clulas PC3. El estudio se realiza mediante
ensayos de RT-PCR. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control.
Los datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 132 -
4.2.7 NEURODIFERENCIACIN.
La neurodiferenciacin es un proceso implicado en la progresin del CP

hacia la independencia andrognica. Por ello, en este apartado evaluamos como
puede afectar a dicho proceso GHRH y su antagonista ms efectivo, MIA-690.
Para este estudio se utilizan las clulas LNCaP, ya que se conoce que se
diferencian morfolgicamente y es fcilmente reconocible mediante la
visualizacin de neuritas.
Para evaluar si el tratamiento con GHRH y MIA-690 provoca

alteraciones en la morfologa de las clulas LNCaP, se realizan microfotografas
tras 1 h de tratamiento con GHRH y MIA-690, y se contabilizan las neuritas
que tengan el doble de la longitud del cuerpo de la clula sobre un total de 200
clulas. En los resultados de la figura 50 se observa como GHRH induce la
formacin de neuritas en un 90% de las clulas. Sin embargo, el antagonista
MIA-690 no provoca la alteracin morfolgica de las clulas. Adems, se realiza
un pre-tratamiento de 1 h con GHRH y a continuacin se trata con MIA-690
1 h, observando la aparicin de un 10% de neuritas lo que indica que el
antagonista produce un bloqueo de la neurodiferenciacin inducida por el
neuropptido. Las clulas LNCaP se neurodiferencian en ausencia de suero, lo
que se utiliza como control positivo.
- 133 -
CONTROL GHRH
MIA-690 GHRH+MIA-690
-FBS 24 h
Figura 50. Efecto del tratamiento con 0,1 M de GHRH y 0,1 M de MIA-690,
sobre la neurodiferenciacin en clulas LNCaP. Se incluye un control positivo de la
neudiferenciacin ya conocido como es mantener las clulas sin suero durante 24 h. Las
microfotografas se toman en un microscopio invertido (20X). Las imgenes son
representativas de un total de tres experimentos.
- 134 -
4.2.8 ANGIOGNESIS
El VEGF es uno de los factores pro-angiognicos ms importantes

implicados en progresin tumoral; por ello, se estudia el efecto que producen
GHRH y sus antagonistas sobre la produccin y liberacin de este factor en
clulas PC3 de cncer avanzado de prstata. En primer lugar, se valoran
mediante ELISA los niveles de VEGF165 liberado por las clulas al medio
extracelular tras el tratamiento con GHRH a diferentes tiempos. En la figura
51A se muestra como la hormona provoca un incremento de hasta un 52% de
VEGF liberado por las clulas a las 24 h, comparando con el valor control. A
continuacin se valora el efecto que ejercen los antagonistas de GHRH sobre la
liberacin de VEGF tras 24 h de tratamiento. Los resultados de la figura 51B
indican que solo los antagonistas de GHRH reducen los niveles de VEGF con
respecto al valor control, entre un 17% y un 29%.
A) B)
*** 100
160
VEGF165 (% vs. 0 h)
**
***
(% vs. Control)
*** *** ***

140
VEGF165
120 50
100
80 0
0 4 8 16 24 48 72
Tiempo (h)
Figura 51. VEGF165 secretado tras los tratamientos con 0,1 M de GHRH (A) a
diferentes tiempos y con 0,1 M de los antagonistas de GHRH (B) tras 24 h en
clulas PC3. El estudio se realiza mediante ELISA. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto al valor control para cada lnea celular. Los datos corresponden a la
media E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 135 -
4.3 EFECTO DE GHRH Y SUS ANTAGONISTAS SOBRE LA VA

DEL EGF.
La importancia de los miembros de la familia HER en la tumorignesis

est muy bien documentada actualmente. En este apartado se estudia la
interconexin entre GHRH y dos de los miembros ms importantes de la
familia HER, EGFR y HER2, evaluando la posible transactivacin de ambas
vas entre s, en la lnea celular PC3 de cncer de prstata independiente de
andrgenos.
4.3.1 EXPRESIN Y ACTIVACIN DE EGFR Y HER2.
La valoracin del efecto de GHRH sobre la expresin y activacin de

HER2 y EGFR se realiza mediante ensayos de Western blot en clulas PC3 a
diferentes tiempos. Los resultados de la figura 52 muestran como la expresin
de los receptores aumenta tras el tratamiento con el neuropptido a los 30-60
min, para EGFR, y a los 45-120 min, para HER2. Adems, GHRH incrementa
la fosforilacin de HER2 y EGFR a los 30 s (activacin temprana) y 30 min
(activacin tarda) de tratamiento, comparando con los valores controles de
clulas sin tratar.
EGFR HER2
p-EGFR p-HER2
-Actina -Actina
#
150 ** 150 ** ##
** *** #
Niveles de protena
Niveles de protena
125 125
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
#
100 100
75 EGFR 75 HER2
p-EGFR p-HER2
50
50
0,5 5 15 30 45 60 120
0,5 5 15 30 45 60 120
Tiempo (min)
Tiempo (min)
- 136 -
Figura 52. Efecto del tratamiento con 0,1 M de GHRH a diferentes tiempos
sobre los niveles de HER2 y EGFR, y su fosforilacin en clulas PC3. El estudio se
realiza mediante ensayos de Western blot. Los resultados se expresan en porcentaje
respecto al correspondiente valor control. Los datos corresponden a la media E.S.M.
de cinco experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, para EGFR y HER2; #,
p<0,05; ##, p<0,01, para p-EGFR y p-HER2.
A continuacin se comprueba si los antagonistas de GHRH, JMR-132 y

JV-1-38, y el ms efectivo de la serie MIA, el MIA-690, bloquean la
transactivacin inducida por GHRH. Los resultados muestran que los
antagonistas bloquean totalmente la fosforilacin inducida por el neuropptido a
los 30 s y 30 min para ambos receptores, EGFR y HER2 (Figura 53A y B,
respectivamente).
- 137 -
p-EGFR
30 s
30 min
-Actina
150 ** **
30 s
Niveles de protena
(% vs. C ontrol)
125 30 m
#
100 ##
### ### ## ###
75
50
25
0
0,1 M GHRH - + - - - + + +
0,1 M JMR-132 - - + - - + - -
0,1 M JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 MIA-690 - - - - + - - +
p-HER2
30 s
30 min
-Actina
150
*****
30 s
Niveles de protena
30 m
(% vs. Control)
# ###
100 ###
### ### ###
50
0
0,1 M GHRH - + - - - + + +
0,1 M JMR-132 - - + - - + - -
0,1 M JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 MIA-690 - - - - + - - +
Figura 53. Efecto producido por los antagonistas JMR-132, JV-1-38 y MIA-690 en
la transactivacin de EGFR (A) y HER2 (B) inducida por GHRH en clulas PC3.
Las clulas se pre-tratan durante 30 min con 0,1 M de los antagonistas, y luego se
tratan con 0,1 M de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
ensayos de Western blot. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor
control en los correspondientes tiempos. Los datos corresponden a la media E.S.M. de
cinco experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al control; #,
p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001, respecto a las clulas tratadas con GHRH.
- 138 -
4.3.2 HETERODIMERIZACIN DE EGFR-HER2.
Los receptores de la familia HER dimerizan cuando son activados por sus
ligandos; por ejemplo, se sabe que EGFR suele dimerizar con HER2. Por tanto,
es posible que GHRH transactive a EGFR y este a su vez fosforile a HER2
activndolo, formndose as el heterodmero. Para comprobarlo, se pre-tratan
las clulas con un inhibidor de EGFR, AG-1478 (10 M) o de HER2, AG-825
(10 M), durante 30 min; despus, se estimulan las clulas durante 30 s y 30 min
con GHRH, y se realiza la inmunodeteccin de HER2 fosforilado.
En la figura 54 se observa que la inhibicin de EGFR hace que el

tratamiento con GHRH no sea capaz de activar HER2, con lo cual se deduce que
GHRH primero activa a EGFR y este, a su vez, activa a HER2. Adems, tras
inhibir de forma especfica HER2, el neuropptido es capaz de incrementar el
nivel de HER2 fosforilado, posiblemente a travs de la activacin de EGFR.
p-HER2
30 s
30 min
-Actina
150
** *** 30 s
Niveles de protena
30 min
### ##
(% vs. Control)
100
50 *** ***
0
0.1 M GHRH - + - - + +
10 M AG1478 - - + - + -
10 M AG825 - - - + - +
- 139 -
Figura 54. Efecto de 0,1 M de GHRH sobre la heterodimerizacin de EGFR y

HER2 en clulas PC3. Las clulas se pre-tratan durante 30 min con 0,1 M de los
inhibidores de EGFR, AG-1478 (10 M), y de HER2, AG-825 (10 M), durante 30 min,
y luego se tratan con 0,1 M de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza
mediante ensayos de Western blot con un anticuerpo especfico de HER2 fosforilado.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control a los tiempos
correspondientes. Los datos corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos
independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, comparando con el valor control; ##, p<0,01;
###, p<0,001, respecto a los valores de clulas tratadas con AG-825.
4.3.3 VAS DE SEALIZACIN IMPLICADAS EN LA

TRANSACTIVACIN DE EGFR Y HER2 MEDIADA POR GHRH
Como se ha visto en la introduccin, los receptores de la familia HER

pueden ser transactivados siguiendo distintas vas de sealizacin que pueden
ser dependientes o no de ligando. En este apartado se analiza la posible va de
sealizacin que sigue GHRH en la transactivacin de los receptores de la
familia HER.
4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivacin de EGFR y

HER2 por GHRH
Entre los mediadores intracelulares que pueden estar implicados en la

transactivacin independiente de ligando se encuentran PKA y Src. Para
evaluar si estas molculas estn implicadas en la transactivacin de EGFR y
HER2 inducida por GHRH, se emplea un inhibidor de PKA, H89 (10 M), y de
Src, PP2 (10 M), durante 15 min y 90 min, respectivamente.
Las clulas se pre-tratan con H89 durante 15 min o PP2 durante 90 min,
y se incuban con GHRH (0,1 M) durante 30 s y 30 min, y posteriormente se
analiza la activacin de EGFR y HER2. Como se observa en la figura 55, la
activacin de EGFR y HER2 producida por GHRH es inhibida por H89 y PP2 a
los 30 s de tratamiento, pero no a los 30 min. Estos resultados implican a PKA y
- 140 -
Src en la activacin temprana de EGFR y HER2. Los inhibidores H89 y PP2,

por s solos, no provocaban cambios en los niveles de fosforilacin de ambos
receptores.
p-EGFR
30 s
30 min
-Actina
**
150 **
Niveles de protena
(% vs. Control)
30 s
100 #
## 30 min
50
0
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M H89 - - + - + -
10 M PP2 - - - + - +
p-HER2
30 s
30 min
-Actina
150
** ***
Niveles de protena
30 s
(% vs. Control)
30 min
100 ###
###
50
0
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M H89 - - + - + -
10 M PP2 - - - + - +
Figura 55. Efecto del pre-tratamiento con los inhibidores de PKA y Src sobre la
activacin de EGFR y HER2 producida por GHRH (0,1 M) a los 30 s y 30 min en
clulas PC3. Las clulas se pre-tratan con 10 M de H89 durante 15 min, y con 10 M
de PP2 durante 90 min, y luego se tratan con 0,1 M de GHRH durante 30 s y 30 min.
El estudio se realiza mediante ensayos de Western blot con un anticuerpo especfico
- 141 -
contra EGFR y HER2 fosforilados. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al

valor control a los tiempos correspondientes. Los datos corresponden a la media
E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al valor
control de clulas sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001, respecto a los valores de
clulas tratadas con GHRH.
4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activacin de

pSrc
Como hemos visto en el anterior apartado, Src es una de las molculas

implicada en la va de transactivacin de EGFR y HER2 mediada por GHRH.
Por ello, mediante un ensayo de Western blot, con un anticuerpo especfico
contra Src fosforilado en la Tyr 416, evaluamos si el neuropptido activa dicha
protena.
Los resultados de la figura 56 muestran que GHRH incrementa los

niveles de p-Src desde los 30 s, con una estimulacin mxima a los 30 min y 2 h
de tratamiento.
- 142 -
0,1 mM GHRH. Tiempo

Control 0,5 5 15 30 45 60
p-Src
-Actina
Control 2 h 4h 8h
p-Src
-Actina
Control 16 h 24 h
p-Src
-Actina
Figura 56. Efecto de 0,1 M de GHRH sobre la activacin a diferentes tiempos de

Src en clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de Western blot con un
anticuerpo especfico contra Src fosforilado en la Tyr 416. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto al valor de clulas no tratadas. Los datos corresponden a la media
E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuacin, se estudia la participacin de los receptores de GHRH en

la activacin de Src, mediante el bloqueo de los mismos con los antagonistas
JMR-132, JV-1-38 y MIA-690, a los 30 s y 30 min, tiempos a los que GHRH
transactiva EGFR y HER2. Los resultados de la figura 57 indican que los
antagonistas utilizados bloquean la activacin de Src mediada por GHRH,
implicndolos directamente en dicha activacin.
- 143 -
p-Src
30 s
30 min
-Actina
150
** 30 s
Niveles de protena
* 30m
(% vs. Control)
100
# ## ## ## ##
##
50
0
0,1 M GHRH - + - - - + + +
0,1 M JMR-132 - - + - - + - -
0,1 M JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 M MIA-690 - - - - + - - +
Figura 57. Efecto de los antagonistas de GHRH (0,1 M) sobre la activacin de

Src producida por GHRH (0,1 M) a los 30 s y 30 min de tratamiento en clulas
PC3. Las clulas se pre-tratan durante 30 min con 0,1 M de los antagonistas, y luego
se tratan con 0,1 M de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
ensayos de Western blot con un anticuerpo especfico contra Src fosforilado en la Tyr
416. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01, respecto al valor control de clulas sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01, respecto a
los valores de clulas tratadas con GHRH.
4.3.3.3 Implicacin de las metaloproteasas en la transactivacin de

EGFR y HER2 por GHRH.
En relacin a la va de transactivacin dependiente de ligando se sabe que

las metaloproteasas son capaces de liberar pro-ligandos que se unen a los
receptores de EGFR y HER2 activndolos. Para comprobar si este mecanismo
puede estar implicado en la transactivacin de EGFR y HER2 inducida por
- 144 -
GHRH, se emplea un inhibidor general de metaloproteasas, GM6001 (10 M),

y uno especfico de las ADAMs, TAPI-1 (10 M), durante 1 h para ambos
inhibidores.
Para estudiar dicho proceso, las clulas se pre-tratan con los inhibidores
durante 1 h, luego se tratan con GHRH (0,1 M) durante 30 s y 30 min, y
posteriormente se analiza la activacin de EGFR y HER2. En la figura 58
observamos que GM6001 y TAPI-1 inhiben la activacin de los receptores
producida por GHRH a los 30 min, sin encontrar cambios a los 30 s de
tratamiento. Estos resultados indican que GHRH induce la transactivacin
tarda a travs de las MMPs. Los inhibidores GM6001 y TAPI-1, por s solos,
no provocaban cambios en los niveles de fosforilacin de ambos receptores.
- 145 -
p-EGFR
30 s
30 min
-Actina
**
150 ** 30 s
30 min
Niveles de protena
(% vs. Control)
# ##
100
50
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M GM6001 - - + - + -
10 M TAPI-I - - - + - +
p-HER2
30 s
30 min
-Actina
150 *** 30 s
Niveles de protena
** 30 min
(% vs. Control)
100
###
###
50
0
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M GM6001 - - + - + -
10 M TAPI-I - - - + - +
Figura 58. Efecto del pre-tratamiento con los inhibidores de MMPs y ADAMs
sobre la activacin de EGFR y HER2 producida por GHRH (0,1 M) a los 30 s y
30 min en clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de Western blot con
un anticuerpo especfico contra EGFR y HER2 fosforilados. Los resultados se expresan
en porcentaje respecto al valor control a los tiempos correspondientes. Los datos
corresponden a la media E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***,
p<0,001, respecto al valor control de clulas sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###,
p<0,001, respecto a los valores de clulas tratadas con GHRH.
- 146 -

TACE/ADAM17.
Los resultados del apartado anterior indican la implicacin de las MMPs,

en concreto de las ADAMs, en la transactivacin tarda de EGFR y HER2
inducida por GHRH. Por ello, se estudia si GHRH es capaz de incrementar los
niveles de las ADAMs, y para ello se analiza TACE/ADAM17 (una de las
ADAMs ms estudiadas en la transactivacin de la familia de los HER), despus
del tratamiento con GHRH (0,1 M) a diferentes tiempos.
Los resultados mostrados en la figura 59 indican que GHRH incrementa

de forma significativa los niveles de TACE a partir de los 5 min, presentando
unos valores mximos de expresin a los 15 min y 8 h despus del tratamiento
con la hormona.
- 147 -
0,1 M GHRH, Tiempo
Control 1 5 15 30 60
TACE
-Actina
Control 2 h 4h 8h
TACE
-Actina
Control 16 h 24 h
TACE
-Actina
Figura 59. Efecto de 0,1 M de GHRH sobre la expresin de TACE/ADAM17 a

diferentes tiempos en clulas PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de
Western blot. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los
p<0,05; **, p<0,01.
4.3.3.5 Implicacin de la transactivacin de EGFR y HER2 inducida

por GHRH en angiognesis, adhesin y migracin celular.
Los receptores de la familia HER intervienen en el desarrollo de procesos

implicados en la progresin tumoral, como son angiognesis, adhesin y
migracin celular. En este bloque de resultados se analiza en qu medida el
efecto de GHRH sobre dichos procesos se ejerce a travs de la transactivacin
- 148 -
de EGFR y HER2 que el mismo induce. Para comprobarlo se emplea un

inhibidor especfico de la actividad tirosina quinasa de EGFR, AG-1478 (10
M), y de HER2, AG-825 (10 M). Las clulas se pre-tratan con cada uno de los
inhibidores durante 30 min, despus se incuban con GHRH (0,1 M) durante 30
s y 30 min, y se estudian las variaciones en adhesin, angiognesis y
migracin celular.
Como comprobamos anteriormente el tratamiento con GHRH provoca

una disminucin de la adhesin celular a una matriz de colgeno. Los resultados
de la figura 60A muestran que tras la inhibicin de HER2, GHRH no es capaz
de disminuir los niveles de la adhesin celular en ambos tiempos; sin embargo,
la inhibicin de EGFR no provoca ningn cambio. Esto indica que el receptor
HER2 est implicado en la disminucin de la adhesin celular provocada por
GHRH.
Por otro lado, se estudia si la transactivacin de los HER influye sobre la

secrecin de VEGF inducida por GHRH. En la figura 60B se comprueba que al
inhibir la fosforilacin del receptor de EGFR, el tratamiento con el
neuropptido no incrementa los niveles de VEGF secretado para ninguno de los
tiempos. Sin embargo, al inhibir la fosforilacin de HER2, GHRH si produce el
incremento de VEGF. Por ello se deduce que la transactivacin de EGFR est
implicada en la secrecin de VEGF producida por GHRH.
- 149 -
A)
100
#
30 s
Adhesin celular
#
(% vs. Control)
** 30 min
50 ***
0
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M AG-1478 - - + - + -
10 M AG-825 - - - + - +
B)
150
VEGF165 (% vs. Control)
100 # 30 s
###
30 min
50
0
0,1 M GHRH - + - - + +
10 M AG-1478 - - + - + -
10 M AG-825 - - - + - +
Figura 60. Efecto de los inhibidores de la fosforilacin EGFR y HER2 sobre la

