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Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el mismo
principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria y una fase
mvil.
Se clasifican en:
Cromatografa plana.- La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un
papel. Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel.
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el
fluido empleado como fase mvil se distinguen:
Cromatografa de lquidos.
Cromatografa de gases .
Cromatografa de fluidos supercrticos.
La cromatografa de gases.- es til para gases o para compuestos relativamente voltiles,
lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin.
OBJETIVOS
FASES DE LA CROMATOGRAFA:
FASE LIGADA.-Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas
de soporte o a la pared interior de la columna. (Lugar donde se produce la
separacin).
FASE MVIL.- Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una
direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas
(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido
Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador
para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil
la expresin Eluyente.
Cromatografa de Adsorcin (lquido - slido o cromatografa de fases
normales).
Cromatografa de Reparto (o lquido - lquido), se basa en las
caractersticas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase
mvil y una fase estacionaria de un lquido no polar. La fase lquida
se impregna a un soporte inerte de slice o, en el caso de
cromatografa de fase invertida, se une qumicamente.
Cromatografa de Intercambio inico.
Cromatografa de Exclusin.
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:
Cromatografa plana:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina (TLC)
Cromatografa en columna:
Cromatografa de gases (GC)
Cromatografa lquida (LC), pueden ser:
Se realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina o en capa delgada
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rgido.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL:
Las partculas de fase estacionaria solida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria liquida
pueden llenar por completo el tubo (columna empaquetadora) o estar concentradas sobre o a lo
largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil
por el centro del tubo (columna tubular abierta).
2. DE ACUERDO CON EL ESTADO FSICO DE LAS FASES:
CROMATOGRAFIA DE GASES.
Para esta tcnica se utiliza un cromatgrafo de gases el cual volatiliza e inyecta los gases dentro
de una columna.
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que
contiene a la fase fija. La separacin cromatografa en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria.
Cromatografa lquida de alta presin o de alta eficacia (cuando se emplean partculas de fase
estacionaria muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta).
3. De acuerdo con el mecanismo de separacin:
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION.
Donde la separacin se basa en las diferentes solubilidades de los componentes que conforman la
mezcla en las distintas fases estacionarias, y mviles, que en este caso, son ambas lquidas.
Cuando la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil, esta se llamar cromatografa en
fase inversa.
La fase estacionaria es un slido que tiene anclados distintos grupos funcionales fijos ionizables,
cuyas cargas se encuentran contrabalanceadas por distintos iones mviles que pueden ser
intercambiados por los iones presentes en la fase mvil.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION.
Ejemplos: para la separacin de protenas y polisacridos se usan como F.E. polmeros lineales
entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los ms comunes son dextranos
(marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos
materiales, en forma de pequeas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones
acuosas, generando un retculo o matriz tridimensional, con poros de tamao definido.
Aplicaciones:
Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas cromatografas).
Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la movilidad en la
columna de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea para determinar masas
moleculares.
Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra proteica (ejemplo,
las sales inorgnicas en un desalado de la muestra, eliminacin del exceso de reactivos
tras tratar una protena en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos). El
resultado es similar a una dilisis, pero ms rpido.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.
F.E.: un soporte inerte (micro esferas de vidrio o plstico, gel de agarosa) al que se une
covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de
una enzima, anticuerpo, antgeno, heptano, sustancia transportada, hormona, oligosacridos,
lectinas (protenas con afinidad por oligosacridos).
CROMATOGRAFIA BIDIMENCIONAL.
Es una variante de considerable poder de separacin, ya que se emplean dos diferentes solventes
aplicados secuencialmente para desplazar un solo compuesto.
La gota del compuesto (generalmente un aminocido o un pptido) se revela como una mancha
en papel. Y el material revelador es usualmente ninhidrina o permanganato de potasio.
4. Mtodos de anlisis:
CROMATOGRAFIA DE ELUCION:
Procedimiento en el que la fase mvil pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho
cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea
cantidad en un tiempo breve. Esta tcnica presenta la desventaja de que los componentes con
retenciones muy altas puedan no ser observados.
CROMATOGRAFIA FRONTAL:
INTRODUCCION
La cromatografa es una tcnica analtica muy especfica en la que una mezcla de componentes es
separada aprovechando la reparticin diferencial de los mismos entre dos fases: una mvil y otra
estacionaria. La fase mvil puede ser un gas o un lquido, mientras que la fase estacionaria, est
constituida por un slido o un lquido (unido a una base slida). Tras su separacin, los distintos
analitos se pueden identificar mediante un revelado en el caso de la cromatografa en capa fina o
bien mediante un detector acoplado a la salida de los sistemas cromatogrfico lquidos o gaseosos.
CROMATOGRAFA DE LABORATORIO
1. Adsorcin
2. Reparto
3. Intercambio inico
4. Exclusin molecular
5. Afinidad
APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFIA
B. Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados estn: los
hidrocarburos aromticos, BTEX, pesticidas rgano-clorados y rgano-fosforados en muestras
de aguas superficiales, subterrneas, suelos y lodos.
Asesoramiento en el desarrollo de
mtodos cromatogrfico.
Sntesis de nuevos solventes para la
extraccin selectiva de contaminantes
orgnicos
Implementacin de mtodos analticos
para determinar compuestos orgnicos
de inters ambiental en distintas
muestras de aguas, sedimentos y lodos
Determinacin de compuestos de
inters farmacolgico en tejidos de
origen animal
Imparticin de cursos Servicios
analticos, para la investigacin y al desarrollo, en el mbito del anlisis radio-qumico
ambiental (URAIS: Unidad Radioqumica Ambiental y Sanitaria)
Anlisis de parmetros radioactivos segn la Normativa 98/83/EC, relativa a los requisitos
sanitarios de la calidad de las aguas para el consumo humano
Anlisis de diferentes istopos radioactivos en productos alimenticios de acuerdo con la
normativa en vigor.
Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge el sistema de
deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se utiliza un detector
que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez contenga una base de
datos que pueda realizar su comparacin con una biblioteca de espectros se podra, de una forma
muy precisa, establecer la identidad de los componentes de una muestra, de hecho esto se logra
fcilmente con cromatografas que contienen sistema de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de
Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos
sistemas son muy costosos, es por ello que la mayora de los laboratorios cuentan con
cromatografas con sistemas de deteccin sencillos como el detector de ionizacin a la llama
(siglas en ingls, FID) o el detector de conductividad trmica (siglas en ingls (TCD) en el caso de
cromatografa de gases o detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos de
cromatografa de lquidos. La nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es
el tiempo de retencin del analitos, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones
cromatogrficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o
composicin qumica de la fase mvil adems de las otras variables mencionadas anteriormente
para el caso de cromatografa de liquida, adems de que se debe tener conocimiento de los
posibles compuestos de la muestra y una amplia variedad de patrones para realizar
comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo
de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto que, a partir de cromatograma
obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa liquida) y estacionarias y a diversas
temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa), se puede obtener datos adicionales.
CONCLUSIONES.
C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Arhen. Prentice Hall, Pearson. Bioqumica. (3 Ed.).
Educacion, Madrid. (2002).
Linda Amrica Serrano Falcon. Apuntes qumica cromatografa [En lnea] Sitio de
estudiantes y docentes universitarios Copyright 1999-2001
<http://www.lafacu.com/apuntes/quimica/cromatografia/default/.htm.>