HEMAGLUTINACINVIRALE

PRCTICA
NMERO2
INHIBICINDELAHEMAGLUTINACIN

VIRAL

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influenza tipo B y por la influenza tipo C

INTRODUCCIN (la cual puede no ser un virus de la
influenza verdadero si nos ajustamos a
Actualmente esta tcnica se sigue criterios bioqumicos estrictos).
usando para poder determinar la
potencia de vacunas, de virus que tiene
hemaglutinina que de forma
espontnea se unen a eritrocitos, como
son Sarampin, Parainfluenza viral, e
Influenza A1HN1 entre otros, de ah la
importancia que los alumnos de QFB
de las orientaciones de Farmacia
Industrial, Farmacia Hospitalaria y Influenza viral tpica zoonosis.
Bioqumica Clnica las conozcan y
manejen. Los tres tipos de virus de la influenza A,
B y C, se diferencian por antgenos
internos especficos de tipo, las
nucleoprotenas (NP) y por protena M
de la membrana. Los antgenos
especficos de cepa o subtipos se
presentan en la superficie externa; la
hemaglutinina (HA) y la
neuroaminidasa (NA) para la influenza
A y B y una simple glicoprotena (HEP)
para la influenza C, como se ve en la
siguiente figura.
La influenza viral es una tpica
zoonosis, es decir que la transmisin
es de los animales al humano, es una
enfermedad cuyo curso clnico tpico,
comienza con fiebre abrupta,
escalofro, seguido de fatiga, cefalea y
mialgias. La recuperacin de casos no
complicados es de 3 a 4 das de
iniciados los sntomas. Sin embargo la
debilidad y fatiga pueden persistir por Estructura del virus de la influenza
varias semanas. El virus de la influenza (antgenos presentes).
tipo A causa la ms severa enfermedad
en los humanos, seguida por la

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Mediante pruebas serolgicas se conteniendo cido silico que pueden

puede establecer el tipo y subtipo de ser eliminadas del suero mediante la
virus de la influenza que provoca la enzima de Vibrio cholerae que
infeccin, sin embargo la determinacin destruyen el receptor o bien tratando el
de anticuerpos en una simple muestra suero con peryodato de potasio (KIO4)
no nos indica necesariamente una En sta prctica se sustituir el virus de
infeccin reciente, a menos que se la influenza por el virus Newcastle que
trate de un subtipo de virus que tambin tiene la capacidad de aglutinar
aparece por primera vez. glbulos rojos y que es incuo al
Para establecer el diagnstico humano.
serolgico de enfermedad reciente se
requiere medir los ttulos de
anticuerpos en sueros pareados con
intervalos dentro de la primera muestra
y la segunda de al menos 2 3
semanas.
Las pruebas serolgicas ms usadas
para establecer el diagnstico de
influenza son las pruebas de fijacin de
complemento (FC) y la de inhibicin de
la hemaglutinacin (HI), sta ltima Estructura del virus New castle.
prueba se basa en la capacidad que
tiene el virus de aglutinar eritrocitos y la
capacidad de un anticuerpo especfico
anti HA para inhibir esta aglutinacin.
Dentro de las ventajas que tiene la
prueba de HI en relacin a la FC, estn
el que es ms rpida, fcil de hacer y
que nos determina subtipos de virus,
mientras que su desventaja mayor es
que existen inhibidores no especficos
en las muestras de suero.

Por lo tanto, requerimos de

tratamientos efectivos de los sueros
para no tener reacciones falsas Replicacin de un bacterifago
positivas. Algunos de los inhibidores en
el suero pueden ser mucoprotenas

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OBJETIVOS:
1. Aprender el correcto manejo de la tcnica de micro hemaglutinacin viral
(HA).
2. Hacer la titulacin del virus mediante la tcnica de microaglutinacin viral.
3. Determinar el ttulo de anticuerpos anti HA mediante la prueba de
inhibicin de la hemaglutinacin (HI).