adhesin celular (A) y la secrecin de VEGF (B) producidos por GHRH en clulas
PC3. Las clulas se pre-tratan durante 30 min con 0,1 M de los inhibidores de EGFR,
AG1478 (10 M), y de HER2, AG825 (10 M), durante 30 minutos para ambos, y luego
se tratan con 0,1 M de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
- 150 -
ensayos de adhesin celular a colgeno (A) y ELISA de VEGF165 (B). Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control a los tiempos correspondientes. Los
p<0,05; **, p<0,01; *** p<0,001, comparando con el valor control; #, p<0,05; ###,
p<0,001, respecto a los valores de clulas tratadas con GHRH.
A continuacin se evala si, de la misma forma que en la adhesin celular

y en la secrecin de VEGF, la transactivacin de EGFR y HER2 acta sobre
el aumento que GHRH provoca sobre la migracin celular en PC3. Para ello,
las clulas se pre-tratan con los inhibidores durante 30 min, despus se incuban
con GHRH y se realizan microfotografas a tiempo 0 y 24 h. En las imgenes de
la figura 61 se observa que, al igual que ocurra con la secrecin de VEGF, la
inhibicin de EGFR impide el efecto migratorio que induce el neuropptido en
condiciones normales. Por el contrario, la inhibicin de la fosforilacin de HER2
no provoca ningn cambio en el efecto producido por GHRH sobre la migracin
celular.
AG-825 AG-1478
Control GHRH AG-825 AG-1478 + +
GHRH GHRH
0h
24 h
Figura 61. Efecto de los inhibidores EGFR y HER2 fosforilados sobre la

migracin celular producida por GHRH en clulas PC3. Las clulas se pre-tratan
durante 30 min con 0,1 M de los inhibidores de EGFR, AG-1478 (10 M), y de HER2,
AG-825 (10 M), y luego se tratan con 0,1 M de GHRH durante 24 h. El estudio se
realiza mediante ensayos de migracin celular. Las fotografas se toman en un
microscopio invertido (20X).
- 151 -
4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidrmico, EGF, sobre la

expresin de GHRH y sus receptores.
Existen trabajos que hablan de transactivaciones cruzadas entre

receptores de la familia HER y GPCRs. Por ello, se estudia el efecto de EGF
sobre la expresin de GHRH y sus receptores. Las clulas se tratan con EGF
(100 ng/ml) a diferentes tiempos y, a continuacin, se valoran los niveles de
GHRH y sus receptores mediante ensayos de RT-PCR. En la figura 62 se
observa como tras el tratamiento con EGF, los niveles de mRNA de GHRH se
incrementan segn transcurre el tiempo de tratamiento, alcanzando un aumento
del 45% a las 8 h. En el caso del mRNA de los receptores de GHRH tambin se
observa un incremento, con un valor mximo a las 2 h un 35% mayor,
comparando con los valores de clulas sin tratar. Estos resultados podran
indicar una transactivacin de GHRH mediada por EGFR.
GHRH GHRH-R
-Actina -Actina
Figura 62. Efecto EGF (100 ng/ml) sobre el mRNA de GHRH y GHRHR a
diferentes tiempos en de PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR. Los
resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a
la media E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 152 -
4.4 ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS ANTAGONISTAS DE GHRH

EN UN MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO DE CNCER DE
PRSTATA HUMANO.
Los ensayos en modelos in vivo permiten hacer una aproximacin a un

posible papel teraputico en humanos (ensayo preclnico), valorando los posibles
efectos adversos del tratamiento, y corroborando los resultados obtenidos en los
ensayos in vitro. Por ello, en este apartado de resultados se miden los efectos de
los antagonistas de GHRH en tejido tumoral prosttico obtenido tras la
inoculacin de PC3 en ratones inmunodeprimidos.
4.4.1 EFECTO DE JMR-132 Y JV-1-38 EN EL CRECIMIENTO DE

TUMORES IN VIVO .
En este primer experimento in vivo se prueba el efecto antitumoral de los

antagonistas JMR-132 y JV-1-38, en comparacin con el grupo control que solo
recibe la solucin vehculo.
4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad.
El crecimiento tumoral se mide dos veces a la semana, durante 41 das y

los resultados se representan en la figura 63. En las medidas finales del
volumen tumoral se observa que el antagonista JMR-132 (319,3 115 mm3)
inhibe el volumen tumoral un 58% (Figura 63A), y JV-1-38 (224,3 88 mm3)
un 70% (Figura 63B), comparndolo con el volumen tumoral de los ratones sin
tratar (750,2 74,56 mm3). Adems, es importante destacar que dos de los
tumores tratados con JMR-132 y uno con JV-1-38, reducen totalmente su
volumen tumoral.
- 153 -
A)
B)
Figura 63. Evolucin del crecimiento tumoral de los ratones tras el tratamiento
con 10 g/da de JMR-132 (A) y 20 g/da de JV-1-38 (B). Los resultados se
expresan en volumen calculado con la frmula: largo x alto x ancho x 0.5236. Los datos
corresponden a la media E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al
grupo control.
Se valoran otros parmetros como el peso del tumor de cada grupo

(Tabla 6), y se observa que los tumores de los grupos tratados con JMR-132 y
JV-1-38 pesan un 68% y 64% menos respectivamente, que el grupo control. El
peso de los ratones tras los tratamientos no sufre ninguna variacin con
- 154 -
respecto al grupo sin tratar (datos no mostrados). La relacin entre el peso del
tumor y el peso del ratn disminuye en los grupos tratados, lo que confirma que
los antagonistas reducen el peso del tumor independientemente del peso del
ratn. Adems, en cuanto al tiempo que tarda la masa tumoral en duplicarse, los
grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38 presentan un incremento de dicho
valor de un 46% y 20%, respectivamente.
Tabla 6. Efecto del tratamiento con los antagonistas JMR-132 (10 g/da) y de JV-
1-38 (20 g/da) sobre el peso del tumor, su relacin con el peso del ratn y el
tiempo de duplicacin del tumor para cada grupo. Los datos corresponden a la media
E.S.M.; *, p<0,05, respecto al grupo control.
Tiempo de Duplicacin del

Grupo de Peso del tumor, mg Peso del tumor (mg) / Peso del ratn (g )
Tumor (TDT)
ratones (% reduccin) (% reduccin)
(% incremento)
Control (n=10) 756 101 24.59 3.26 11,45 6,169
JMR-132 (n=6) 235 140 (68)* 10.15 4.08 (58)* 16,76 0,7 (46)*
JV-1-38 (n=6) 270 102 (64)* 8.40 3.08 (66)* 13,65 1,58 (20)
4.4.1.2 Expresin de GHRH y sus receptores.
El examen histolgico de los tumores mediante tincin con tricrmico

de Masson (Figura 64AA-C), indica que la masa tumoral est rodeada de tejido
conjuntivo. En su interior hay mezcla de clulas tumorales grandes de contorno
poligonal con clulas de un tamao menor y zonas con infiltrados de linfocitos
cercanas a los vasos sanguneos. En las secciones histolgicas de los tumores del
grupo control se observa una disposicin ms compacta entre las clulas que en
los grupos tratados con los antagonistas.
El estudio de la expresin de GHRH y sus receptores se realiza

mediante inmunohistoqumica con anticuerpos especficos para cada uno de
- 155 -
ellos. Las imgenes de la figura 64AD-F muestran como GHRH tiene una menor
presencia en los grupos tratados con los antagonistas, lo cual se confirma con
los resultados obtenidos de los niveles proteicos y de mRNA de GHRH (Figura
64B y C). Adems, las secciones de los tumores tratados con los antagonistas
presentaron una mayor expresin de ambos receptores de GHRH, presente
sobre todo en clulas endoteliales (Figura 64A G-L).
A) Control JMR-132 JV-1-38

A B C
Tricrmico
de Masson
GHRH
SVs
p-GHRHR
- 156 -
B) C)
GHRH GHRH
-Actina
-Actina
100
Niveles de protena
100
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
75 **
*** 75
50 *
50
**
25 25
0 0
Control JMR-132 JV-1-38 Control JMR-132 JV-1-38
Figura 64. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 g/da) y de JV-1-
38 (20 g/da) sobre la expresin de GHRH y de sus receptores. (A) Tincin con
tricrmico de Masson (A-C) e inmunohistoqumica de GHRH (D-F) y sus receptores (G-L).
(B) Niveles de mRNA medidos por RT-PCR y (C) de protena por Western blotting
de GHRH. Las imgenes son representativas de cada grupo y presentan un aumento
300X. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones en el grupo control y 6
ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001,
respecto al grupo control.
4.4.1.3 Proliferacin celular.
Tras estudiar la evolucin del crecimiento tumoral, se analiza el efecto de

los antagonistas sobre la expresin de protenas implicadas en vas de
proliferacin celular como PCNA, STAT3 y la quinasa, p44/42. PCNA se
analiza mediante inmunohistoqumica, representada en la figura 65A, donde se
observa una reduccin en el nmero de clulas positivas de un 58% y un 48% en
los grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente (Figura 65 A).
Adems, en la figura 65B, se muestra como en los grupos tratados con los
antagonistas la relacin pSTAT/STAT se reduce en un 36%, y 19% para el
grupo tratado con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente. Adicionalmente se
puede observar como el ratio entre p-p44/42 y p44/42 (Figura 65C) disminuye
- 157 -
un 30% y 39%, para los grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38,

respectivamente.
A)
Control JMR-132 JV-1-38
PCNA
B) C)
STAT p44/42
p-STAT p-p44/42
-Actina -Actina
Ratio p-p44/42 / p44/42
Ratio pSTAT3/STAT3
100
100
*
**
*
**
50 50
0 0
38 (20 g/da) sobre la expresin de PCNA (A), as como la expresin y
fosforilacin de STAT3 (B) y p44/42 (C) con la representacin del ratio
correspondiente. Se evala por tcnicas de inmunohistoqumica (A) y Western blot
(B y C). Las imgenes presentan un aumento 300X. Los resultados de la figura son
representativos de 10 ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos
tratados.
4.4.1.4 Ciclo celular y apoptosis
- 158 -
Una vez conocido el hecho de que los antagonistas reducen el

crecimiento tumoral y la presencia de algunas protenas importantes en dicho
proceso, se evala si se ve alterada la expresin de protenas de ciclo celular
como p53, y de apoptosis como Bcl2 y Bax. En la figura 66A se observa
como en los grupos tratados con los antagonistas aumenta de forma
significativa la expresin de p53, un 47% para el grupo del JMR-132 y un
31% para el grupo del JV-1-38. Los resultados de la figura 66B indican como,
la protena pro-apopttica, Bax, aumenta y la protena anti-apopttica Bcl2
disminuye en los tumores tratados con los antagonistas. Adems, el ratio de
ambas protenas se incrementa en un 57% y 45% para los grupos JMR-132 y
JV-1-38, respectivamente.
A) B)
Bax
p53
Bcl2
-Actina
-Actina
** ***
Niveles de protena
150 1,5 ***

Ratio Bax/Bcl2
*
(% vs. Control)
100 1,0
50 0,5
0 0
38 (20 g/da) sobre la expresin de p53(A), Bax y Bcl2 (B). Se analiza mediante
ensayos de Western blot. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones en
el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01;
***, p<0,001, respecto al grupo control.
4.4.1.5 Adhesin celular
- 159 -
A continuacin, se evalan diferentes molculas participantes en la

adhesin celular. Al igual que en clulas, se estudia como varan los niveles de
E-cadherina, -catenina y sus genes diana, CD44, ciclina D1 y c-myc . Los
resultados de la figura 67B muestran como los niveles de la protena E-
cadherina disminuyen en los grupos tratados con JMR-132 (38%) y JV-1-38
(15%). Los estudios de inmunohistoqumica revelan la presencia de E-cadherina
en la membrana plasmtica (Figura 67A) correlacionandose con los resultados
obtenidos por Western blotting. Tambin se evala la localizacin subcelular
(ncleo o membrana) de -catenina, observando que en los grupos tratados con
JMR-132 y JV-1-38 dicha protena disminuye un 54% y un 18%,
respectivamente, en el ncleo. En relacin a este resultado, se observa que los
niveles de mRNA de sus genes diana, CD44, ciclina D1 y c-myc disminuyen en
los grupos tratados con JMR-132 (16-35%) y JV-1-38 (27-70%).
Adems, se analiza la protena de adhesin a la matriz extracelular, IG-

H3, implicada en la proliferacin y diferenciacin celular. Para su estudio se
realizan ensayos de ELISA, los resultados que se recogen en la figura 67C
muestran que los grupos tratados con los antagonistas presentan un 66% menos
de IG-H3.
- 160 -
E-Cadherina
B)
1 0,01 0,65 0,01 * 0,12 0,005*** 1 0,005 0,84 0,02 * 0,73 0,06**
E-Cadherina CD44
1 0,005 1,37 0,01 * 1,75 0,02*** 1 0,06 0,86 0,08 0,3 0,03**
M ciclina D1
-Catenina
1 0,007 0,46 0,008** 0,82 0,006* 1 0,07 0,65 0,03 * 0,48 0,1**
N c-myc
-Actina -Actina
C)
100
(% vs. Control)
IG-H3
50 ***
***
0
38 (20 g/da) sobre la localizacin de E-cadherina (A), expresin de E-cadherina,
-catenina, CD44 , ciclina D1 y c-myc (B), y IG-H3 (C). Se analiza por ensayos de
inmunohistoqumica (A), de Western blotting (B) y ELISA (C). Las imgenes
presentan un aumento 300X. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones
en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001, respecto al grupo control.
- 161 -
4.4.1.6 Degradacin de la matriz extracelular
Otro proceso que se analiza es la degradacin de la matriz extracelular

mediante el estudio de expresin y actividad de las metaloproteasas 9 y 2, as
como los niveles de sus inhibidores endgenos TIMP1, 2 y 3. En la figura 68A
se muestra que la expresin de la MMP9 se reduce en un 50% en ambos grupos
de antagonistas, y los niveles de MMP2 se reducen un 50% y 90% en los grupos
tratados con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente. Estos resultados se
corroboran con los obtenidos por inmunohistoqumica, donde un menor nmero
de clulas expresan ambas MMPs (Figura 68C). En cuanto a su actividad
gelatinoltica (Figura 68B), la forma activa de ambas MMPs se reduce en torno
al 50%, comparando con el grupo control.
A) B)
MMP9 MMP2 Pro-MMP9 Pro-MMP2
-Actina -Actina MMP9 MMP2
125 300
***
100 Pro-MMP
Nivel de protena
(% vs. Control)
(% vs. Control)
MMP activa
200
75
** **
*
***
50
100 ***
*** *** ***
25
***
0 0
MMP9 MMP2 MMP9 MMP2
C) Control JMR-132 JV-1-38
MMP9
MMP2
- 162 -
Figura 68. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 mg/da) y de JV-1-
38 (20 mg/da) sobre la expresin (A y C) y actividad (B) de las MMP2 y 9. Se
analiza por ensayos de Western blot (A), de zimografa (B) e inmunohistoqumica (C).
Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones en el grupo control y 6
ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001,
respecto al grupo control.
A continuacin, se valoran los niveles de los inhibidores de las

metaloproteasas, TIMP1, 2 y 3, y RECK (Figura 69). Los resultados muestran
un incremento de inhibidores TIMP1 y 3, y RECK en los tumores tratados con
los antagonistas, mientras que los niveles de TIMP2 no varan.
1 0,05 1,35 0,03 *** 1,25 0,02***

TIMP1
1 0,01 1,05 0,02 1,05 0,03

TIMP2
1 0,005 1,25 0,07 ** 1,23 0,05**

TIMP3
1 0,02 1,31 0,1 *** 1,14 0,02

RECK
-Actina
Figura 69. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 mg/da) y de JV-1-
38 (20 mg/da) sobre la expresin de mRNA de TIMP1, 2 y 3, y RECK. Se analiza
por ensayos de RT-PCR. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones en
el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01;
***, p<0,001, respecto al grupo control.
- 163 -
4.4.1.7 Angiognesis.
El nivel de vascularizacin de los tumores se observa mediante

fotografas de la masa tumoral antes de ser extrada. Las imgenes de la figura
70A muestran como el tratamiento con los antagonistas visualmente indica una
menor cantidad de vasos sanguneos. El grado de hipoxia producida en el tumor
se estudia por los niveles del factor HIF-1 mediante inmunohistoqumica
(Figura 70B), observndose un menor nmero de clulas positivas en los grupos
tratados con los antagonistas. Para completar el estudio sobre angiognesis, se
analizan los niveles del factor proangiognico VEGF165 en los tumores (Figura
70C), encontrando una disminucin de un 50% en los grupos tratados con los
antagonistas.
B) Control JMR-132 JV-1-38
HIF-1
- 164 -
C)
VEGF 165 (pg/ml)

200
** **
100
0
Figura 70. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 g/da) y de JV-
1-38 (20 g/da) sobre la angiognesis. Se analizan fotografas representativas de
cada grupo de tumores (A), adems se realizan ensayos de inmunohistoqumica de
HIF-1 (B), y de ELISA de VEGF165 (C). Las imgenes (B) presentan un aumento
300X. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10 ratones en el grupo control
y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; **, p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.1.8 Metstasis
La capacidad metastsica de las clulas tumorales provoca la elevada

mortalidad en la enfermedad cancergena. Este proceso hace que las clulas se
separen de su lugar de origen dirigindose hacia un rgano sano, comenzando
all su proceso proliferativo. En este apartado, se realiza un estudio preliminar
del potencial antimetastsico de los antagonistas de GHRH mediante el estudio
de radiografas de todos los ratones. La presencia de focos metastsicos se
determina en el Servicio de Traumatologa del Hospital Universitario Principe
de Asturias. Posteriormente, se establece un estadiaje atendiendo al nmero y
localizacin de dichas lesiones metastsicas. En la figura 71A se observan las
imagenes representativas de los diferentes estadios utilizados para clasificar el
grado de metstasis:
- 165 -
Estadio 0: Sin cambios

Estadio 1: Pequeos focos metastsicos
Estadio 2: Focos metastsicos en hueso o pulmn
Estadio 3: Focos metastsicos en hueso y pulmn
Teniendo en cuenta estos estadios se clasifican los tumores de los tres

grupos, los resultados obtenidos se representan en la figura 71B, donde se
observa que los grupos tratados presentan hasta un 75% menos de meststasis
que el grupo control. En el estudio histolgico (Figura 71C) de la columna de
uno de los animales del grupo control, se observa la presencia de clulas
tumorales en la mdula sea.
A) ESTADIO 0 ESTADIO 1 ESTADIO 2 ESTADIO 3
- 166 -
B) C)
3
Estadio metastsico
**
1 **
0
Figura 71. Imgenes representativas de las metstasis generadas en los ratones.

