SEPARACION DE FOSFOLIPIDOS POR CROMATOGRAFIA

EN CAPA FINA Y DETERMINACION DE COLESTEROL EN

YEMA DE HUEVO

INTRODUCCION

Los lpidos son un grupo heterogneo de compuestos,

insolubles en agua y solubles en solventes no polares,
se clasifican en:

Simples: derivados del isopreno y no son

saponificables, entre ellos se encuentra el
colesterol, hormonas sexuales, vitaminas.
Complejos contienen: cidos grasos saponifica-
IMAGEN 1. Revelado con reactivos especficos para grupos fosfato
bles y se dividen en triacilglicridos, esfingol- de fosfolpidos: Molibdato, Bismuto, Ninhidrina, Yodo. (De izquierda
pidos, fosfoacilglicridos y ceras. a derecha)

Los lpidos simples se dividen en: Terpenos, estos se

encuentran en animales y plantas y tienen estructura de Determinacin de colesterol
diisopreno, triisopreno, etc. Prostaglandinas, considera-
das reguladoras de la actividad hormonal, son cidos Ejemplo de clculos:
carboxlicos de 20 tomos de carbono, que contienen un
Tubo 1
anillo ciclopentano, grupos oxidrilo, uno o ms dobles
enlaces. Los esteroides son derivados de alcoholes 80g (0.25 mL)
g = = 20 g
cclicos de peso molecular elevado. 1

Colesterol en yema de huevo

El colesterol es el esterol ms comn y es un
compuesto clave en la sntesis de cidos biliares, 26.79g (1200L)
= 6,429.6 g
hormonas sexuales, hormonas corticosuprarrenales y 5
vitamina D.
Tubo Absorbancia g Colesterol
OBJETIVOS 1 0.088 20
2 0.181 40
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina 3 0.252 60
para la separacin de los fosfolpidos en la 4 0.354 80
yema de huevo. 5 0.437 100
Discutir las ventajas de la tcnica de separacin Pb 0.119 26.79
respecto a la cromatografa en papel. TABLA 2: Absorbancias y mg de colesterol del experimento.
Determinar la concentracin de colesterol en la
yema de huevo, por el mtodo de Lieberman-
Burchard. 0.5

0.4
RESULTADOS
ABSORBANCIA

0.3
y = 0.0044x + 0.0011
Cromatografa en capa fina
0.2
Reactivo Resultado Rf obtenido 0.1
Molibdato + 0.64
0
Bismuto + 0.60
0 20 40 60 80 100 120
Ninhidrina + 0.68
MICROGRAMOS DE COLESTEROL
Cristales de yodo + 0.53
TABLA 1: Resultados de revelacin con reactivos especficos para
fosfolpidos. GRAFICA 1: Absorbancia vs g de Colesterol 1
DISCUSIONES
Cromatografa en capa fina
Se separaron diferentes fosfolpidos de una yema de
huevo, esto con una solucin no polar de cloroformo-
metanol, ya que los fosfolpidos son solubles en
soluciones no polares. Posteriormente adicionamos KCl
y agitamos, de inmediato se dej reposar para la
formacin de 2 fases, en la fase orgnica (inferior) se
encuentra la parte polar del lpido, mientras que la fase
acuosa (superior) se encuentra la parte no polar (el
grupo fosfato). Despus utilizamos la fase orgnica para
la separacin cromatogrfica.
Se aplicaron muestras en cuatro cromatogramas
diferentes, posteriormente se introdujeron en la cmara
de cromatografa y se utiliz como fase mvil una
mezcla de cloroformo-metanol-cido actico-agua. Ms
tarde se revelaron los cromatogramas con diferentes
reactivos (tabla 1):
La prueba de Molibdato da positiva (imagen 1) en la
revelacin del cromatograma, ya que se observaron
manchas azules, y esto nos indica que hay presencia de
fosfolpidos en la yema de huevo.
La prueba de Bismuto da positiva (imagen 1), ya que se
observaron en el cromatograma manchas amarillo-
naranjas que comprueban la presencia de colina en
fosfolpidos.
La prueba de ninhidrina indica la presencia de
fosfolpidos que contienen grupos amino, mediante la
aparicin de manchas violeta, esta prueba dio positiva
en la revelacin del cromatograma (imagen 1).
Por ltimo, la prueba de Yodo indica la presencia
fosfolpidos con dobles enlaces, mediante la aparicin
de manchas caf, esta prueba dio positiva para la
revelacin de nuestro cromatograma (imagen 1).
Determinacin de colesterol en yema de
huevo
Se determin la concentracin de colesterol en yema de
huevo mediante el mtodo de Lieberman-Burchard, en
el cual una solucin clorofrmica, el colesterol reacciona
con anhdrido actico y cido sulfrico para dar un
complejo de color verde que resulta la mezcla de dos
complejos; uno de color azul y otro amarillo y se
cuantifican en el espectrofotmetro a 640 nm.
Primero se prepar una serie de 5 tubos, un testigo y
un problema (los cuales deben estar perfectamente
limpios y secos, ya que la reaccion se dar bajo
condiciones anhidras), todos con diferentes cantidades
de estndar de colesterol (80 g/mL) excepto el tubo
problema y el testigo, posteriormente se les adiciono
diferentes volmenes de cloroformo, el cual efectuara la
funcin de solvente en la reaccin. Despus se agrega
nicamente a nuestro tubo problema el extracto de
lpidos obtenido en la prctica anterior (separacin de
fosfolpidos por cromatografa en capa fina), de
inmediato agregamos 0.40 mL de anhdrido actico a
todos los tubos y los agitamos. Por ltimo se adiciona a
todos los tubos 50 L de cido sulfrico concentrado, se
agitan y se dejan incubar a temperatura ambiente, es
aqu cuando ocurre la reaccion entre el colesterol, el
anhdrido actico y el cido sulfrico, dando como
resultado una mezcla color verde, que proviene de la
formacin del cido 3,3 biscolesta-3,5 dienilsufonico que
presenta un color amarillo, y el cido 3,3 biscolesta-3,4
dienilsufonico de un color azul.
Posteriormente se leyeron en el espectrmetro los
tubos, y se obtuvo la curva tipo, ya que se utilizaron
diferentes concentraciones de la solucin estndar de
colesterol, despus interpolamos en la grfica nuestro
valor de absorbancia de 0.119 obtenido para nuestro
tubo problema, y tenemos que hay 26.79 g de
colesterol. Por ultimo mediante una regla de tres,
tenemos que en 5 L hay 26.79 g de colesterol, por lo
tanto para 1200 L hay 6 429.6 g de colesterol.
CONCLUSIONES
La yema de huevo contiene aproximadamente
6,429.6 g de colesterol.
Se realiz la separacin de fosfolpidos en yema
de huevo, se identific la presencia de estos
mediante la prueba con reactivo de Molibdato.
La yema de huevo contiene fosfolpidos con
dobles enlaces, colina y grupos amino.
BIBLIOGRAFA
1. E. Conn Eric, Bioqumica fundamental,
Universidad de California, Editorial Limusa, 2001,
Mxico D.F.
2. Voet Donald, Fundamentos de Bioqumica,
Editorial Mdica Panamericana, 2 Edicin, 2007,
Madrid, Espaa.
CHUPAMELA PEQUEO :333