MATERIAL POR EQUIPO:

9 Virus del Newcastle cepa vacunal. Se debe manejar con cuidado pues
puede producir conjuntivitis viral leve.
9 Amortiguador de solucin salina fosfatos (PBS), 250 mL.
9 Suspensin de eritrocitos de pollo al 0.5% en solucin de PBS.
9 Suero de conejo anti virus del Newcastle, tratado con KIO4, 0.5 mL.
9 Una placa de microhemaglutinacin.
9 Una micropipeta tipo Ependorf de 20 a 100 L.

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a temperatura de 4 C o a
temperatura ambiente.
MTODO
6. Leer la aglutinacin como se
observa en la siguiente figura.
Prueba de hemaglutinacin viral
(HA).
1. Coloque en los 12 pozos 0.05 mL de
PBS (diluyente), usando una
micropipeta Ependorf (el proceso se
realiza por duplicado en las lneas A
y B de la placa de microtitulacin de
policarbonato).
Hemaaglutinacion viral.
2. Coloque en el pozo nmero 1 de la
lnea A y B, la cantidad de 0.05 mL
de la suspensin de virus a titular, Prueba de la inhibicin de la
con una micropipeta tipo Ependorf, y hemaglutinacin viral (HI).
con la misma pipeta mezcla en el
pozo y 0.05 mL al siguiente pozo
siguiendo este procedimiento hasta 1. Coloque en los 12 pozos 0.025 mL
el pozo 11, del cual tome 0.05 mL y de PBS (diluyente), usando una
se deschelos. micropipeta tipo Ependorf (el
proceso se realiza por duplicado en
3. En el pozo 12 se queda slo con
las lneas D y E de la placa de
0.05 mL de PBS el testigo de la
microtitulacin de policarbonato).
prueba en las lneas A y B de la
placa. 2. Coloque en el pozo nmero 1 de las
lneas D y E, la cantidad de 0.025
4. Los eritrocitos de pollo conservados
mL del suero de conejo antivirus de
en alsever, se lavan con solucin de
Newcastle a probar, con una
PBS por centrifugacin a 2000 rpm
micropipeta tipo Ependorf, y con la
durante cinco minutos, repita el
misma pipeta se mezcla en el pozo y
lavado hasta obtener un
se pasan 0.025 mL al siguiente pozo
sobrenadante claro, el cual se
siguiendo este procedimiento hasta
desecha. Del paquete globular
el pozo 11, de este pozo tome 0.025
realice la dilucin al 0.5% en PBS.
mL y deseche.
5. Adicione a todos los pozos de las
3. En el pozo 12 le queda slo con
lneas A y B de la placa 0.05 mL de
0.025 mL de PBS y es el testigo de
los glbulos rojos de pollo al 0.5%,
la prueba en la lnea D y E de la
mezcle bien e incube por 15 minutos
placa.

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4. Adicione a todos los pozos 4 hemaglutinacin y tenemos una unidad

unidades hemaglutinantes (HAU) de inhibidora de la hemaglutinacin en ese
virus de Newcastle en un volumen volumen de 0.025 mL, para este
de 0.025 mL, usando una ejemplo es la dilucin 1:64 que se
micropipeta tipo Ependorf. muestra en los pozos 6 de la lneas D y
5. Mezcle bien e incube a temperatura E; que corresponde a 64X4=256
ambiente durante 15 minutos. unidades de inhibicin de la
hemaglutinacin/mL de suero
6. Adicione 0.05 mL de glbulos rojos empleado.
de pollo al 0.5%, agitar e incube a
temperatura ambiente durante 15
minutos.
7. Lea el ttulo hasta donde se inhibe la
hemaglutinacin.