Se analizan radiografas de los ratones de cada grupo y se clasifican segn su estadio
y se sealan con flechas blancas los focos metastsicos en pulmn y/o estructura sea
(A). La grfica (B) representa el anlisis de los estadios de cada grupo de ratones. Se
realiza un estudio histolgico (C) de la columna vertebral de un animal del grupo
control, donde se observa la presencia de clulas tumorales en la medula sea
sealadas con flechas negras. Los datos corresponden a la media E.S.M. de 10
ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; **,
p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.1.9 Expresin de EGFR, HER2 y Src.
Tal como vimos en la experimentacin realizada in vitro, GHRH

transactiva EGFR y HER2 provocando la activacin de procesos tumorales. Por
ello, evaluamos la expresin de EGFR y HER2, as como la protena quinasa,
Src. En la figura 72A se observa que los grupos tratados con los antagonistas
muestran un menor nmero de clulas positivas para p-EGFR, siendo incluso
nula para algunos tumores del grupo JMR-132. Sin embargo, los tumores de los
grupos tratados muestran un mayor nmero de clulas positivas a p-HER2,
estando dicho receptor presente bajo la membrana de las clulas tumorales
examinadas.
- 167 -
Adems en la figura 72B se analizan los niveles de EGFR y HER2

mediante Western blot y RT-PCR. Los resultados revelan una menor
expresin de los RTKs en los tumores de los grupos JMR-132 y JV-1-38, al
compararlo con el valor del grupo control. Los niveles de Src (Figura 72C)
analizados por ensayos de Western blot disminuyen un 28% en el grupo JMR-
132, y un 44% en el grupo JV-1-38.

a b c
p-EGFR
d e f
p-HER2
B) mRNA Protena
1 0,06 0,69 0,1 * 0,62 0,005* 11 0,08
0,08 0,71 0,06 **
0,71 0,06 0,66 0,07*
0,66 0,07*
EGFR
1 0,05 0,73 0,05 * 0,78 0,07* 1 0,06 0,78 0,06 * 0,70 0,07*
HER2
-actina
C)
p-Src
-actina
Niveles de protena
100
(% vs. Control)
*
50
0
- 168 -
38 (20 g/da) sobre la expresin de EGFR, HER2 y Src. Se analiza mediante
inmunohistoqumica las formas fosforiladas de EGFR y HER2 (A), asi como la expresin
de mRNA y protena de EGFR, HER2 (B) y pSrc (C) mediante RT-PCR y Western
blotting. Las imgenes presentan un aumento de 300X. Los resultados son
representativos de 10 ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos
tratados
4.4.1.10 Expresin de diferentes isoformas de PKCs
La PKC es una familia de protenas kinasas que estn implicadas en

multiples procesos que llevan a la progresin tumoral. Por ello, se valora la
expresin de algunas de sus isoformas ms representativas en los tumores
obtenidos. Los resultados de la figura 73 muestran como el antagonista JV-1-38
reduce de forma significativa los niveles de las isoformas , I y II. Sin
embargo, el antagonista JMR-132 solo reduce de forma significativa la isoforma
II. En cambio, los niveles de las isoformas y , aumentan en los grupos
tratados con cada uno de los antagonistas. Estos resultados avalan la
implicacin de PKC en los efectos de los antagonistas JMR-132 y JV-1-38, y
ponen de manifiesto un papel diferencial para cada una de las isoformas.
- 169 -

1 0,01 0,81 0,04 0,5 0,04**
PKC-
1 0,08 0,44 0,11** 0,34 0,07**

PKC-I
1 0,06 0,77 0,06* 0,60 0,03*
PKC-II
1 0,055 2,14 0,14** 1,38 0,16
PKC-
1 0,07 1,86 0,13* 3,06 0,3**

PKC-
-Actina
38 (20 g/da) sobre la expresin de las isoformas , I, II, y . Se analiza por
ensayos de Western blot. Los resultados de la figura son representativos de 10 ratones
en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados con los antagonistas
de GHRH.
4.5 EFECTO DE MIA-690 Y GEFITINIB EN EL CRECIMIENTO

DE TUMORES IN VIVO .
En los resultados anteriormente analizados, se observa como GHRH

provoca la transactivacin de EGFR y HER2 y con ello multitud de procesos
pro-cancergenos, y adems, todo ello es bloqueado con los antagonistas de
GHRH. En este segundo experimento in vivo se estudia el efecto del
antagonista MIA-690, ya que es el ms efectivo segn nuestros resultados, por
si solo y en combinacin con un inhibidor de EGFR utilizado en clnica,
Gefitinib.
- 170 -
4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad.
El crecimiento tumoral se mide dos veces a la semana, durante 36 das y

los resultados se representan en la figura 74. En las medidas finales del volumen
tumoral se observa que el antagonista MIA-690 (493 180 mm3) inhibe el
volumen tumoral un 70%, Gefitinib (591 174 mm3) un 63 %, y ambos
tratamientos (410 65 mm3) un 75%, comparndolo con el volumen tumoral de
los ratones sin tratar (1578 190 mm3).
1500
Volumen tumor (mm3)
CONTROL
MIA-690
1000 Gefitinib
MIA-690 + Gefitinib
***
***
500 ** *** *** ***
0
01 5 8 12 15 19 22 26 29 33 36
Tratamiento (Das)
Figura 74. Evolucin del crecimiento tumoral de los ratones tras el tratamiento
con 5 g/da de MIA-690, 100 mg/kg x da de Gefitinib y ambos en combinacin.
Los resultados se expresan en volumen calculado con la frmula: largo x alto x ancho x
0,5236. Los datos corresponden a la media E.S.M.; ** p<0,01; ***, p<0,001, respecto
al control.
En la tabla 7 se relacionan otros parmetros, como los pesos tumorales,

la relacin del peso del tumor y peso del ratn, y el tiempo de duplicacin del
tumor. Se observa que los pesos de tumores de los ratones tratados con MIA-
690 y Gefitinib son un 42% y 50% menores respectivamente, y el grupo tratado
- 171 -
con la combinacin de ambos compuesto lo reduce an ms, un 58%, al

compararlos con el grupo control. Por otro lado, la relacin entre el peso del
tumor y el peso del ratn disminuye en todos los grupos tratados, lo que apoya
la reduccin del tumor vista en los grupos tratados. Cabe mencionar que los
pesos de los ratones tratados no sufrieron variacin con respecto al grupo
control. En cuanto al tiempo que tarda la masa tumoral en duplicarse, los
grupos tratados con MIA-690 y Gefitinib presentan un incremento en el tiempo
de un 48% y 51%, respectivamente, y la combinacin de ambos tratamientos lo
aumenta ms an, llegando a un 63%.
Tabla 7: Efecto del tratamiento con 5 g/da de MIA-690, 100 mg/kg x da de

Gefitinib y ambos en combinacin sobre el peso del tumor, su relacin con el peso
del ratn y el tiempo de duplicacin del tumor para cada grupo. Los datos
corresponden a la media E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01, respecto al grupo control.
Peso del tumor, mg Peso del tumor (mg) / Peso del Tiempo de Duplicacin del Tumor
Grupo de ratones
(% reduccin) ratn (g ) (% reduccin) (TDT) (% incremento)
Control
1630 160 52,5 9,65 9,13 1
(n=15)
MIA-690
960 61 (42)** 36,9 8.11 (30)* 13,6 0,8 (48)*
(n=9)
Gefitinib
830 80 (50)** 28,0 5.21 (47)* 13,8 2,05 (51)*
(n=9)
MIA-690 + Gefitinib 14,9 1,5 (63)*
690 150(58)** 30,1 7.18 (43)*
(n=9)
4.4.2.2 Angiognesis
El nivel de vascularizacin de los tumores se observa mediante

fotografas de la masa tumoral despus de ser extrada. Las imgenes de la
figura 75A muestran como los tratamientos reducen la presencia de vasos
sanguneos en el tumor. Adems se analizan los niveles de VEGF165 en los
tumores (Figura 75B), encontrando una disminucin de un 35% en los grupos
- 172 -
tratados con MIA-690 y Gefitinib, y un 48% en el grupo tratado con la

combinacin de ambos compuestos.
A) MIA-690
Control MIA-690 Gefitinib +
Gefitinib
B)
3000
VEGF165 (pg/ml)
* *
2000
**
1000
0
Control - - - -
MIA-690 - + - +
Gefitinib - - + +
Figura 75. Efecto del antagonista MIA-690 (5 g/da), Gefitinib (100 mg/kg x
da) y ambos en combinacin sobre la angiognesis. Se presentan fotografas
representativas de cada grupo de tumores (A), y ELISA de VEGF165 (B). Los datos
corresponden a la media E.S.M. de 15 ratones en el grupo control y 9 ratones en cada
uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.2.3 Metstasis
Las clulas de los tumores tienen una elevada actividad metablica, en

concreto, se ha visto que presentan una glucolisis muy activa. En este apartado
de resultados se utiliza la 2-desoxi-D-glucosa unida a una sonda fluorescente
- 173 -
para valorar la actividad de las clulas tumorales, tanto en la masa tumoral

como en otras zonas del animal. La intensidad del color indica el nivel de la
actividad glucoltica de las clulas del animal, en ayunas. Como se observa en la
figura 76 el control presenta mayor actividad glucoltica repartida en diversos
focos, algunos alejados de la masa tumoral, lo que nos podra indicar supuestos
focos metastsicos. Por el contrario, los ratones de los grupos tratados
presentaron una baja intensidad de glucolisis.
MIA-690
Negativo Control MIA-690 Gefitinib +
Gefitinib
- Glucolisis +
Figura 76. Efecto del antagonista MIA-690 (5 g/da), de Gefitinib (100

mg/kg x da) y ambos en combinacin sobre la generacin de metstasis. Se
inyecta a cada ratn una sonda fluorescente de 2-desoxi-D-glucosa y se escanean los
ratones para valorar la fluorescencia emitida a 790 nm. Las imgenes son
representativas de cada grupo de ratones.
4.4.3 EFECTO DE GHRH SOBRE LA INDUCCIN DE TUMORES.
Los resultados obtenidos en anteriores apartados sobre el efecto de

GHRH en diversos procesos como proliferacin, adhesin y migracin en la
- 174 -
lnea celular no tumoral prosttica, sugieren que el neuropptido puede tener la

capacidad de transformar las clulas no tumorales en clulas malignas. Por ello,
se estudia si despus de tratar las clulas RWPE-1 con GHRH durante 24 h, e
inocularlas en ratones atmicos se inducen tumores. Se realiza un seguimiento
semanal del volumen de los ratones y tras un periodo de 11 semanas se finaliza
el experimento. Los resultados recogidos muestran que de los ocho ratones
inoculados con clulas tratadas, siete de ellos generan una masa tumoral cuya
evolucin se muestra en la figura 77. Sin embargo, ninguno de los ratones del
grupo control muestra la formacin de tumores. Adems, ninguno de los
ratones del experimento sufri variaciones importantes en su peso.
A) B) Control GHRH
Volumen tumoral (mm3)
100 *** Control

GHRH
***
* ** ** **
50
0
1 7 14 21 28 35 42 49
Tratamiento (Das)
C)
Figura 77. Evolucin del crecimiento tumoral en ratones atimicos de clulas

RWPE-1 tratadas con 0,1 M de GHRH (A), fotografas de un ratn
representativo del grupo control (izquierda) y del grupo tratado (derecha) (B), y
fotografas de los 6 tumores generados (C). Los resultados (A) se expresan en
volumen calculado con la frmula: largo x alto x ancho x 0.5236. Los datos
corresponden a la media E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al
grupo control.
- 175 -
5. DISCUSIN
Universidad de Alcal Discusin
La evolucin del CP hacia un cncer insensible a andrgenos, tambin

denominado, resistente a castracin (CPRC), depende de un entramado sistema
de sealizacin en el que participan multitud de molculas cuya expresin
diferencial desencadena fenotipos que llevan a las clulas prostticas a proliferar,
evadir la apoptosis, aumentar su capacidad migratoria e invasiva, estimular la
angiognesis, etc. En definitiva, a extender la enfermedad y hacerla incurable.
Solamente en la Unin Europea se estiman 71.000 muertes por cncer de
prstata para el ao 2014 (Malvezzi y col., 2014). Actualmente, si se detecta el
CP de forma precoz existen tratamientos muy eficaces; el problema surge
cuando la enfermedad progresa hacia una situacin de independencia
andrognica, ya que las opciones teraputicas son limitadas y se necesitan
tratamientos ms eficaces, lo que hace imprescindible estudiar en profundidad
cada uno de los procesos responsables de su mal pronstico. En este sentido,
nuestro grupo de investigacin tiene una trayectoria dilatada en el estudio del
papel del neuropptido VIP en la progresin tumoral del cncer de prstata
(Collado y col., 2007; Fernndez-Martnez y col., 2009). El pptido GHRH
pertenece a la familia del VIP y se ha relacionado con diversos tumores: mama,
endometrio, ovario, prstata, coln, rin, pulmn y glia (Barabutis y Schally,
2010). En este trabajo de investigacin se ha tratado de profundizar en el papel
de GHRH sobre los diferentes procesos que llevan a la progresin del CP,
adems de evaluar el posible papel de sus antagonistas como frmacos con
potencial teraputico.
En el transcurso de esta Tesis Doctoral se ha confirmado la implicacin

directa de GHRH y de sus receptores, en el desarrollo de fenotipos que
promueven la progresin tumoral en el CP. Para ello, se han usado dos
estrategias experimentales, estudios in vitro y estudios in vivo . En los estudios
in vitro, se han utilizado tres lneas celulares de epitelio prosttico humano
representativas de un estado no tumoral, RWPE-1; de un estadio intermedio
dependiente de andrgenos, LNCaP; y de un estadio avanzado independiente de
- 179 -
Discusin Universidad de Alcal
andrgenos, PC3. Los estudios in vivo, se han llevado a cabo con ratones
inmunodeprimidos, xenotransplantados con clulas prostticas. En concreto, se
ha demostrado la participacin de GHRH en los procesos de proliferacin,
adhesin, migracin, angiognesis y neurodiferenciacin, y en la expresin de
molculas biomarcadoras de cada uno de ellos. Adems, se ha puesto de
manifiesto la existencia de un mecanismo de transactivacin entre los receptores
de GHRH y de EGF, y se han desvelado algunas de las vas implicadas en dicha
interaccin. El trabajo se completa de forma paralela con un estudio sobre la
accin de los antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38, y los MIA-602, 606
y 690, estos ltimos pertenecen a una nueva serie de antagonistas con efectos
ms potentes que los anteriores sobre la progresin tumoral.
El primer objetivo planteado en este trabajo pretende valorar la presencia

endgena de GHRH en las tres lneas celulares prostticas, RWPE-1, LNCaP y
PC3, como paso previo para su implicacin en el CP. GHRH est presente en
los tres tipos celulares, observndose una mayor expresin en las lneas
celulares tumorales, y dentro de ellas en las ms agresivas, sealando su
importancia en el avance del CP ya que sus niveles aumentan segn la
enfermedad se vuelve ms agresiva. A continuacin, se valora si este incremento
se refleja en la expresin y localizacin subcelular de las diferentes variantes de
los receptores de GHRH. En los resultados se muestra que el receptor pGHRH
y sus variantes, SVs, se localizan en los tres tipos celulares presentando un
patrn diferente en cada una de ellas. As, pGHRH-R se encuentra ms
expresado en clulas LNCaP; mientras que las variantes SVs se expresan
mayoritariamente en las clulas PC3. Ambos receptores se encuentran
localizados principalmente en membrana plasmtica y citoplasma. La presencia
de estos receptores en tejido y clulas de CP, dependiente e independiente de
andrgenos, ha sido previamente descrita por el grupo del Dr. Schally (Halmos
y col., 2002), y en tejido prosttico no tumoral por diferentes grupos (Gallego y
col., 2005; Havt y col., 2005), pero todava no se ha descrito en lneas celulares
- 180 -
de prstata no tumoral. Para las isoformas SVs han sido descritos niveles
mayores en tejido tumoral prosttico de pacientes en estado avanzado (etapa III
y IV), en comparacin con el tejido de tumores que presentan un estadio menos
agresivo (Halmos y col., 2002), por lo tanto, nuestros resultados apuntan en la
misma direccin y sugieren que las isoformas SVs pueden tener un papel
predominante en la independencia andrognica del CP. En cambio, la mayor
presencia de GHRH en los tumores prostticos, con independencia de su estadio
tumoral (Halmos y col., 2002), indica la importancia de GHRH y sus receptores
en el desarrollo de la enfermedad, sealndolos como una posible diana
teraputica.
Los estudios in vivo con ratones xenotransplantados con clulas PC3

muestran que los antagonistas JV-1-38 y JMR-132 regulan de forma negativa
la expresin de GHRH en los tumores de los grupos tratados con dichos
antagonistas, si los comparamos con los tumores del grupo no tratado. As
mismo, en ensayos in vitro, el tratamiento con dichos antagonistas resulta en un
incremento del mRNA de los receptores de GHRH. Por tanto, los antagonistas
activan la transcripcin de GHRH-R con el objetivo de incrementar los sitios de
unin para los mismos, y por tanto, sus posibles efectos. Este hecho no haba
sido descrito hasta la fecha y puede explicar parte del efecto directo de los
antagonistas de GHRH sobre los diferentes procesos (proliferacin, ciclo
celular, adhesin, migracin y angiognesis) que llevan al fenotipo metastsico.
Nuestro segundo objetivo ha consistido en analizar la implicacin de

GHRH y sus antagonistas en los diferentes procesos que median el inicio y
progresin del CP. Para ello, en primer lugar se busca la concentracin ptima
de GHRH y de los antagonistas para los estudios in vitro.
En una primera aproximacin, evaluamos el efecto que produce GHRH

en la viabilidad de las clulas prostticas. Los resultados obtenidos confirman
que GHRH incrementa significativamente la viabilidad de las tres lneas
- 181 -
celulares, provocando una mayor respuesta en la lnea celular de CP avanzado.

Resultados similares se han obtenido en clulas de cncer de pulmn (Kiaris y
col., 1999) y de mama (Siriwardana y col., 2006). A su vez, los cinco
antagonistas empleados en este estudio reducen la viabilidad en las tres lneas
celulares, siendo los antagonistas de la serie MIA los que producen el mayor
efecto. En este sentido, el grupo del Dr. Schally ha descrito la reduccin de la
viabilidad en clulas tumorales PC3 con el antagonista JMR-132 (Rick y col.,
2012a), as como, en otros tipos celulares por diversos antagonistas de GHRH
(Bellyei y col., 2010; Guo y col., 2010; Pozsgai y col., 2011), lo que se atribuye a
la presencia de GHRH endgena existente en las lneas celulares, descrita en los
resultados del primer objetivo, y cuya accin es bloqueada por los antagonistas.
El aumento de actividad metablica que produce GHRH y que se bloquea

con los antagonistas puede deberse a cambios mitognicos, por ello se realizaron
ensayos de proliferacin en las tres lneas celulares. Los resultados obtenidos
indican que GHRH incrementa la proliferacin celular, siendo especialmente
importante el aumento producido en clulas no tumorales, lo que podra deberse
a la mayor presencia de pGHRH-R en las clulas RWPE-1, como demostramos
previamente. Este sorprendente resultado, nos llev a analizar si GHRH
presenta capacidad transformante en las clulas no tumorales, mediante estudios
in vivo. Las clulas RWPE-1 son clulas no tumorignicas, pero tras una
estimulacin con GHRH, y posterior inoculacin en ratones atmicos, son
capaces de generar pequeos tumores. Trabajos previos de nuestro grupo
demostraron que el VIP, un pptido de la familia de GHRH, era capaz de
generar tumores en ratones atmicos tras la inoculacin de dichas clulas
previamente tratadas con el neuropptido (Fernndez-Martnez y col., 2010).
Estos datos sealan a GHRH como un agente capaz de transformar clulas
no tumorales en malignas, aportando ms informacin sobre los procesos
oncolgicos en los que se ve implicado.
- 182 -
Por otro lado, los antagonistas de GHRH reducen la proliferacin en

las lneas celulares tumorales, y no en las clulas no tumorales, con la
excepcin del antagonista MIA-602, que disminuye la proliferacin de todas
ellas. Estos efectos muestran una accin selectiva por parte de los antagonistas
por las clulas cancergenas, algo que puede explicarse, en parte, por la
reduccin de la actividad metablica previamente descrita. Sin embargo, en las
clulas no tumorales se reduce la actividad metablica pero no la proliferacin,
lo que puede deberse a que los antagonistas provoquen una parada de ciclo
celular, que aplaca la proliferacin en este tipo celular. Adems, tras un pulso
previo de GHRH en clulas de CP avanzado los antagonistas son capaces de
bloquear el efecto mitognico provocado por GHRH. En paralelo, los estudios in
vivo revelaron una importante reduccin del crecimiento tumoral en los grupos
tratados con los antagonistas, JV-1-38, JMR-132 y MIA-690, apoyando
firmemente su capacidad antitumoral. Resultados similares han sido descritos
por el grupo del Dr. Schally en el desarrollo de otros tipos de cncer (Buchholz
y col., 2007; Rick y col., 2012b).
Los cambios que GHRH y sus antagonistas producen sobre la

proliferacin celular pueden reflejarse en la modulacin de la expresin del
factor PCNA regulador de este complejo proceso. Tras el estmulo de las tres
lneas celulares con GHRH se incrementaban los niveles de PCNA, mostrando
una respuesta rpida y de mayor magnitud en las clulas ms agresivas, en
comparacin con lo observado en las otras dos lneas celulares, lo que puede
deberse al metabolismo ms activo de las clulas tumorales. La mayora de los
antagonistas de GHRH provocan una importante disminucin de la
expresin de PCNA solo en clulas PC3, reafirmando el bloqueo de GHRH
endgeno producido en la lnea celular de CP avanzado. En este sentido, en
2010, el grupo del Dr. Schally observ que el antagonista JMR-132 reduca la
expresin de PCNA en clulas de hiperplasia benigna de prstata (Siejka y col.,
2010b). En los estudios que hemos realizado in vivo, el anlisis tumoral de las
- 183 -
molculas implicadas en proliferacin incluye a STAT3 y p44/42,

biolgicamente activas tras su fosforilacin, adems de la estudiada in vitro,
PCNA. El tratamiento con los antagonistas JMR-132 y JV-1-38 reduce
considerablemente la expresin y activacin de los tres biomarcadores
examinados, y a su vez, puede provocar la reduccin de molculas
protoncognicas con las que estn relacionadas, como c-myc o ciclina D1, que
modulan el ciclo celular. La reduccin observada de PCNA es mayor que la
producida por los antagonistas en los ensayos in vitro, lo que puede provocar
una disminucin de la procesividad de la DNA polimerasa y/o que no pueda
iniciar la replicacin celular.
Como vimos en la introduccin, el ciclo celular fija la secuencia de pasos

para que las clulas proliferen. Los resultados recogidos tras analizar el efecto
de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular se correlacionan con las
conclusiones obtenidas de los ensayos de proliferacin en clulas de cncer de
prstata avanzado. GHRH incrementa el nmero de clulas en mitosis, y, por el
contrario, tras el tratamiento con los antagonistas de GHRH, aparecen clulas
apoptticas y adems se aprecia una parada de ciclo en la fase S, con lo que se
puede explicar la disminucin de la viabilidad y proliferacin celular que
provocan. En la misma direccin estn los hallazgos encontrados en clulas de
cncer de colon en presencia de JMR-132 (Rick y col., 2012b). Este antagonista
provoca un dao en el DNA, que activa la maquinaria de parada de ciclo y
entrada en apoptosis de las clulas, a travs de la activacin de p53, p21 y Bax,
as como, la represin de la protena antiapptotica Bcl2 (Hohla y col., 2009). En
este sentido, quisimos comprobar si en nuestra lnea celular se producan los
mismos efectos sobre estos biomarcadores. As, nuestros resultados indican que
los efectos de GHRH sobre el ciclo celular se podran deber a la disminucin de
p21, p53 y Bax sumado al incremento de Bcl2, lo que hace que el balance de
molculas proapoptticas/antiapoptticas se reduzca y pueda impedir el inicio
de un proceso apopttico. Los cambios en estos marcadores sealan a GHRH
- 184 -
como un factor antiapopttico y, precisamente, el cncer es el principal

escenario donde se reduce la apoptosis haciendo que las clulas tumorales no
mueran (Ouyang y col., 2012). En sentido opuesto, encontramos los efectos
producidos por los antagonistas de GHRH sobre los niveles de estas molculas
en los estudios in vitro e in vivo. En clulas de CP avanzado destacan los efectos
de MIA-690, nico antagonista capaz de modular los cuatro marcadores
analizados provocando el inicio de un proceso apopttico y de una parada del
ciclo celular. Los resultados de los estudios in vivo muestran un incremento de
p53, p21 y Bax, as como, la disminucin de la protena antiapopttica Bcl2, del
mismo modo que se ha descrito en cncer de pulmn con los antagonistas MZ-J-
7-114, MZ-J-7-118 y RC-3940-II (Kanashiro y col., 2007). Al igual que ocurre
con la proliferacin tumoral, se observan mayores efectos en los estudios in vivo
en comparacin con los estudios in vitro sobre los niveles de los marcadores de
ciclo celular y apoptosis, resaltando la importancia de los antagonistas de
GHRH en el tratamiento del CP in vivo.
En el tejido normal, las clulas epiteliales se encuentran unidas entre s y

a la matriz extracelular. Sin embargo, las clulas tumorales rompen estas
uniones para independizarse del resto de clulas y conseguir escapar del nicho
tumoral hacia otros lugares del organismo, dando lugar a la metstasis. Por
tanto, el primer paso para independizarse es la prdida de adhesin celular,
convirtindose en uno de los procesos clave para el estudio de la progresin
tumoral. En este sentido, nuestros resultados demuestran la implicacin de
GHRH en la reduccin de la adhesin de clulas tumorales de CP avanzado, sin
afectar significativamente a las clulas no tumorales ni a las tumorales
representativas de un estadio menos agresivo. En sentido opuesto, nuestros
resultados indican que los antagonistas de GHRH bloquean los niveles
endgenos de la hormona, y con ello, provocan un interesante aumento en la
adhesin de las tres lneas celulares. La unin de las clulas por E-cadherina
inhibe la motilidad celular y mantiene el fenotipo epitelial normal (Arya y col.,
- 185 -
2006), por lo que a la E-cadherina se la considera una protena anti-migratoria.

Adems, los cambios en los niveles de E-cadherina se han visto asociados a
procesos de EMT y MET en cncer metastsico (Onder y col., 2008). Estos
hechos indican la importancia de la reduccin de E-cadherina que provoca
GHRH solamente en clulas tumorales, como se observa en nuestros resultados,
lo que podra mostrar el inicio del proceso EMT. Adems, los antagonistas de
GHRH son capaces de revertir el efecto, incluso en las clulas no tumorales
(para el caso del MIA-690), impidiendo la reduccin de E-cadherina que se
produce en los primeros pasos del proceso metastsico, sealando a dichos
compuestos como inhibidores de los pasos iniciales en el desarrollo de la
metstasis. Resultados similares se han descrito tras el tratamiento con el
antagonista MIA-602 en clulas de cncer de mama (Bellyei y col., 2010). Por
otro lado, en nuestros ensayos in vivo, los antagonistas JMR-132 y JV-1-38
provocan un incremento en los niveles de E-cadherina en los tumores. En este
sentido, se sabe que la E-cadherina disminuye conforme avanza el proceso
metastsico (Onder y col., 2008), lo que podra indicar que los tumores de los
ratones tratados con los antagonistas quedan bloqueados en una fase
inicial de la metstasis, mientras que los tumores no tratados se encuentran en
un estadio ms avanzado.
La molcula -catenina sirve de puente entre E-cadherina y otras

cateninas, con el fin de estabilizar el citoesqueleto (Thakur y Mishra, 2013). En
clulas epiteliales, su asociacin con E-cadherina evita la liberacin de -
catenina al citoplasma y su posterior translocacin al ncleo, donde puede
activar la transcripcin de diferentes genes que favorecen la progresin tumoral
(Orsulic y col., 1999). Al igual que ocurre con E-cadherina, GHRH aumenta la
expresin de -catenina solo en clulas tumorales, con una respuesta mayor
en las clulas representativas de CP avanzado. Por el contrario, la exposicin de
las clulas tumorales a los antagonistas de GHRH reduce los niveles totales de
-catenina y la mayor respuesta se obtiene en clulas de CP avanzado. En
- 186 -
paralelo, se observa que GHRH incrementa la presencia de -catenina en el

ncleo y que los antagonistas, reducen sus niveles nucleares. Resultados
similares se han descrito en clulas de glioblastoma, cncer de mama y de ovario
en presencia del antagonista MIA-602 (Bellyei y col., 2010). La mayor presencia
nuclear de -catenina provocada por GHRH activara la transcripcin de los
genes diana, c-myc , CD44 y ciclina D1, al contrario que los efectos
producidos por los antagonistas de GHRH, segn observamos en nuestros
experimentos in vitro. En este sentido, los cambios producidos en c-myc por
GHRH y sus antagonistas tienen una relacin inversa con los producidos en
p21, este hecho puede explicarse sabiendo que c-Myc reprime la transcripcin
de p21 al unirse a una regin prxima a su promotor lo que puede tener
consecuencias en el control de la proliferacin y la progresin del ciclo celular,
del mismo modo que ocurre en clulas de cncer de colon (van de Wetering y
col., 2002). La importancia biolgica de la reduccin producida por los
antagonistas en los niveles de ciclina D1 y CD44 reside en la capacidad de estas
molculas de reducir la adhesin celular e incrementar la proliferacin tumoral
(Chang y col., 2013; Ripple y col., 2014). Los efectos in vitro producidos por los
antagonistas se reflejan de igual modo en los estudios in vivo realizados con
JMR-132 y JV-1-38, indicando de nuevo la relevancia de dichos compuestos en
la modulacin de molculas que provocan una parada de ciclo celular, asi como,
el inicio de un proceso apopttico en nuestros modelos experimentales de CP.
Cuando las clulas tumorales pierden su capacidad adherente son capaces

de migrar degradando a su paso la matriz extracelular que las rodea, invadiendo
el sistema vascular y colonizando otros tejidos. La degradacin de la matriz
extracelular es producida por enzimas proteolticas, principalmente, MMP9 y
MMP2, que se encuentran altamente expresadas en tejido tumoral prosttico en
estadio avanzado (Gong y col., 2014b). Nuestros resultados indican que GHRH
incrementa la capacidad migratoria de clulas no tumorales y tumorales en
estadio avanzado, y, por el contrario, los antagonistas de GHRH reducen la
- 187 -
motilidad en ambas lneas celulares. Esta reduccin de la capacidad migratoria

puede provocar un bloqueo de los posteriores pasos del proceso metastsico,
impidiendo la invasin de vasos sanguneos, as como, la colonizacin de otros
tejidos. Los cambios producidos por GHRH y sus antagonistas en la migracin
celular se ven reflejados, de igual modo, en la expresin de las MMPs
implicadas en dicho proceso, por lo tanto, GHRH incrementa los niveles de
mRNA y protena de las MMP2 y MMP9, y los antagonistas de GHRH
reducen dichos niveles. Resultados semejantes se han descrito al tratar con
MIA-602 clulas de cncer de mama, ovario y glioblastoma (Bellyei y col.,
2010). En la misma direccin, pero de una manera ms notable, encontramos los
resultados de nuestros estudios in vivo, donde, JMR-132 y JV-1-38 reducen los
niveles de ambas metaloproteasas en su forma inactiva y activa. Adems, los
antagonistas aumentan la expresin de sus inhibidores endgenos TIMP1,
TIMP3 y RECK, lo que puede reducir la actividad de las MMPs tal como se
observa en los resultados (Sun, 2010). Estos resultados demuestran que GHRH
altera la expresin de las molculas que controlan la degradacin de la matriz
extracelular, MMPs y sus inhibidores endgenos, y sus antagonistas por el
contrario lo restauran, pudiendo concluir que los antagonistas de GHRH
pueden inhibir la capacidad migratoria de las clulas de CP avanzado.
En los ltimos aos se estn llevando a cabo diversos estudios sobre la

importancia de la protena IG-h3 o TGFBI en la migracin de clulas
tumorales. Esta protena presente en la matriz extracelular es inducida
transcripcionalmente por TGF- y adems se ha descrito su sobreexpresin en
cncer de pulmn (Sasaki y col., 2002), rin (Yamanaka y col., 2008), piel
(Lauden y col., 2014) y prstata (Lee y col., 2013), por ello decidimos evaluar su
expresin en nuestro estudio in vivo. Los niveles de IG-h3 disminuyen en los
tumores de los grupos tratados con los antagonistas JMR-132 y JV-1-38,
avalando los resultados anteriores, reduciendo molculas implicadas en la
- 188 -
degradacin de la matriz extracelular, lo que seala de nuevo a los antagonistas

de GHRH como compuestos anti-metastsicos en el CP.
Las clulas tumorales precisan oxgeno y nutrientes para poder

proliferar, por lo que la vascularizacin del tumor es un paso fundamental en
el desarrollo tumoral. Como hemos visto en este trabajo, GHRH favorece
diferentes procesos que promueven la progresin tumoral (proliferacin,
adhesin y migracin); adems, nuestros resultados demuestran que GHRH
puede incrementar la angiognesis en clulas de CP agresivo, ya que
provoca un aumento los niveles de VEGF liberados por las clulas. Una vez
ms, los antagonistas de GHRH producen el efecto contrario a GHRH
reduciendo los niveles de la molcula pro-angiognica, VEGF, in vitro e in vivo,
con lo cual, podemos concluir que son compuestos anti-angiognicos. Los
efectos descritos por los antagonistas MZ-J-7-118 y RC-3940-II, en clulas de
CP avanzado avalan los resultados obtenidos en nuestro trabajo (Stangelberger
y col., 2005a). Se ha visto que bajo condiciones de hipoxia, como sucede en el
interior tumoral, se produce un incremento de MMP9 y MMP2 que regula
positivamente los niveles de VEGF (Gong y col., 2014a; Hollborn y col., 2007),
hecho que puede explicar los resultados obtenidos en nuestros modelos
experimentales. En nuestro estudio in vivo, los grupos tratados con los
antagonistas muestran una reduccin importante en los niveles de HIF-1, lo
que puede provocar la reduccin de los niveles de las MMPs y del VEGF
observada en los tumores. A su vez, se ha descrito que la actividad de HIF-1 es
potenciada por la -catenina (Kaidi y col., 2007); por lo tanto, la disminucin del
contenido de dicha protena provocada por los antagonistas de GHRH podra
estar directamente implicada en la reduccin del HIF-1, que a su vez podra
reducir VEGF y MMPs, y con ello la vascularizacin de los tumores.
La diferenciacin neuroendocrina es una caracterstica tpica del

carcinoma prosttico humano, presente en el 5% de las clulas que forman el
- 189 -
tumor (Conteduca y col., 2014). La neurodiferenciacin hace que las clulas

generen de forma autnoma neuropptidos y factores de crecimiento que activan
vas de sealizacin potenciadoras de la progresin tumoral, participando en la
evolucin del CP hacia la independencia andrognica (Conteduca y col., 2014;
Surcel y col., 2014). Nuestro grupo de investigacin tiene estudios previos de
diferenciacin neuroendocrina en CP utilizando clulas LNCaP, mostrando que
el neuropptido VIP es capaz de inducir dicho proceso (Gutierrez-Caas y col.,
2005; Collado y col., 2004; Juarranz y col., 2001). Al pertenecer ambos pptidos
a la misma familia, quisimos comprobar si GHRH era capaz de favorecer la
aparicin de neuritas al igual que el VIP, concluyendo que, GHRH induce la
neurodiferenciacin de las clulas LNCaP a tiempos cortos, y este hecho es
parcialmente bloqueado por el antagonista MIA-690. Este efecto nos indica que
GHRH podra inducir la progresin tumoral hacia un estado de
independencia andrognica a travs de la neurodiferenciacion en clulas
dependientes de andrgenos, as como, los antagonistas podran bloquear
esa progresin al reducir dicha neurodiferenciacin.
A modo de resumen podemos afirmar que GHRH activa la

proliferacin, progresin del ciclo celular, migracin, angiognesis y
neurodiferenciacin e impide la adhesin celular, promoviendo la
progresin tumoral llevando a las clulas tumorales prostticas a un
fenotipo prometastsico, que es bloqueado por los antagonistas de GHRH.
Adems, hemos estudiado, los biomarcadores representativos de cada proceso
que pueden relacionarse entre s directa e indirectamente por intermediacin de
varias molculas. En este sentido, las PKCs se han descrito como molculas
esenciales que median en la sealizacin conducente al fenotipo metastsico
(Kang, 2014). Por ello, valoramos su participacin en estos procesos y su
relacin con los efectos producidos in vivo por los antagonistas JMR-132 y JV-
1-38. El grupo del Dr. Schally ha descrito los cambios producidos en algunas
isoformas de PKC tras el tratamiento con diversos antagonistas de GHRH en
- 190 -
cncer de mama, pulmn y endometrio (Kanashiro y col., 2004; Stangelberger y

col., 2005b; Wu y col., 2010). As, se ha descrito la sobreexpresin de PKC-, -I
y -II en CPRC (Cornford y col., 1999; O'Brian, 1998), y se ha comprobado que
favorecen el crecimiento tumoral, inhiben la apoptosis, y en el caso de PKC-,
tambin inhibe la angiognesis (Kang, 2014; Kim y col., 2008). Nuestros
resultados indican que los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38,
disminuyen la expresin de las isoformas , -I y -II en tumores PC3
xenotransplantados, de forma similar a los efectos producidos por los
antagonistas MZ-J-7-118 y RC-J-29-18 (Stangelberger y col., 2005b). En
cambio, los antagonistas JMR-132 y JV-1-38 inducen la expresin de PKC-,
una isoforma anti-proliferativa y pro-apopttica que acta a travs de MAPK y
p53 (Gonzalez-Guerrico y col., 2005; Perletti y Terrian, 2006). Resultados
similares a los nuestros se han descrito en clulas de cncer de endometrio (Wu
y col., 2010). Los altos niveles de PKC- producidos por los antagonistas de
GHRH, JMR-132 y JV-1-38, en los tumores PC3 podran explicar el aumento
de expresin de p53 y p21, factores de transcripcin reguladores de apoptosis y
ciclo celular. Se ha descrito que la PKC-, es oncosupresora en el CP inhibiendo
a c-myc (Kim y col., 2013), nuestros resultados muestran que los antagonistas
incrementan los niveles de PKC-, a la vez que reduce los de c-myc, y estos
hechos estaran relacionados entre s. Los efectos producidos por los
antagonistas de GHRH sobre los niveles de las diferentes isoformas de PKC,
apoyan la idea de la compleja sealizacin que emplean los antagonistas para
producir sus efectos, siendo necesario profundizar en los mecanismos
moleculares implicados.
Una vez demostrado que GHRH favorece la progresin del CP hacia un

estadio metastsico, el siguiente objetivo que nos planteamos fue estudiar una de
las cascadas de sealizacin ms implicadas en esta progresin, la va del EGFR
- 191 -
(Berger y col., 2006). Resultados previos de nuestro grupo muestran que el