Interpretacin de resultados

Para la prueba HA; la dilucin ms alta

del virus que causa una aglutinacin
completa es considerada el ttulo final y
tenemos una unidad hemaglutinante en
ese volumen de suspensin viral, como
se puede observar en la dilucin de la
lnea A corresponde a 1:64 que es el
pozo 6. En la parte superior se observa la
Para considerar a qu concentracin se reaccin de hemaglutinacin viral
usar el virus para la prueba de (pozos del 1 al 12 de las lneas A y B) y
inhibicin de la hemaglutinacin, para en la parte inferior se observa la
este ejemplo recorra la lectura en reaccin de la inhibicin de la
sentido inverso, ya que en el pozo 6 hemaglutinacin viral (de los pozos 1 a
que corresponde a una dilucin 1:64 se 12 de las lneas E y F) con virus de
observa an aglutinacin, en el pozo 5 Newcastle y suero de conejo antivirus
una dilucin 1:32 y finalmente en el de Newcastle.
pozo 4 una dilucin 1:16 que
corresponde a las cuatro unidades
hemaglutinantes que se requieren para
la siguiente prueba.
Para la prueba HI; el ttulo se define
como el factor de dilucin ms elevada
del suero que inhibe completamente la

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Prueba de la inhibicin de la
hemaglutinacin viral (HI).
DIAGRAMA DE FLUJO
Colocar 0.025 mL
Prueba de hemaglutinacin viral
de PBS en los
(HA).
pozos de las lneas

Colocar 0.05 mL de
PBS en los pozos
de las lneas A y B.
Colocar 0.025 mL del suero de
conejo antivirus en el pozo 1
de las lneas D y E. mezclar
con ayuda de la pipeta.
Colocar 0.05 mL de
suspensin viral en el
pozo 1de las lneas A y
B. mezclar con ayuda
de la pipeta. Pasar 0.025 mL de la mezcla
del pozo 1 al pozo 2, repetir
hasta el pozo 11, tomar 0.025
mL de este pozo y desechar.

Tomar 0.05 mL de
suspensin viral del pozo
1de las lneas A y B. y
adicionar al pozo 2, con Adicionar a todos los pozos
ayuda de la misma pipeta 0.025 mL de unidades
repita esto hasta el pozo hemaglutinantes de virus
numero 11. Desechar 0.05 newcastle.
mL de este pozo.

gvv
Lavar eritrocitos de pollo y
adicionarlos a todos los
pozos de las lneas A y B e
incube a temperatura de
4C o a temperatura
ambiente. Leer resultados.
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Incube a temperatura
ambiente. Y adicione 0.05 mL
de eritrocitos de pollo agitar e
incubar durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Leer
resultados.
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4. Rota PA, Regnery HC, Kendal AP.

Influenza viruses. In Rose NR,
CUESTIONARIO Friedman H, Fahey Jl et al. (Eds.):
Manual clinical immunology. 4a. Ed.
Washinton D.C.: American Society
1. Qu tipo de enfermedades vrales For Microbiology; 1992: 576- 581.
son imposibles de diagnosticar por
medio de la tcnica de inhibicin de la
hemaglutinacin?
2. Qu precauciones se debe tener
con la realizacin de la tcnica de
inhibicin de la hemaglutinacin?
3. Con qu otra tcnica inmunolgica
se puede suplir la tcnica de inhibicin
de la hemaglutinacin?

REFERENCIAS

1. Stuart-Harris C, Shild G, Oxford J.

Influenza: the viruses and the
disease, 2a Ed. Editorial Arnold
London; 1985.
2. Kendal P, Cate TR. Increases
sensitivity and reduced specificity of
hemagglutination inhibition tests with
ether treated influenza b/
Singapore/222/79 J Clin Microbiol.
1983; 18: 930-934.
3. Harmon M, Rota P, Walls H, Kendal
A. Antibody responses in human to
influenza type b host cell derived
variant following vaccination with
standard (eggs-derivaded) vaccine
or natural infection. J Clin Microbiol
1988;26: 333-337.

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