neuropptido VIP provoca la transactivacin de los receptores de EGF a
diferentes tiempos en las clulas de cncer de prstata y de mama avanzado
(Sotomayor y col., 2007; Valdehita y col., 2009). En nuestro estudio GHRH
modula la activacin de EGFR y HER2 en clulas PC3 a travs del
incremento en su expresin y fosforilacin, con una respuesta rpida a los
30 s y otra ms tarda a los 30 min, al igual que se ha descrito en presencia de
VIP (Sotomayor y col., 2007). En la respuesta temprana estn implicadas las
molculas de EGFR y HER2 ya presentes en la clula, sin embargo, en la ms
tarda pueden estar implicadas tambin molculas sintetizadas de novo de estos
receptores generadas a raz de la primera respuesta. Por el contrario, los
antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38 y MIA-690, bloquean tanto la
respuesta temprana como la tarda generadas por la hormona. Resultados
similares se obtienen en el estudio in vivo de los niveles de EGFR activado. Por
el contrario, los niveles de HER2 activado se encuentran aumentados en los
tumores tratados con los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, si bien su
localizacin se focaliza exclusivamente bajo la membrana. Este hecho podra
indicar el proceso de internalizacin de los receptores HER2, ya que se ha
descrito que este receptor sufre un proceso de internalizacin ms rpido al
formar heterodimeros y cuando se encuentra en presencia de ligandos de EGFR
(Hendriks y col., 2003), aunque habra que estudiar dicho proceso para poder
constatar que los receptores estn siendo retirados para su posterior
degradacin.
HER2 es el receptor preferido para heterodimerizar con el resto de

receptores de la familia EGF y producir potentes seales mitognicas (Yen y
col., 2002), asi como para potenciar la progresin hacia CPCR (Berger y col.,
2006). En nuestro estudio, si EGFR es inhibido, GHRH no es capaz de activar a
HER2. Por el contrario, al inhibir HER2 s se consigue activar a EGFR en
presencia de la hormona. Por lo tanto, podemos concluir que GHRH activa
- 192 -
EGFR y este dimeriza con HER2 provocando su activacin. Adems, la

fosforilacin de EGFR podra activar otros miembros de la familia HER y que a
su vez ellos activen a HER2.
Los GHRH-R estn acoplados a protenas G, y su activacin puede

inducir la formacin de cAMP que, a su vez, activa a PKA, esta activacin se ha
descrito que es fundamental para la progresin tumoral en ausencia de
andrgenos (Csernus y col., 1999a). En nuestro trabajo se demuestra que
GHRH transactiva a los receptores EGFR y HER2 a travs de PKA en
tiempos cortos de exposicin a la hormona. Diversos estudios han sealado a
la familia de la tirosina quinasa Src como mediador intracelular de la
transactivacin de los receptores de EGF (Delcourt y col., 2007; El Zein y col.,
2010). En este estudio se confirma que Src media la transactivacin temprana
de EGFR y HER2 producida por GHRH, y que esta, adems, incrementa los
niveles de activacin de Src a tiempos cortos (<1 h) y largos (>2 h). Por otro
lado, los antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38 y MIA-690 son capaces de
bloquear la activacin de Src producida por GHRH. Con estos resultados
podemos concluir que GHRH es capaz de activar a PKA y Src que fosforilan
a EGFR induciendo la transactivacin de un modo temprano e
independiente de ligando. Adems, la activacin de Src podra ser
consecuencia directa de la activacin de PKA provocada por GHRH.
La transactivacin de la familia EGFR puede ser dependiente de la unin

de un ligando a dichos receptores. Esta va de activacin se lleva a cabo
mediante ligandos (HB-EGF, AR, TGF-, etc) anclados a la membrana que son
liberados por la accin de diversas metaloproteasas (Higashiyama y col., 2011).
En nuestro estudio se muestra como a tiempos largos GHRH transactiva los
receptores EGFR y HER2 a travs de las metaloproteasas, y entre ellas, se ha
comprobado que TACE/ADAM17 es una de las implicadas en dicha activacin.
Adems, GHRH incrementa los niveles de TACE a partir de los 5 min de
- 193 -
exposicin a la hormona. En resumen, estos resultados nos indican que a

tiempos largos GHRH induce una transactivacin de EGFR dependiente
de ligando a traves de metaloproteasas. En este sentido, y una vez
comprobado que GHRH activa a Src a diferentes tiempos, ste podra activar a
TACE y as iniciar la va dependiente de ligando.
Los resultados obtenidos con GHRH apuntan en la misma direccin que

los estudios realizados con VIP, el cual se ha descrito que induce la
transactivacin de los receptores EGFR y HER2 dependiente e independiente
de ligando en clulas PC3 (Sotomayor y col., 2007). Otros estudios han
demostrados la capacidad de los GPCRs para transactivar a miembros de la
familia del EGFR, como el receptor de prostaglandina E2 en clulas renales
(Fernndez-Martnez y Lucio., 2013) y el receptor sensible a Calcio (CaR) en
clulas prostticas, que activan a EGFR (Yano y col., 2004).
Por otro lado, la activacin de receptores tirosina quinasa inducida por

factores de crecimiento provoca la liberacin extracelular de algunos ligandos
de GPCRs, que se unen y activan el receptor correspondiente de forma
autocrina/paracrina (Delcourt y col., 2007; Mira y col., 2001). En una primera
aproximacin para comprobar este hecho, se estudia si EGF afecta a los niveles
de expresin de GHRH y GHRH-R, observando un aumento de los niveles de
los mRNA para ambos en clulas de cncer de prstata independientes de
andrgenos. Estos resultados muestran que entre GHRH y EGF existe una
interrelacin en cncer de prstata avanzado que podra retroalimentar los
efectos biolgicos de ambas vas de sealizacin.
La familia del EGFR est implicada en procesos que favorecen la

progresin tumoral como son proliferacin, adhesin, migracin y angiognesis.
Como hemos comprobado anteriormente GHRH transactiva EGFR y HER2,
por ello, quisimos comprobar si los efectos que ejerce la hormona sobre la
progresin tumoral, pueden deberse a dicha activacin. Nuestros resultados
- 194 -
indican que la transactivacin de EGFR inducida por GHRH es, en parte,

responsable del incremento de VEGF y de la migracin celular provocada
por la hormona en clulas PC3, y por el contrario, la transactivacin de HER2
es la responsable de la disminucin en la adhesin celular provocada por
GHRH. Este ltimo resultado, junto con el hecho de que GHRH no transactiva
directamente a HER2, nos lleva a pensar que este receptor puesde estar siendo
activado por otros miembros de la misma familia, mediante heterodimerizacin.
La importancia de los resultados analizados en este trabajo, nos llev al

diseo de un estudio in vivo en tumores PC3 sobre el efecto combinado del
antagonista de GHRH con mejores resultados, MIA-690, y de un inhibidor
reversible de EGFR, Gefitinib, agente quimioteraputico aprobado para el uso
clnico en el cncer de pulmn (Melosky, 2014). El tratamiento combinado de
ambos agentes provoca una mayor reduccin en el crecimiento tumoral que el
efecto producido usando cada compuesto por separado, incrementando de forma
importante el tiempo de duplicacin del tumor. Adems, un anlisis preliminar
del nivel angiognico en los tumores generados indica que la combinacin de
ambos compuestos potencian la disminucin del factor proangiognico VEGF.
Por otro lado, el estudio de la actividad glucoltica tumoral en los animales, nos
indica la reducida presencia de focos metastsicos en el grupo tratado con la
combinacin de ambos compuestos. A falta de un anlisis ms exhaustivo de los
tumores extraidos, podemos apuntar que la combinacin de MIA-690 y de
Gefitinib reduce el crecimiento tumoral y metstasis de tumores PC3,
apoyando el posible uso teraputico de la combinacin ambos compuestos.
La terapia combinada con ambas molculas har que, por un lado, MIA-690
inhiba la va de GHRH, asi como, la activacin de EGFR y HER2 que provoca
la hormona, y por otro lado, Gefitinib inhiba la activacin de EGFR inducida
por otras molculas (bloquea el sitio de unin al ATP).
- 195 -
En resumen, los resultados presentados en esta tesis sealan a GHRH

como una molcula capaz de inducir procesos requeridos para el desarrollo
de un fenotipo metastsico en el CP, convirtindose de esta forma en una
diana teraputica para la cura de esta enfermedad. En este sentido, los
antagonistas de GHRH quedan definidos como perfectos inhibidores de la
accin neoplsica de dicha hormona, siendo avalados por los ensayos in vivo. Los
antagonistas de GHRH deben ser considerados para su uso en futuras
estrategias teraputicas por s solos o en combinacin con inhibidores de
EGFR en el CP avanzado.
- 196 -
6. CONCLUSIONES
Conclusiones Universidad de Alcal
1. Las tres lneas celulares prostticas, RWPE-1, LNCaP y PC3 sintetizan

GHRH, siendo mayores sus niveles proteicos en las clulas tumorales con
respecto a las no tumorales, y dentro de ellas en las representativas del
estadio ms avanzado de la enfermedad.
2. Los receptores de GHRH se localizan en la membrana plasmtica y

citoplasma, y estn diferencialmente expresados, p-GHRH-R es
mayoritario en la lnea celular LNCaP, y las variantes de splicing SVs, en
clulas PC3. Adems, los antagonistas de GHRH incrementan los niveles
de mRNA de los receptores de GHRH en clulas PC3.
3. GHRH incrementa, y sus antagonistas disminuyen, la viabilidad de las

tres lneas celulares, con mayores efectos sobre las clulas representativas
del CP avanzado.
4. GHRH incrementa la proliferacin celular de las tres lneas prostticas,

mostrndose significativamente mayor para las clulas RWPE-1. En
paralelo, GHRH provoca un incremento del marcador de proliferacin
PCNA, de forma ms rpida y contundente en las clulas representativas
de un estadio de CP agresivo. Los antagonistas de GHRH provocan el
efecto contrario, y adems en presencia de GHRH boquean su accin sobre
las clulas PC3.
5. GHRH provoca un incremento de clulas en fase mittica, y sus

antagonistas inducen parada del ciclo celular y apoptosis en clulas de
CP avanzado, mediados por la disminucin de los niveles de p21, p53 y
Bax/Bcl2. Los antagonistas de GHRH ejercen in vitro el efecto opuesto
sobre dichas molculas.
- 199 -
Universidad de Alcal Conclusiones
6. GHRH disminuye la adhesin de clulas prostticas a una base de

colgeno, a la vez que reduce los niveles de E-cadherina e incrementa los
niveles de -catenina en el ncleo, as como la expresin de sus genes diana
CD44, c-myc y ciclina D1. Los antagonistas de GHRH ejercen un efecto
opuesto al de GHRH sobre clulas prostticas.
7. GHRH incrementa la migracin de clulas RWPE-1 y PC3, acompaada

de un incremento de los niveles de expresin y actividad gelatinoltica de
las MMP2 y 9. Los antagonistas de GHRH reducen la migracin en ambas
lneas celulares, al igual que los niveles de las MMPs.
8. GHRH aumenta los niveles de VEGF en clulas de CP agresivo, mientras

que sus antagonistas reducen dichos niveles.
9. GHRH aumenta la diferenciacin neuroendocrina en clulas LNCaP a

tiempos cortos, lo que es bloqueado parcialmente por el antagonista MIA-
690.
10. GHRH induce la capacidad tumorignica de las clulas epiteliales

prostticas RWPE-1, llegando a desarrollar tumores en un modelo
experimental in vivo.
11. Los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, en un modelo in vivo

de CP avanzado reducen el volumen tumoral, y modulan la expresin de
diferentes biomarcadores lo que lleva a un efecto pro-apopttico,
antimitognico, anti-angiognico, anti-migratorio y anti-invasivo.
12. GHRH transactiva EGFR, y este heterodimeriza con HER2, que puede
ser activado por otros miembros de la familia del EGFR. Dicha
transactivacin puede ser de respuesta temprana o independiente de
- 200 -
Conclusiones Universidad de Alcal
ligando a travs de PKA y Src; y tarda o dependiente de ligando por la

accin de metaloproteasas como ADAM17. La transactivacin de EGFR y
HER2 producida por GHRH es, en parte, responsable de los efectos
ejercidos por la hormona sobre la adhesin, migracin y angiognesis.
13. El antagonista de GHRH, MIA-690 en combinacin con el inhibidor de

EGFR, Gefitinib, reducen el volumen de tumores PC3 en ratones
inmunodeprimidos con mayor magnitud que usando cada tratamiento por
separado.
En conclusin, los resultados mostrados en este trabajo proponen a

GHRH como agente protumoral, activando diferentes vas de sealizacin
implicadas en los procesos favorecedores de la progresin tumoral, lo que nos
lleva a sealar a sus receptores como dianas teraputicas en el tratamiento del
cncer de prstata. En este sentido, los antagonistas de GHRH se presentan
como posibles agentes teraputicos por s solos o en combinacin con otros
agentes antineoplsicos utilizados actualmente en clnica, para la cura de esta
enfermedad.
En la figura 77 se muestra un esquema de la interaccin de GHRH con
diferentes elementos celulares, bloqueada por la intermediacin de los
antagonistas de GHRH.
- 201 -
Universidad de Alcal Conclusiones
A) Antagonistas
de GHRH
GHRH

p53
HIF-1
STAT3 E-Cadherina
p21
ERK1/2
Bax Bcl2 -Catenina
p21 MMP9 y 2
PCNA
ciclina D1 CD44 VEGF
c-myc
S
G1
M G2
Apoptosis Perdida de adhesin
Proliferacin celular Ciclo celular Angiognesis
y migracin celular
B) Antagonistas
de GHRH
Ligandos
GHRH EGFR EGF
ADAM
GHRH-R EGFR HER2
PKA
p Src
GHRH
GHRH-R
EGFR GHRH
HER2 GHRH-R
Figura 77. Efectos de GHRH y sus antagonistas sobre molculas y fenotipos

implicados en la progresin del CP (A). Transactivacin de EGFR y HER2
mediada por GHRH en clulas de CP avanzado (B). (EP)
- 202 -
7. BIBLIOGRAFA
Bibliografa Universidad de Alcal
Abbas, T., y Dutta, A. (2009). p21 in cancer: intricate networks and

multiple activities. Nat Rev Cancer 9, 400-414.
Androutsopoulos, G., Adonakis, G., Liava, A., Ravazoula, P., y

Decavalas, G. (2013). Expression and potential role of ErbB receptors in
type II endometrial cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 168, 204-
208.
Arteaga, C. L. (2002). Epidermal growth factor receptor dependence in

human tumors: more than just expression? Oncologist 7 Suppl 4, 31-39.
Arya, M., Bott, S. R., Shergill, I. S., Ahmed, H. U., Williamson, M., y
Patel, H. R. (2006). The metastatic cascade in prostate cancer. Surg
Oncol 15, 117-128.
Baker, L. D., Barsness, S. M., Borson, S., Merriam, G. R., Friedman, S.

D., Craft, S., y Vitiello, M. V. (2012). Effects of growth hormone
releasing hormone on cognitive function in adults with mild cognitive
impairment and healthy older adults: results of a controlled trial. Arch
Neurol 69, 1420-1429.
Barabutis, N., y Schally, A. V. (2010). Growth hormone-releasing

hormone: extrapituitary effects in physiology and pathology. Cell Cycle
9, 4110-4116.
Barabutis, N., Siejka, A., y Schally, A. V. (2011). Growth hormone

releasing hormone induces the expression of nitric oxide synthase. J Cell
Mol Med 15, 1148-1155.
Basu, A., y Haldar, S. (1998). The relationship between BcI2, Bax and
p53: consequences for cell cycle progression and cell death. Mol Hum
Reprod 4, 1099-1109.
- 203 -
Universidad de Alcal Bibliografa
Bauvois, B. (2012). New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and

MMP-9 as cell surface transducers: outside-in signaling and relationship
to tumor progression. Biochim Biophys Acta 1825, 29-36.
Bellyei, S., Schally, A. V., Zarandi, M., Varga, J. L., Vidaurre, I., y
Pozsgai, E. (2010). GHRH antagonists reduce the invasive and
metastatic potential of human cancer cell lines in vitro. Cancer Lett 293,
31-40.
Berger, R., Lin, D. I., Nieto, M., Sicinska, E., Garraway, L. A., Adams,
H., Signoretti, S., Hahn, W. C., y Loda, M. (2006). Androgen-dependent
regulation of Her-2/neu in prostate cancer cells. Cancer Res 66, 5723-
5728.
Bertelsen, V., y Stang, E. (2014). The Mysterious Ways of

ErbB2/HER2 Trafficking. Membranes (Basel) 4, 424-446.
Berx, G., y van Roy, F. (2009). Involvement of members of the cadherin

superfamily in cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 1, a003129.
Braczkowski, R., Schally, A. V., Plonowski, A., Varga, J. L., Groot, K.,
Krupa, M., y Armatis, P. (2002). Inhibition of proliferation in human
MNNG/HOS osteosarcoma and SK-ES-1 Ewing sarcoma cell lines in
vitro and in vivo by antagonists of growth hormone-releasing hormone:
effects on insulin-like growth factor II. Cancer 95, 1735-1745.
Buchholz, S., Schally, A. V., Engel, J. B., Hohla, F., Heinrich, E., Koester,
F., Varga, J. L., y Halmos, G. (2007). Potentiation of mammary cancer
inhibition by combination of antagonists of growth hormone-releasing
hormone with docetaxel. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1943-1946.
- 204 -
Busto, R., Schally, A. V., Varga, J. L., Garcia-Fernandez, M. O., Groot,

K., Armatis, P., y Szepeshazi, K. (2002). The expression of growth
hormone-releasing hormone (GHRH) and splice variants of its receptor
in human gastroenteropancreatic carcinomas. Proc Natl Acad Sci U S A
99, 11866-11871.
Canel, M., Serrels, A., Frame, M. C., y Brunton, V. G. (2013). E-

cadherin-integrin crosstalk in cancer invasion and metastasis. J Cell Sci
126, 393-401.
Cargnello, M., y Roux, P. P. (2011). Activation and function of the

MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases.
Microbiol Mol Biol Rev 75, 50-83.
Carlomagno, F., y Chiariello, M. (2014). Growth factor transduction

pathways: paradigm of anti-neoplastic targeted therapy. J Mol Med 92,
723-733.
Carrin-Salip, D., Panosa, C., Menendez, J. A., Puig, T., Oliveras, G.,
Pandiella, A., De Llorens, R., y Massaguer, A. (2012). Androgen-
independent prostate cancer cells circumvent EGFR inhibition by
overexpression of alternative HER receptors and ligands. Int J Oncol 41,
1128-1138.
Castilla, C., Chinchn, D., Medina, R., Torrubia, F. J., Japn, M. A., y
Sez, C. (2013). PTPL1 and PKC contribute to proapoptotic signalling
in prostate cancer cells. Cell Death Dis 4, e576.
Cavallaro, U., y Christofori, G. (2004). Cell adhesion and signalling by

cadherins and Ig-CAMs in cancer. Nat Rev Cancer 4, 118-132.
- 205 -
Chang, G., Zhang, H., Wang, J., Zhang, Y., Xu, H., Wang, C., Ma, L., Li,
Q., y Pang, T. (2013). CD44 targets Wnt/-catenin pathway to mediate
the proliferation of K562 cells. Cancer Cell Int 13, 117.
Chen, F. Z., y Zhao, X. K. (2013). Prostate Cancer: Current Treatment

and Prevention Strategies. Iran Red Crescent Med J 15, 279-284.
Chopin, L. K., y Herington, A. C. (2001). A potential autocrine pathway

for growth hormone releasing hormone (GHRH) and its receptor in
human prostate cancer cell lines. Prostate 49, 116-121.
Ciampani, T., Fabbri, A., Isidori, A., y Dufau, M. L. (1992). Growth

hormone-releasing hormone is produced by rat Leydig cell in culture and
acts as a positive regulator of Leydig cell function. Endocrinology 131,
2785-2792.
Collado, B., Carmena, M. J., Clemente, C., Prieto, J. C., y Bajo, A. M.

(2007). Vasoactive intestinal peptide enhances growth and angiogenesis
of human experimental prostate cancer in a xenograft model. Peptides
28, 1896-1901.
Collado, B., Gutirrez-Caas, I., Rodrguez-Henche, N., Prieto, J. C., y

Carmena, M. J. (2004). Vasoactive intestinal peptide increases vascular
endothelial growth factor expression and neuroendocrine differentiation
in human prostate cancer LNCaP cells. Regul Pept 119, 69-75.
Colloca, G., y Venturino, A. (2011). The evolving role of familial history

for prostate cancer. Acta Oncol 50, 14-24.
Conteduca, V., Aieta, M., Amadori, D., y De Giorgi, U. (2014).

Neuroendocrine differentiation in prostate cancer: Current and emerging
therapy strategies. Crit Rev Oncol Hematol 92, 11-24
- 206 -
Cornford, P., Evans, J., Dodson, A., Parsons, K., Woolfenden, A.,
Neoptolemos, J., y Foster, C. S. (1999). Protein kinase C isoenzyme
patterns characteristically modulated in early prostate cancer. Am J
Pathol 154, 137-144.
Csernus, V., Schally, A. V., y Groot, K. (1999a). Antagonistic analogs of

growth hormone releasing hormone (GHRH) inhibit cyclic AMP
production of human cancer cell lines in vitro. Peptides 20, 843-850.
Csernus, V., Schally, A. V., y Groot, K. (1999b). Effect of GHRH and

peptides from the vasoactive intestinal peptide family on cAMP
production of human cancer cell lines in vitro. J Endocrinol 163, 269-280.
Daub, H., Weiss, F. U., Wallasch, C., yUllrich, A. (1996). Role of

transactivation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled
receptors. Nature 379, 557-560.
Delcourt, N., Bockaert, J., y Marin, P. (2007). GPCR-jacking: from a

new route in RTK signalling to a new concept in GPCR activation.
Trends Pharmacol Sci 28, 602-607.
Di Francesco, S., y Tenaglia, R. L. (2014). Obesity, diabetes and

aggressive prostate cancer hormone-nave at initial diagnosis. Cent
European J Urol 66, 423-427.
Dimakakos, A., Armakolas, A., y Koutsilieris, M. (2014). Novel Tools

for Prostate Cancer Prognosis, Diagnosis, and Follow-Up. Biomed Res
Int 2014, 890697.
- 207 -
Dioufa, N., Schally, A. V., Chatzistamou, I., Moustou, E., Block, N. L.,
Owens, G. K., Papavassiliou, A. G., y Kiaris, H. (2010). Acceleration of
wound healing by growth hormone-releasing hormone and its agonists.
Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18611-18615.
Dorsam, R. T., y Gutkind, J. S. (2007). G-protein-coupled receptors and

cancer. Nat Rev Cancer 7, 79-94.
Drr, M., Schlesinger-Raab, A., y Engel, J. (2013). Advances in Prostate

Cancer, Vol 1.
Duffy, M. J., Mullooly, M., O'Donovan, N., Sukor, S., Crown, J., Pierce,
A., y McGowan, P. M. (2011). The ADAMs family of proteases: new
biomarkers and therapeutic targets for cancer? Clin Proteomics 8, 9.
Edge, S., Byrd, D. R., Compton, C. C., Fritz, A. G., Greene, F. L., y
Trotti, A. (2010). The American Joint Committee on Cancer: the 7th
edition of the AJCC cancer staging manual and the future of TNM. Ann
Surg Oncol 17, 1471-1474.
El Zein, N., D'Hondt, S., y Sariban, E. (2010). Crosstalks between the

receptors tyrosine kinase EGFR and TrkA and the GPCR, FPR, in
human monocytes are essential for receptors-mediated cell activation.
Cell Signal 22, 1437-1447.
Engel, J. B., Keller, G., Schally, A. V., Toller, G. L., Groot, K., Havt, A.,
Armatis, P., Zarandi, M., Varga, J. L., y Halmos, G. (2005). Inhibition of
growth of experimental human endometrial cancer by an antagonist of
growth hormone-releasing hormone. J Clin Endocrinol Metab 90, 3614-
3621.
- 208 -
Fahrenholtz, C. D., Rick, F. G., Garcia, M. I., Zarandi, M., Cai, R. Z.,
Block, N. L., Schally, A. V., y Burnstein, K. L. (2014). Preclinical efficacy
of growth hormone-releasing hormone antagonists for androgen-
dependent and castration-resistant human prostate cancer. Proc Natl
Acad Sci U S A 111, 1084-1089.
Fainstein Day, P., Frohman, L., Garcia Rivello, H., Reubi, J. C.,
Sevlever, G., Glerean, M., Fernandez Gianotti, T., Pietrani, M., Rabadan,
A., Racioppi, S., y Bidlingmaier, M. (2007). Ectopic growth hormone-
releasing hormone secretion by a metastatic bronchial carcinoid tumor: a
case with a non hypophysial intracranial tumor that shrank during long
acting octreotide treatment. Pituitary 10, 311-319.
Fernndez-Martnez, A. B., Bajo, A. M., Isabel Arenas, M., Snchez-

Chapado, M., Prieto, J. C., y Carmena, M. J. (2010). Vasoactive intestinal
peptide (VIP) induces malignant transformation of the human prostate
epithelial cell line RWPE-1. Cancer Lett 299, 11-21.
Fernndez-Martnez, A. B., Bajo, A. M., Snchez-Chapado, M., Prieto, J.

C., y Carmena, M. J. (2009). Vasoactive intestinal peptide behaves as a
pro-metastatic factor in human prostate cancer cells. Prostate 69, 774-
786.
Fernndez-Martnez, A. B., y Lucio Cazaa, F. J. (2013). Epidermal

growth factor receptor transactivation by intracellular prostaglandin E2-
activated prostaglandin E2 receptors. Role in retinoic acid receptor-
up-regulation. Biochim Biophys Acta 1833, 2029-2038.
- 209 -
Ferrs-I-Tortajada, J., Berbel-Tornero, O., Garcia-I-Castell, J., Lpez-

Andreu, J. A., Sobrino-Najul, E., y Ortega-Garca, J. A. (2011). Non
dietetic environmental risk factors in prostate cancer. Actas Urol Esp 35,
289-295.
Folkman, J. (1971). Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N

Engl J Med 285, 1182-1186.
Friedman, S. D., Baker, L. D., Borson, S., Jensen, J. E., Barsness, S. M.,
Craft, S., Merriam, G. R., Otto, R. K., Novotny, E. J., y Vitiello, M. V.
(2013). Growth hormone-releasing hormone effects on brain -
aminobutyric acid levels in mild cognitive impairment and healthy aging.
JAMA Neurol 70, 883-890.
Frohman, L. A., Downs, T. R., Chomczynski, P., Brar, A., y Kashio, Y.

(1989). Regulation of growth hormone-releasing hormone gene
expression and biosynthesis. Yale J Biol Med 62, 427-433.
Frohman, L. A., y Kineman, R. D. (2002). Growth hormone-releasing

hormone and pituitary development, hyperplasia and tumorigenesis.
Trends Endocrinol Metab 13, 299-303.
Frohman, L. A., y Szabo, M. (1981). Ectopic production of growth

hormone-releasing factor by carcinoid and pancreatic islet tumors
associated with acromegaly. Prog Clin Biol Res 74, 259-271.
Gallego, R., Pintos, E., Garca-Caballero, T., Raghay, K., Boulanger, L.,
Beiras, A., Gaudreau, P., y Morel, G. (2005). Cellular distribution of
growth hormone-releasing hormone receptor in human reproductive
system and breast and prostate cancers. Histol Histopathol 20, 697-706.
- 210 -
Garcia-Fernandez, M. O., Schally, A. V., Varga, J. L., Groot, K., y

Busto, R. (2003). The expression of growth hormone-releasing hormone
(GHRH) and its receptor splice variants in human breast cancer lines; the
evaluation of signaling mechanisms in the stimulation of cell
proliferation. Breast Cancer Res Treat 77, 15-26.
Gaylinn, B. D. (2002). Growth hormone releasing hormone receptor.

Receptors Channels 8, 155-162.
Gaylinn, B. D., von Kap-Herr, C., Golden, W. L., y Thorner, M. O.

(1994). Assignment of the human growth hormone-releasing hormone
receptor gene (GHRHR) to 7p14 by in situ hybridization. Genomics 19,
193-195.
George, A. J., Hannan, R. D., y Thomas, W. G. (2013). Unravelling the

molecular complexity of GPCR-mediated EGFR transactivation using
functional genomics approaches. FEBS J 280, 5258-5268.
Gleason, D. F. (1992). Histologic grading of prostate cancer: a

perspective. Hum Pathol 23, 273-279.
Gong, J., Zhu, S., Zhang, Y., y Wang, J. (2014a). Interplay of VEGFa
and MMP2 regulates invasion of glioblastoma. Tumour Biol.
Gong, Y., Chippada-Venkata, U. D., y Oh, W. K. (2014b). Roles of

matrix metalloproteinases and their natural inhibitors in prostate cancer
progression. Cancers (Basel) 6, 1298-1327.
Gonzalez-Guerrico, A. M., Meshki, J., Xiao, L., Benavides, F., Conti, C.

J., y Kazanietz, M. G. (2005). Molecular mechanisms of protein kinase C-
induced apoptosis in prostate cancer cells. J Biochem Mol Biol 38, 639-
645.
- 211 -
Granata, R., Trovato, L., Gallo, M. P., Destefanis, S., Settanni, F.,
Scarlatti, F., Brero, A., Ramella, R., Volante, M., Isgaard, J., y col. (2009).
Growth hormone-releasing hormone promotes survival of cardiac
myocytes in vitro and protects against ischaemia-reperfusion injury in
rat heart. Cardiovasc Res 83, 303-312.
Grant, C. M., y Kyprianou, N. (2013). Epithelial mesenchymal transition

(EMT) in prostate growth and tumor progression. Translational
Andrology and Urology 2, 202-211.
Greg L. S. y David E. N. (2013). Capitulo 2: Molecular Biology and

Prostate Cancer. Prostate Cancer: A Comprehensive Perspective.
Molecular Biology and Prostate Cancer. ED: Tewari, A. Reino Unido.
Guillemin, R., Brazeau, P., Bhlen, P., Esch, F., Ling, N., y Wehrenberg,
W. B. (1982). Growth hormone-releasing factor from a human pancreatic
tumor that caused acromegaly. Science 218, 585-587.
Guo, J., Schally, A. V., Zarandi, M., Varga, J., y Leung, P. C. (2010).
Antiproliferative effect of growth hormone-releasing hormone (GHRH)
antagonist on ovarian cancer cells through the EGFR-Akt pathway.
Reprod Biol Endocrinol 8, 54.
Gutirrez-Caas, I., Juarranz, M. G., Collado, B., Rodrguez-Henche,

N., Chiloeches, A., Prieto, J. C., y Carmena, M. J. (2005). Vasoactive
intestinal peptide induces neuroendocrine differentiation in the LNCaP
prostate cancer cell line through PKA, ERK, and PI3K. Prostate 63, 44-
55.
- 212 -
Hadler-Olsen, E., Winberg, J. O., y Uhlin-Hansen, L. (2013). Matrix

metalloproteinases in cancer: their value as diagnostic and prognostic
markers and therapeutic targets. Tumour Biol 34, 2041-2051.
Hallschmid, M., Wilhelm, I., Michel, C., Perras, B., y Born, J. (2011). A
role for central nervous growth hormone-releasing hormone signaling in
the consolidation of declarative memories. PLoS One 6, e23435.
Halmos, G., Schally, A. V., Czompoly, T., Krupa, M., Varga, J. L., y
Rekasi, Z. (2002). Expression of growth hormone-releasing hormone and
its receptor splice variants in human prostate cancer. J Clin Endocrinol
Metab 87, 4707-4714.
Havt, A., Schally, A. V., Halmos, G., Varga, J. L., Toller, G. L., Horvath,
J. E., Szepeshazi, K., Kster, F., Kovitz, K., Groot, K., y col. (2005). The
expression of the pituitary growth hormone-releasing hormone receptor
and its splice variants in normal and neoplastic human tissues. Proc Natl
Acad Sci U S A 102, 17424-17429.
Heath, V. (2005). GHRH antagonists: a novel therapy for non-Hodgkin's

lymphoma. Nat Clin Pract End Met 1, 8-8.
Hendriks, B. S., Opresko, L. K., Wiley, H. S., y Lauffenburger, D. (2003).

Quantitative analysis of HER2-mediated effects on HER2 and epidermal
growth factor receptor endocytosis: distribution of homo- and
heterodimers depends on relative HER2 levels. J Biol Chem 278, 23343-
23351.
Higashiyama, S., Nanba, D., Nakayama, H., Inoue, H., y Fukuda, S.

(2011). Ectodomain shedding and remnant peptide signalling of EGFRs
and their ligands. J Biochem 150, 15-22.
- 213 -
Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A.
T., y De Bruijn, E. A. (2004). Vascular endothelial growth factor and
angiogenesis. Pharmacol Rev 56, 549-580.
Hohla, F., Buchholz, S., Schally, A. V., Seitz, S., Rick, F. G., Szalontay,
L., Varga, J. L., Zarandi, M., Halmos, G., Vidaurre, I., y col. (2009).
GHRH antagonist causes DNA damage leading to p21 mediated cell
cycle arrest and apoptosis in human colon cancer cells. Cell Cycle 8,
3149-3156.
Hollborn, M., Stathopoulos, C., Steffen, A., Wiedemann, P., Kohen, L., y
Bringmann, A. (2007). Positive feedback regulation between MMP-9 and
VEGF in human RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 4360-4367.
Huang, Y., y Chang, Y. (2010). Capitulo 8: Epidermal Growth Factor

Receptor (EGFR) Phosphorylation, Signaling and Trafficking in
Prostate Cancer. Prostate Cancer - From Bench to Bedside. Ed P.E.
Spiess. EEUU.
Iczkowski, K. A., y Lucia, M. S. (2011). Current perspectives on Gleason

grading of prostate cancer. Curr Urol Rep 12, 216-222.
Jaszberenyi, M., Rick, F. G., Szalontay, L., Block, N. L., Zarandi, M.,
Cai, R. Z., y Schally, A. V. (2012). Beneficial effects of novel antagonists
of GHRH in different models of Alzheimer's disease. Aging 4, 755-767.
Jin, J. K., Dayyani, F., y Gallick, G. E. (2011). Steps in prostate cancer

progression that lead to bone metastasis. Int J Cancer 128, 2545-2561.
Johnstone, R. W., Ruefli, A. A., y Lowe, S. W. (2002). Apoptosis: a link

between cancer genetics and chemotherapy. Cell 108, 153-164.
- 214 -
Joniau, S., Tosco, L., Briganti, A., Vanden Broeck, T., Gontero, P.,
Karnes, R. J., Spahn, M., y Van Poppel, H. (2013). Results of surgery for
high-risk prostate cancer. Curr Opin Urol 23, 342-348.
Juarranz, M. G., Bolaos, O., Gutirrez-Caas, I., Lerner, E. A.,

Robberecht, P., Carmena, M. J., Prieto, J. C., y Rodrguez-Henche, N.
(2001). Neuroendocrine differentiation of the LNCaP prostate cancer cell
line maintains the expression and function of VIP and PACAP receptors.
Cell Signal 13, 887-894.
Kahn, Z., Arencibia, J. M., Csernus, V. J., Groot, K., Kineman, R. D.,
Robinson, W. R., y Schally, A. V. (1999). Expression of growth hormone-
releasing hormone (GHRH) messenger ribonucleic acid and the presence
of biologically active GHRH in human breast, endometrial, and ovarian
cancers. J Clin Endocrinol Metab 84, 582-589.
Kaidi, A., Williams, A. C., y Paraskeva, C. (2007). Interaction between

beta-catenin and HIF-1 promotes cellular adaptation to hypoxia. Nat
Cell Biol 9, 210-217.
Kanashiro, C. A., Schally, A. V., Zarandi, M., Hammann, B. D., y Varga,

J. L. (2004). Suppression of growth of H-69 small cell lung carcinoma by
antagonists of growth hormone releasing hormone and bombesin is
associated with an inhibition of protein kinase C signaling. Int J Cancer
112, 570-576.
Kanashiro, C. A., Schally, A. V., Zarandi, M., Hammann, B. D., y Varga,

J. L. (2007). Alterations of EGFR/HER, angiogenesis and apoptosis
pathways after therapy with antagonists of growth hormone releasing
hormone and bombesin in non-small cell lung cancer. Int J Oncol 30,
1019-1028.
- 215 -
Kang, J.-H. (2014). Protein Kinase C (PKC) Isozymes and Cancer. New
Journal of Science 2014, 36.
Kheirandish, P., y Chinegwundoh, F. (2011). Ethnic differences in

prostate cancer. Br J Cancer 105, 481-485.
Khorram, O., Garthwaite, M., Grosen, E., y Golos, T. (2001). Human

uterine and ovarian expression of growth hormone-releasing hormone
messenger RNA in benign and malignant gynecologic conditions. Fertil
Steril 75, 174-179.
Kiaris, H., Block, N. L., Papavassiliou, A. G., y Schally, A. V. (2011a).

GHRH and wound healing. Commun Integr Biol 4, 82-83.
Kiaris, H., Chatzistamou, I., Papavassiliou, A. G., y Schally, A. V.

(2011b). Growth hormone-releasing hormone: not only a neurohormone.
Trends Endocrinol Metab 22, 311-317.
Kiaris, H., Chatzistamou, I., Schally, A. V., Halmos, G., Varga, J. L.,
Koutselini, H., y Kalofoutis, A. (2003). Ligand-dependent and -
independent effects of splice variant 1 of growth hormone-releasing
hormone receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 9512-9517.
Kiaris, H., y Schally, A. V. (1999). Decrease in telomerase activity in U-

87MG human glioblastomas after treatment with an antagonist of
growth hormone-releasing hormone. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 226-
231.
Kiaris, H., Schally, A. V., y Armatis, P. (2001). Direct action of growth

hormone-releasing hormone agonist JI-38 on normal human fibroblasts:
evidence from studies on cell proliferation and c-myc proto-oncogene
expression. Regul Pept 96, 119-124.
- 216 -
Kiaris, H., Schally, A. V., Varga, J. L., Groot, K., y Armatis, P. (1999).
Growth hormone-releasing hormone: an autocrine growth factor for
small cell lung carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14894-14898.
Kim, J., Choi, Y. L., Vallentin, A., Hunrichs, B. S., Hellerstein, M. K.,
Peehl, D. M., y Mochly-Rosen, D. (2008). Centrosomal PKCbetaII and
pericentrin are critical for human prostate cancer growth and
angiogenesis. Cancer Res 68, 6831-6839.
Kim, J. Y., Valencia, T., Abu-Baker, S., Linares, J., Lee, S. J., Yajima, T.,
Chen, J., Eroshkin, A., Castilla, E. A., Brill, L. M., y col. (2013). c-Myc
phosphorylation by PKC represses prostate tumorigenesis. Proc Natl
Acad Sci U S A 110, 6418-6423.
Kirby, R. S., Partin, A. W., Feneley, M., y Parsons, J. K. (2006). Prostate

Cancer: Principles and Practice. ED: Taylor & Francis. Reino Unido
Kong, A., Calleja, V., Leboucher, P., Harris, A., Parker, P. J., y Larijani,
B. (2008). HER2 oncogenic function escapes EGFR tyrosine kinase
inhibitors via activation of alternative HER receptors in breast cancer
cells. PLoS One 3, e2881.
Kote-Jarai, Z., Easton, D. F., Stanford, J. L., Ostrander, E. A.,

Schleutker, J., Ingles, S. A., Schaid, D., Thibodeau, S., Drk, T., Neal, D.,
y col. (2008). Multiple novel prostate cancer predisposition loci
confirmed by an international study: the Practical Consortium. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 17, 2052-2061.
- 217 -
Kovacs, M., Kineman, R. D., Schally, A. V., Zarandi, M., Groot, K., y
Frohman, L. A. (1997). Effects of antagonists of growth hormone-
releasing hormone (GHRH) on GH and insulin-like growth factor I
levels in transgenic mice overexpressing the human GHRH gene, an
animal model of acromegaly. Endocrinology 138, 4536-4542.
Kozloski, G. A., Carraway, C. A., y Carraway, K. L. (2010). Mechanistic

and signaling analysis of Muc4-ErbB2 signaling module: new insights
into the mechanism of ligand-independent ErbB2 activity. J Cell Physiol
224, 649-657.
Kubota, Y. (2012). Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy.

Keio J Med 61, 47-56.
Kuo, T. C., Huang, W. J., y Guh, J. H. (2011). WJ9708012 exerts

anticancer activity through PKC- related crosstalk of mitochondrial and
endoplasmic reticulum stresses in human hormone-refractory prostate
cancer cells. Acta Pharmacol Sin 32, 89-98.
Lauden, L., Siewiera, J., Boukouaci, W., Ramgolam, K., Mourah, S.,
Lebbe, C., Charron, D., Aoudjit, F., Jabrane-Ferrat, N., y Al-Daccak, R.
(2014). TGF--induced (TGFBI) protein in melanoma: a signature of
high metastatic potential. J Invest Dermatol 134, 1675-1685.
Lee, M. J., Heo, S. C., Shin, S. H., Kwon, Y. W., Do, E. K., Suh, D. S.,
Yoon, M. S., y Kim, J. H. (2013). Oncostatin M promotes mesenchymal
stem cell-stimulated tumor growth through a paracrine mechanism
involving periostin and TGFBI. Int J Biochem Cell Biol 45, 1869-1877.
- 218 -
Lemmon, M. A., Schlessinger, J., y Ferguson, K. M. (2014). The EGFR

family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harb
Perspect Biol 6, a020768.
Li, P., Yang, R., y Gao, W. Q. (2014). Contributions of epithelial-

mesenchymal transition and cancer stem cells to the development of
castration resistance of prostate cancer. Mol Cancer 13, 55.
Lin, J., Tang, H., Jin, X., Jia, G., y Hsieh, J. T. (2002). p53 regulates
Stat3 phosphorylation and DNA binding activity in human prostate
cancer cells expressing constitutively active Stat3. Oncogene 21, 3082-
3088.
Ling, N., Esch, F., Bhlen, P., Brazeau, P., Wehrenberg, W. B., y
Guillemin, R. (1984). Isolation, primary structure, and synthesis of
human hypothalamic somatocrinin: growth hormone-releasing factor.
Ludwig, B., Ziegler, C. G., Schally, A. V., Richter, C., Steffen, A., Jabs,
N., Funk, R. H., Brendel, M. D., Block, N. L., Ehrhart-Bornstein, M., y
Bornstein, S. R. (2010). Agonist of growth hormone-releasing hormone
as a potential effector for survival and proliferation of pancreatic islets.
Lhr, K., Mritz, C., Contente, A., y Dobbelstein, M. (2003).

p21/CDKN1A mediates negative regulation of transcription by p53. J
Biol Chem 278, 32507-32516.
Maga, G., y Hubscher, U. (2003). Proliferating cell nuclear antigen

(PCNA): a dancer with many partners. J Cell Sci 116, 3051-3060.
- 219 -
Makimura, H., Feldpausch, M. N., Rope, A. M., Hemphill, L. C.,

Torriani, M., Lee, H., y Grinspoon, S. K. (2012). Metabolic effects of a
growth hormone-releasing factor in obese subjects with reduced growth
hormone secretion: a randomized controlled trial. J Clin Endocrinol
Metab 97, 4769-4779.
Malvezzi, M., Bertuccio, P., Levi, F., La Vecchia, C., y Negri, E. (2014).
European cancer mortality predictions for the year 2014. Ann Oncol.
Martin, B., Lopez de Maturana, R., Brenneman, R., Walent, T., Mattson,
M. P., y Maudsley, S. (2005). Class II G protein-coupled receptors and
their ligands in neuronal function and protection. Neuromolecular Med
7, 3-36.
Mayo, K. E. (1992). Molecular cloning and expression of a pituitary-

specific receptor for growth hormone-releasing hormone. Mol
Endocrinol 6, 1734-1744.
Mayo, K. E., Miller, T., DeAlmeida, V., Godfrey, P., Zheng, J., y Cunha,
S. R. (2000). Regulation of the pituitary somatotroph cell by GHRH and
its receptor. Recent Prog Horm Res 55, 237-266.
Melosky, B. (2014). Review of EGFRTKIs in Metastatic NSCLC,

Including Ongoing Trials. Front Oncol 4, 244.
Meng, N., Li, Y., Zhang, H., y Sun, X. F. (2008). RECK, a novel matrix
metalloproteinase regulator. Histol Histopathol 23, 1003-1010.
Mira, E., Lacalle, R. A., Gonzlez, M. A., Gmez-Moutn, C., Abad, J. L.,
Bernad, A., Martnez-A, C., y Maes, S. (2001). A role for chemokine
receptor transactivation in growth factor signaling. EMBO Rep 2, 151-
156.
- 220 -
Mirzayans, R., Andrais, B., Scott, A., y Murray, D. (2012). New insights
into p53 signaling and cancer cell response to DNA damage: implications
for cancer therapy. J Biomed Biotechnol 2012, 170325.
Moldovan, G. L., Pfander, B., y Jentsch, S. (2007). PCNA, the maestro of

the replication fork. Cell 129, 665-679.
Moretti, C., Bagnato, A., Solan, N., Frajese, G., y Catt, K. J. (1990).
Receptor-mediated actions of growth hormone releasing factor on
granulosa cell differentiation. Endocrinology 127, 2117-2126.
Moretti, C., Mencacci, C., Frajese, G. V., Cerilli, M., y Frajese, G. (2002).
Growth hormone-releasing hormone and pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide in the reproductive system. Trends Endocrinol
Metab 13, 428-435.
Nelson, W. G., Demarzo, A. M., y Yegnasubramanian, S. (2014). The

diet as a cause of human prostate cancer. Cancer Treat Res 159, 51-68.
Niu, G., Wright, K. L., Ma, Y., Wright, G. M., Huang, M., Irby, R.,
Briggs, J., Karras, J., Cress, W. D., Pardoll, D., y col. (2005). Role of
Stat3 in regulating p53 expression and function. Mol Cell Biol 25, 7432-
7440.
O'Brian, C. A. (1998). Protein kinase C-alpha: a novel target for the

therapy of androgen-independent prostate cancer?. Oncol Rep 5, 305-
309.
Oertel, H. (1926). An Address on Involutionary Changes in Prostate and

Female Breast in Relation to Cancer Development. Can Med Assoc J 16,
237-241.
- 221 -
Onder, T. T., Gupta, P. B., Mani, S. A., Yang, J., Lander, E. S., y
Weinberg, R. A. (2008). Loss of E-cadherin promotes metastasis via
multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res 68, 3645-
3654.
Orsulic, S., Huber, O., Aberle, H., Arnold, S., y Kemler, R. (1999). E-
cadherin binding prevents beta-catenin nuclear localization and beta-
catenin/LEF-1-mediated transactivation. J Cell Sci 112, 1237-1245.
Ouyang, L., Shi, Z., Zhao, S., Wang, F. T., Zhou, T. T., Liu, B., y Bao, J.
K. (2012). Programmed cell death pathways in cancer: a review of
apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif 45, 487-498.
Paredes, J., Figueiredo, J., Albergaria, A., Oliveira, P., Carvalho, J.,
Ribeiro, A. S., Caldeira, J., Costa, A. M., Simes-Correia, J., Oliveira, M.
J., y col. (2012). Epithelial E- and P-cadherins: role and clinical
significance in cancer. Biochim Biophys Acta 1826, 297-311.
Prez-Sayns, M., Surez-Pearanda, J. M., Gayoso-Diz, P., Barros-

Angueira, F., Gndara-Rey, J. M., y Garca-Garca, A. (2013). The role of
p21Waf1/CIP1 as a Cip/Kip type cell-cycle regulator in oral squamous
cell carcinoma (Review). Med Oral Patol Oral Cir Bucal 18, e219-225.
Perletti, G., y Terrian, D. M. (2006). Distinctive cellular roles for novel

protein kinase C isoenzymes. Curr Pharm Des 12, 3117-3133.
Perras, B., Schultes, B., Schwaiger, R., Metz, C., Wesseler, W., Born, J.,
y Fehm, H. L. (2002). Growth hormone-releasing hormone facilitates
hypoglycemia-induced release of cortisol. Regul Pept 110, 85-91.
- 222 -
Peterfi, Z., McGinty, D., Sarai, E., y Szymusiak, R. (2010). Growth

hormone-releasing hormone activates sleep regulatory neurons of the rat
preoptic hypothalamus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298,
R147-156.
Petersenn, S., Rasch, A. C., Heyens, M., y Schulte, H. M. (1998).

Structure and regulation of the human growth hormone-releasing
hormone receptor gene. Mol Endocrinol 12, 233-247.
Pezzolo, A., Gimelli, G., Sposito, M., Giussani, U., Rossi, E., y Zuffardi,
O. (1994). Definitive assignment of the growth hormone-releasing factor
gene to 20q11.2. Hum Genet 93, 213-214.
Pombo, C. M., Zalvide, J., Gaylinn, B. D., y Diguez, C. (2000). Growth

hormone-releasing hormone stimulates mitogen-activated protein kinase.
Endocrinology 141, 2113-2119.
Posner, S. F., Vaslet, C. A., Jurofcik, M., Lee, A., Seidah, N. G., y Nillni,
E. A. (2004). Stepwise posttranslational processing of progrowth
hormone-releasing hormone (proGHRH) polypeptide by furin and PC1.
Endocrine 23, 199-213.
Pozsgai, E., Schally, A. V., Hocsak, E., Zarandi, M., Rick, F., y Bellyei, S.
(2011). The effect of a novel antagonist of growth hormone releasing
hormone on cell proliferation and on the key cell signaling pathways in
nine different breast cancer cell lines. Int J Oncol 39, 1025-1032.
Prager, G. W., Poettler, M., Unseld, M., y Zielinski, C. C. (2011).

Angiogenesis in cancer: anti-VEGF escape mechanisms. Translational
Lung Cancer Research 1, 14-25.
- 223 -
Pugh, T. J., Choi, S., Nguyen, Q. N., Gillin, M. T., Ron Zhu, X., Palmer,
M. B., y Lee, A. K. (2013). Proton beam therapy for the treatment of
prostate cancer. Pract Radiat Oncol 3, e87-e94.
Qi, Q. R., y Yang, Z. M. (2014). Regulation and function of signal

transducer and activator of transcription 3. World J Biol Chem 5, 231-
239.
Reichlin, S. (1961). Growth hormone content of pituitaries from rats

with hypothalamic lesions. Endocrinology 69, 225-230.
Rekasi, Z., Czompoly, T., Schally, A. V., y Halmos, G. (2000). Isolation

and sequencing of cDNAs for splice variants of growth hormone-
releasing hormone receptors from human cancers. Proc Natl Acad Sci U
S A 97, 10561-10566.
Rick, F. G., Schally, A. V., Szalontay, L., Block, N. L., Szepeshazi, K.,
Nadji, M., Zarandi, M., Hohla, F., Buchholz, S., y Seitz, S. (2012a).
Antagonists of growth hormone-releasing hormone inhibit growth of
androgen-independent prostate cancer through inactivation of ERK and
Akt kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 1655-1660.
Rick, F. G., Seitz, S., Schally, A. V., Szalontay, L., Krishan, A., Datz, C.,
Stadlmayr, A., Buchholz, S., Block, N. L., y Hohla, F. (2012b). GHRH
antagonist when combined with cytotoxic agents induces S-phase arrest
and additive growth inhibition of human colon cancer. Cell Cycle 11,
4203-4210.
- 224 -
Ripple, M. J., Parker Struckhoff, A., Trillo-Tinoco, J., Li, L., Margolin,
D. A., McGoey, R., y Valle, L. D. (2014). Activation of c-Myc and Cyclin
D1 by JCV T-Antigen and -Catenin in Colon Cancer. PLoS One 9,
e106257.
Rivier, J., Spiess, J., Thorner, M., y Vale, W. (1982). Characterization of

a growth hormone-releasing factor from a human pancreatic islet
tumour. Nature 300, 276-278.
Robberecht, P., Coy, D. H., Waelbroeck, M., Heiman, M. L., de Neef, P.,
Camus, J. C., y Christophe, J. (1985). Structural requirements for the
activation of rat anterior pituitary adenylate cyclase by growth hormone-
releasing factor (GRF): discovery of (N-Ac-Tyr1, D-Arg2)-GRF(1-29)-
NH2 as a GRF antagonist on membranes. Endocrinology 117, 1759-
1764.
Roskoski, R. (2014a). ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures

and small molecule inhibitors. Pharmacol Res 87, 42-59.
Roskoski, R. (2014b). The ErbB/HER family of protein-tyrosine kinases

and cancer. Pharmacol Res 79, 34-74.
Saraon, P., Jarvi, K., y Diamandis, E. P. (2011). Molecular alterations

during progression of prostate cancer to androgen independence. Clin
Chem 57, 1366-1375.
Sasaki, H., Kobayashi, Y., Nakashima, Y., Moriyama, S., Yukiue, H., Kaji,
M., Kiriyama, M., Fukai, I., Yamakawa, Y., y Fujii, Y. (2002). Beta IGH3,
a TGF-beta inducible gene, is overexpressed in lung cancer. Jpn J Clin
Oncol 32, 85-89.
- 225 -
Schally, A. V. (2008). New approaches to the therapy of various tumors

based on peptide analogues. Horm Metab Res 40, 315-322.
Schally, A. V., y Varga, J. L. (2006). Antagonists of growth hormone-

releasing hormone in oncology. Comb Chem High Throughput Screen 9,
163-170.
Schrder, F. H. (2008). Progress in understanding androgen-

independent prostate cancer (AIPC): a review of potential endocrine-
mediated mechanisms. Eur Urol 53, 1129-1137.
Schulz, S., y Rcken, C. (2006). Immunocytochemical localisation of

plasma membrane GHRH receptors in human tumours using a novel
anti-peptide antibody. Eur J Cancer 42, 2390-2396.
Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., y Jemal, A. (2014). Cancer statistics, 2014. CA
Cancer J Clin 64, 9-29.
Siejka, A., Schally, A. V., y Barabutis, N. (2010a). Activation of Janus

kinase/signal transducer and activator of transcription 3 pathway by
growth hormone-releasing hormone. Cell Mol Life Sci 67, 959-964.
Siejka, A., Schally, A. V., Block, N. L., y Barabutis, N. (2010b).

Antagonists of growth hormone-releasing hormone inhibit the
proliferation of human benign prostatic hyperplasia cells. Prostate 70,
1087-1093.
Siejka, A., Lawnicka, H., Komorowski, J., Stepien, T., Krupinski, R., y
Stepien, H. (2004). Effect of growth hormone-releasing hormone
(GHRH) and GHRH antagonist (MZ-4-71) on interferon-gamma
secretion from human peripheral blood mononuclear cells in vitro.
Neuropeptides 38, 35-39.
- 226 -
Siriwardana, G., Bradford, A., Coy, D., y Zeitler, P. (2006).

Autocrine/paracrine regulation of breast cancer cell proliferation by
growth hormone releasing hormone via Ras, Raf, and mitogen-activated
protein kinase. Mol Endocrinol 20, 2010-2019.
Sobin, L. H., y Compton, C. C. (2010). TNM seventh edition: what's

new, what's changed: communication from the International Union
Against Cancer and the American Joint Committee on Cancer. Cancer
116, 5336-5339.
Sotomayor, S., Carmena, M. J., Schally, A. V., Varga, J. L., Snchez-

Chapado, M., Prieto, J. C., y Bajo, A. M. (2007). Transactivation of HER2
by vasoactive intestinal peptide in experimental prostate cancer:
Antagonistic action of an analog of growth-hormone-releasing hormone.
Int J Oncol 31, 1223-1230.
Stangelberger, A., Schally, A. V., Rick, F. G., Varga, J. L., Baker, B.,
Zarandi, M., y Halmos, G. (2012). Inhibitory effects of antagonists of
growth hormone releasing hormone on experimental prostate cancers
are associated with upregulation of wild-type p53 and decrease in p21
and mutant p53 proteins. Prostate 72, 555-565.
Stangelberger, A., Schally, A. V., Varga, J. L., Hammann, B. D., Groot,

K., Halmos, G., Cai, R. Z., y Zarandi, M. (2005a). Antagonists of growth
hormone releasing hormone (GHRH) and of bombesin/gastrin releasing
peptide (BN/GRP) suppress the expression of VEGF, bFGF, and
receptors of the EGF/HER family in PC-3 and DU-145 human
androgen-independent prostate cancers. Prostate 64, 303-315.
- 227 -
Stangelberger, A., Schally, A. V., Varga, J. L., Zarandi, M., Cai, R. Z.,
Baker, B., Hammann, B. D., Armatis, P., y Kanashiro, C. A. (2005b).
Inhibition of human androgen-independent PC-3 and DU-145 prostate
cancers by antagonists of bombesin and growth hormone releasing
hormone is linked to PKC, MAPK and c-jun intracellular signalling. Eur
J Cancer 41, 2735-2744.
Stepien, T., Lawnicka, H., Komorowski, J., Stepien, H., y Siejka, A.

(2010). Growth hormone-releasing hormone stimulates the secretion of
interleukin 17 from human peripheral blood mononuclear cells in vitro.
Neuro Endocrinol Lett 31, 852-856.
Stepie, T., Sacewicz, M., Lawnicka, H., Krupiski, R., Komorowski, J.,
Siejka, A., y Stepie, H. (2009). Stimulatory effect of growth hormone-
releasing hormone (GHRH(1-29)NH2) on the proliferation, VEGF and
chromogranin A secretion by human neuroendocrine tumor cell line
NCI-H727 in vitro. Neuropeptides 43, 397-400.
Sun, J. (2010). Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of

metalloproteinases are essential for the inflammatory response in cancer
cells. J Signal Transduct 2010, 985132.
Sur, S., y Agrawal, D. K. (2014). Transactivation of EGFR by G protein-

coupled receptor in the pathophysiology of intimal hyperplasia. Curr
Vasc Pharmacol 12, 190-201.
Surcel, C. I., van Oort, I. M., Sooriakumaran, P., Briganti, A., De

Visschere, P. J., Ftterer, J. J., Ghadjar, P., Isbarn, H., Ost, P., van den
Bergh, R. C., y col. (2014). Prognostic effect of neuroendocrine
differentiation in prostate cancer: A critical review. Urol Oncol.
- 228 -
Szepeshazi, K., Schally, A. V., Groot, K., Armatis, P., Halmos, G.,
Herbert, F., Szende, B., Varga, J. L., y Zarandi, M. (2000a). Antagonists
of growth hormone-releasing hormone (GH-RH) inhibit IGF-II
production and growth of HT-29 human colon cancers. Br J Cancer 82,
1724-1731.
Szepeshazi, K., Schally, A. V., Groot, K., Armatis, P., Hebert, F., y
Halmos, G. (2000b). Antagonists of growth hormone-releasing hormone
(GH-RH) inhibit in vivo proliferation of experimental pancreatic cancers
and decrease IGF-II levels in tumours. Eur J Cancer 36, 128-136.
Tang, J., Lagac, G., Castagn, J., y Collu, R. (1995). Identification of

human growth hormone-releasing hormone receptor splicing variants. J
Clin Endocrinol Metab 80, 2381-2387.
Terry, S., y Beltran, H. (2014). The many faces of neuroendocrine

differentiation in prostate cancer progression. Front Oncol 4, 60.
Thakur, R., y Mishra, D. P. (2013). Pharmacological modulation of beta-

catenin and its applications in cancer therapy. J Cell Mol Med 17, 449-
456.
Thottassery, J. V., Zambetti, G. P., Arimori, K., Schuetz, E. G., y

Schuetz, J. D. (1997). p53-dependent regulation of MDR1 gene
expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc
Natl Acad Sci U S A 94, 11037-11042.
Tomayko, M. M., y Reynolds, C. P. (1989). Determination of

subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemother
Pharmacol 24, 148-154.
- 229 -
Valdehita, A., Bajo, A. M., Schally, A. V., Varga, J. L., Carmena, M. J., y
Prieto, J. C. (2009). Vasoactive intestinal peptide (VIP) induces
transactivation of EGFR and HER2 in human breast cancer cells. Mol
Cell Endocrinol 302, 41-48.
van de Wetering, M., Sancho, E., Verweij, C., de Lau, W., Oving, I.,
Hurlstone, A., van der Horn, K., Batlle, E., Coudreuse, D., Haramis, A. P.,
y col. (2002). The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt
progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell 111, 241-250.
Varga, J. L., Schally, A. V., Csernus, V. J., Zarndi, M., Halmos, G.,
Groot, K., y Rksi, Z. (1999). Synthesis and biological evaluation of
antagonists of growth hormone-releasing hormone with high and
protracted in vivo activities. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 692-697.
Wang, S. C. (2014). PCNA: a silent housekeeper or a potential

therapeutic target? Trends Pharmacol Sci 35, 178-186.
Way, T. D., y Lin, J. K. (2005). Role of HER2/HER3 co-receptor in

breast carcinogenesis. Future Oncol 1, 841-849.
Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., y Carmeliet, P. (2013). Recent

molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in
cancer. J Clin Invest 123, 3190-3200.
Wu, H. M., Schally, A. V., Cheng, J. C., Zarandi, M., Varga, J., y Leung,
P. C. (2010). Growth hormone-releasing hormone antagonist induces
apoptosis of human endometrial cancer cells through PKC-mediated
activation of p53/p21. Cancer Lett 298, 16-25.
- 230 -
Xu, J., Wu, S., y Shi, X. (2010). Expression of matrix metalloproteinase

regulator, RECK, and its clinical significance in osteosarcoma. J Orthop
Res 28, 1621-1625.
Yamanaka, M., Kimura, F., Kagata, Y., Kondoh, N., Asano, T.,
Yamamoto, M., y Hayakawa, M. (2008). BIGH3 is overexpressed in clear
cell renal cell carcinoma. Oncol Rep 19, 865-874.
Yano, S., Macleod, R. J., Chattopadhyay, N., Tfelt-Hansen, J., Kifor, O.,
Butters, R. R., y Brown, E. M. (2004). Calcium-sensing receptor
activation stimulates parathyroid hormone-related protein secretion in
prostate cancer cells: role of epidermal growth factor receptor
transactivation. Bone 35, 664-672.
Yao, D., Dai, C., y Peng, S. (2011). Mechanism of the mesenchymal-

epithelial transition and its relationship with metastatic tumor formation.
Mol Cancer Res 9, 1608-1620.
Yen, L., Benlimame, N., Nie, Z. R., Xiao, D., Wang, T., Al Moustafa, A.
E., Esumi, H., Milanini, J., Hynes, N. E., Pages, G., y Alaoui-Jamali, M.
A. (2002). Differential regulation of tumor angiogenesis by distinct ErbB
homo- and heterodimers. Mol Biol Cell 13, 4029-4044.
Zaczek, A., Brandt, B., y Bielawski, K. P. (2005). The diverse signaling

network of EGFR, HER2, HER3 and HER4 tyrosine kinase receptors
and the consequences for therapeutic approaches. Histol Histopathol 20,
1005-1015.
- 231 -
Zarandi, M., Horvath, J. E., Halmos, G., Pinski, J., Nagy, A., Groot, K.,
Rekasi, Z., y Schally, A. V. (1994). Synthesis and biological activities of
highly potent antagonists of growth hormone-releasing hormone. Proc
Natl Acad Sci U S A 91, 12298-12302.
Zeitler, P., y Siriwardana, G. (2000). Stimulation of mitogen-activated

protein kinase pathway in rat somatotrophs by growth hormone-
releasing hormone. Endocrine 12, 257-264.
Pginas Web consultadas:
Grant, K. (2014). Five maps that put cancer's global spread into focus.
Recuperado de www.theglobaeandmail.com.
U. S. N. L. o. Medicine, (2014). Prostate Diseases. Recuperado de

www.nlm.nih.gov/medlineplus/prostatediseases.html.
Woo, C. (2010). Hong Kong Urological Association. Recuperado de

www.hkua.org.
- 232 -
8. SUMMARY
Universidad de Alcal Summary
Prostate cancer (PC) is the second most common malignancy

worldwide, and one of the most common cancer-specific cause of mortality in
men. Therefore this disease represents a major international social, health and
economic problem. Currently, the treatment modalities for the disease in
localized tumour or androgen-dependent stage yield good results in most
patients. However, such treatments are only palliative in the advanced
androgen-independent stage. The main problem is that once PC has progressed
to androgen independence, cancer cells acquire invasive capability and
metastasize to lymph nodes and distant tissues, mainly bone tissue. Therefore,
research is needed to find new therapeutic targets and contribute to the design
of effective treatments.
Growth hormone releasing-hormone (GHRH) is a hypothalamic

peptide that has also been found in other extra-hypothalamic tissues (placenta,
ovary, gastrointestinal tract, neuroendocrine tissue, and testis) and in various
tumour malignancies (breast, prostate, lung, endometrium, ovary, kidney and
lymphomas). GHRH regulates the secretion of growth hormone (GH) at the
anterior pituitary after binding to its receptor p-GHRHR, which belongs to the
family of G protein-coupled receptors (GPCRs). GH stimulates the production
of insulin-like growth factor I (IGF-1), which plays a crucial role in the
progression of malignancy in various tumours. Moreover, 4 splice variants
(SVs) of pituitary GHRH receptor have been discovered. Among these
receptors, SV1 is the main SV that mediates the effect of GHRH and its
antagonists in tumour tissues. Since 1994, the group of Dr. A. V. Schally has
synthesized GHRH antagonists, for therapeutic use in the management of
various tumours. In vitro and in vivo studies have demonstrated that GHRH
antagonists suppress the growth of several experimental cancers.
In our study, we demonstrate the presence of GHRH in tumour and non-

tumour prostate cells, with a greater expression in more advanced stages of PC.
- 237 -
Summary Universidad de Alcal
Similarly, GHRH receptors are present in all prostate cell lines tested, with
increased expression of p-GHRHR in non-tumour cells and SVs in advanced
PC cells. Moreover, the expression of GHRH receptors was increased after
GHRH antagonists treatment in advanced PC cells.
Present results demonstrate that GHRH increases the viability and

proliferation in tumour and non-tumour prostate cells, and the expression of the
cell proliferation marker, PCNA. Conversely, GHRH antagonists inhibit the
viability and proliferation of these cell lines, and block the effect of GHRH on
these phenotypes. Additionally, GHRH helps to cycle progression and causes an
anti-apoptotic effect in advanced PC cells. These effects are produced by
decreasing the expression of p21, p53 and the ratio Bax/Bcl2. Treatment with
GHRH antagonists shows opposite results, causing an arrest cycle cell in S
stage and an activated apoptotic process, due to an increase in expression levels
of p21, p53 molecules and the ratio Bax/Bcl2
The start of the metastatic process is related to a loss of tumoral

adhesion (cell-cell or cell-extracellular matrix). Our results indicate that GHRH
reduces adhesion in tumour and non-tumour prostate cells, which activates the
first step of the metastatic phenotype. This activation is achieved by a reduction
in the E-cadherin levels and an increase of nuclear expression of -catenin, and
its target genes CD44, c-myc and cyclin D1. GHRH antagonists exert an
opposite effect on adhesion and expression of marker molecules.
When tumour cells lose their adhesive properties, they can degrade the
extracellular matrix to migrate and invade the vascular system and other
tissues. In this regard, migration capability and both expression and activation
levels of MMP9 and MMP2 were increased by GHRH in non-tumour and
tumour cells. Furthermore, GHRH increased proangiogenic factor VEGF levels
in advanced PC cells. Conversely, GHRH antagonists reduced the migration
ability of cells, and the expression and activity levels of MMPs and VEGF.
- 238 -
Universidad de Alcal Summary
Neuroendocrine differentiation promotes tumour progression and

evolution of PC towards androgen independence stage. GHRH causes
neuroendocrine differentiation in androgen-dependent PC cells, and this effect is
blocked by GHRH antagonists.
In vivo assays have shown that GHRH is an agent that transform non-
tumour prostate cells into tumour prostate cells, and these cells can induce a
tumour in experimental animals. Furthermore, we have observed a significant
reduction of PC tumour in the groups treated with GHRH antagonists. In this
regard, we have been found that GHRH antagonists modulate molecules
involved in tumour progression, exerting pro-apoptotic, anti-mitogenic, anti-
angiogenic, anti-migration and anti-invasive effects.
The EGFR pathway is one of the most important signalling cascades

involved in PC progression. In our study, we found that GHRH transactivates
EGFR and HER2 receptors in advanced PC cells. This transactivation was
early or ligand-independent through PKA and Src; and late or ligand-
dependent by the action of metalloproteinases such as ADAM17. In addition,
we found that EGFR and HER2 transactivation produced by GHRH is partly
responsible for the effects exerted by the hormone on cell adhesion, migration
and angiogenesis. These relevant results led us to perform in vivo assays to test
the effect of the GHRH antagonist, MIA-690, EGFR inhibitor, Gefitinib, and
combined treatment with both agents. Combined therapy improves the
reduction of the tumour size and diminishes the presence of metastatic foci.
The results of this study support GHRH as a potential therapeutic target

for PC, due to the important modulation of molecules and signalling pathways
that induce the progression of PC. In this regard, GHRH antagonists, alone or
in combination with other compounds, could be considered for the development
of new therapies for advanced prostate cancer.
- 239 -
9. PRODUCCIN CIENTFICA
Universidad de Alcal Produccin cientfica
El resultado de esta Tesis Doctoral ha permitido la publicacin de las

siguientes publicaciones internacionales y captulos de libro nacionales:
Muoz-Moreno L, Arenas MI, Carmena MJ, Schally AV, Prieto JC, Bajo
AM. New insights into the inhibitory action of antagonists of growth hormone-
releasing hormone in androgen-independent prostate cancer tumors. (2014)
Mol Cell Endocrinol. (Enviado)
Muoz-Moreno L, Prieto JC, Carmena MJ y Bajo AM. Transactivacin

de EGFR y HER2 inducida por la hormona liberadora de la hormona del
crecimiento (GHRH) en cncer de prstata avanzado. (2014)
Libro: V Jornadas de Jvenes Investigadores de la Universidad de Alcal.
(Aceptado)
Muoz-Moreno L, Arenas MI, Carmena MJ, Schally AV, Prieto JC, Bajo
AM. Growth hormone-releasing hormone antagonists abolish the
transactivation of human epidermal growth factor receptors in advanced
prostate cancer models. (2014) Invest New Drugs. 32: 871-882
Muoz-Moreno L, Arenas MI, Schally AV, Fernndez-Martnez AB,

Zarka E, Gonzlez-Santander M, Carmena MJ, Vacas E, Prieto JC, Bajo
AM. Inhibitory effects of antagonists of growth hormone-releasing hormone on
growth and invasiveness of PC3 human prostate cancer. (2013) Int J Cancer.
132:755-765
- 243 -
Produccin cientfica Universidad de Alcal
Muoz-Moreno L, Prieto JC y Bajo AM. Efecto de los antagonistas de la

hormona liberadora de la hormona del crecimiento, JMR-132 y JV-1-38, en
modelos experimentales de cncer de prstata. (2013) Vol.1. Pgs. 389-397
Libro: IV Jornadas de Jvenes Investigadores de la Universidad de
Alcal. I.S.B.N.:978-84-15834-15-1.
Igualmente durante la realizacin de esta Tesis Docotral he contribuido

activamente con otras lneas de investigacin. Fruto de ello es la publicacin de
varios artculos internacionales y la presentacin de una patente a nivel
nacional:
Benabdelouahab Y, Muoz-Moreno L, Frik M, de la Cueva-Alique I, El

Amrani MA, Contel M, Bajo AM, Cuenca T, Royo E. Self-aggregation and
anticancer properties of water soluble p-cymene Ru(II) compounds with chiral
amino-oxime ligands derived from R-limonene. (2014) Organometallics.
(Enviado)
Vacas E, Muoz-Moreno L, Fernndez-Martnez AB, Bajo AM,

Snchez-Chapado M, Prieto JC, Carmena MJ. Signalling pathways involved
in antitumoral effects of VIP in human renal cell carcinoma A498 cells: VIP
induction of p53 expression. (2014) Int J Biochem Cell Biol Cancer. 53: 295-
301
Vacas E, Arenas MI, Muoz-Moreno L, Bajo AM, Snchez-Chapado M,

Prieto JC, Carmena MJ. Antitumoral effects of vasoactive intestinal peptide in
human renal cell carcinoma xenografts in athymic nude mice. (2013) Cancer
Letters. 336: 296-303
- 244 -
Universidad de Alcal Produccin cientfica
Sotomayor S, Muoz-Moreno L, Carmena MJ, Schally AV, Snchez-

Chapado M, Prieto JC, Bajo AM. Regulation of HER expression and
transactivation in human prostate cancer cells by a targeted cytotoxic bombesin
analog (AN-215) and a bombesin antagonist (RC-3095) (2010) Int J Cancer.
127: 1813-1822
Patente Nacional. Complejos areno de Ru(II) con ligandos oxima con

actividad anticancergena
Inventores: Universidad de Alcal, Universit Abdelmalek Essaadi,
Laura Muoz Moreno, Eva Royo Cantalabrana, Ana Mara Bajo
Chueca, Toms Cuenca Agreda, Yosra Benabdelaouahab.
N. de solicitud: P201300949 Fecha de prioridad: 10/10/2013
Pas de prioridad: Espaa (En revisin)
- 245 -
10. FINANCIACIN
Universidad de Alcal Financiacin
Esta Tesis Doctoral se ha realizado gracias a la financiacin de

organismos pblicos, a travs de los proyectos que se detallan a continuacin:
Efecto del antagonista de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento

(GHRH), JMR-132, en la progresin hacia la metstasis sea del cncer de
prstata. CCG08/UAH/BIO-3782
Comunidad de Madrid/Universidad de Alcal. 21.093 euros
Investigador principal: Ana M. Bajo Chueca
Efecto de antagonistas de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento

(GHRH), en la progresin del cncer de prstata. PPII10-0189-3222
Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha. 65.000 euros
Programa de Incentivacin de la Incorporacin e Intensificacin de la Actividad

Investigadora (PI3)-Financiacin I3.
MEC/Universidad de Alcal. 39.000 euros
Efectos de los nuevos antagonistas de la hormona liberadora de la hormona de

crecimiento (GHRH) en la progresin del cncer de mama. Efecto de los
antagonistas en el cncer de mama triple negativo. FIB-PI13-04
Fundacin de Investigacin del Hospital Universitario Prncipe de
Asturias. 4.000 euros.
Durante la realizacin de esta Tesis Doctoral he disfrutado de una beca

de Formacin del Profesorado universitario (FPU) de la Universidad de
Alcal.
- 249 -

Tesis Laura Muñoz

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Tesis Laura Muñoz

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

Programa de Doctorado en Sealizacin Celular

Tesis Doctoral presentada por

LAURA MUOZ MORENO

Tesis Doctoral presentada por

LAURA MUOZ MORENO

DRA. ANA MARA BAJO CHUECA

DRA. MARA JOS CARMENA SIERRA

Alcal de Henares, 2014

ANA MARA BAJO CHUECA y MARA JOS CARMENA SIERRA

Que el trabajo presentado por Laura Muoz Moreno, titulado HORMONA

Dra. Ana M Bajo Chueca Dra. M Jos Carmena Sierra

ANTONIO JIMNEZ RUIZ, como Director del Departamento de Biologa de

Que Tesis Doctoral que lleva como ttulo: HORMONA LIBERADORA DE

Dr. Antonio Jimnez Ruiz

No poda comenzar sin agradecer a Juan Carlos por acogerme en su laboratorio,

de autgrafosHe aprendido muchsimo de ti durante estos aos.

Todava recuerdo el primer momento que llegu al laboratorio para

entrevistarme con m, ahora, Directora de Tesis, Ana Bajo, por intermediacin de mi

apoyo, por escucharme y ayudarme a nivel personal.

Como olvidarme de mi querida Co-directora Maria Jos, tantos aos planificando

experimentos, proyectos y congresos, inventndonos que hacer, y pelendonos con cada

resultara ms sencillo, buscando soluciones increibles a cada problema. Ahora me toca

darme alguna oportunidad como docente, no cambies nunca, eres increble!

siempre juntas, peleando por hacernos un hueco en el maravilloso mundo de la

nombramiento como profesora titular, porque te lo mereces, pero prometo no equivocarme

posible, siempre me han dado todo lo que necesitaba, gracias!.

Too, mi farmacutico particular, eres un to increble de verdad, no olvidar esas

estos aos tendr una gran recompensa.

Mis antecesorasValdehita, he tenido la suerte de disfrutar de ti durante unos

meses, y de esas charlas y consejos a la hora de la comida, ojal se vuelvan a repetir, te

Prietas que ltimamente est complicado. A mis posibles predecesorasBea, Isabel y

Mali, Pablo, Ester, Carmen

Agradecer la compaa en esas eternas prcticas de los tcnicos Miguel y Luis, a

A todos los profesores del departamento, en especial a Eduardo y Miguel ngel

las chicas de la academia, que me han acompaado durante estos aos.

especialmente a mis peques que adoro, Diego y Martita.

-SMA: Actina de msculo liso EGFR: Receptor del factor de crecimiento

HGPIN: Neoplasia prosttica intraepitelial de OMS: Organizacin Mundial de la Salud

SVs: Variantes de splicing

1.1.6.3 Dependencia/Independencia andrognica... 16

3.2.2.9 Aislamiento de membranas y ncleos.. 90

4.2 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en procesos implicados en la

4.2.1 Viabilidad celular y citotoxicidad..101

4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la

4.2.2.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la.expresin de

4.2.3 Ciclo celular y apoptosis en PC3... 110

4.2.4 Adhesin celular.... 115

4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de.

4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de

4.2.4.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresin de,

4.2.5 Migracin celular..... 126

4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivacin de EGFR

4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activacin

4.3.3.3 Implicacin de las metaloproteasas en la transactivacin

4.3.3.5 Implicacin de la transactivacin de EGFR y HER2

4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidrmico, EGF, sobre

4.4 Estudio del efecto los antagonistas de GHRH en un modelo

4.4.1 Efecto de JMR-132 y JV-1-38 en el crecimiento de tumores

4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad. 153

4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad. 171

En 1853, J. Adams, un cirujano ingls realiza la primera descripcin del

1.1 CNCER DE PRSTATA

La prstata es una glndula del aparato reproductor masculino que aporta

Zona anterior: exclusivamente fibromuscular.