Universidad Industrial de Santander

Escuela de Qumica
Laboratorio de Bioqumica

Purificacin y medida de la actividad enzimtica de la enzima Lactato

Deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo y medida de la actividad
enzimtica.

Victor Alfonso Jimnez Romero, cdigo 2130109

Jose Fernando Lozano Durn, cdigo 2130119

Fecha de elaboracin de la prctica: 2017-05-05 y 2017-05-12

Fecha de presentacin del informe: 2017-05-26

Objetivos:

- Conocer las propiedades fisicoqumicas de las protenas: carga, punto

isoelctrico, masa molecular y afinidad.

- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar protenas a partir

de diferentes fuentes celulares.

- Relacionar las propiedades fisicoqumicas de las protenas con el

fundamento de las tcnicas utilizadas en la purificacin de protenas:
Centrifugacin diferencial, precipitacin por salado, dilisis, electroforesis,
entre otras.

- Explicar cmo la dilisis permite el desalting.

- Aplicar las tcnicas de centrifugacin y precipitacin por salado como

tcnicas iniciales de purificacin de una protena.

- Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la

actividad enzimtica que permiten seguir y evaluar la purificacin de una
 enzima (actividad especfica, rendimiento y grado de pureza o
enriquecimiento).

Metodologa.

Preparacin de las soluciones. La solucin de amortiguador A fue preparada

y almacenada a 4C, esta solucin estaba compuesta por 0,6104 g de Tris, 9 L
de 2-mercaptoetanol (densidad=1,12 kg/L) aforada a 250 mL con agua destilada
y posteriormente se almacen en fro; el pH de la solucin se verific con la
ayuda del pHmetro y se ajust agregando varias gotas de HCl 1 M. La solucin
resultante tiene una concentracin 20 mM Tris, 0,5 M 2-mercaptoetanol y pH=
8.6.

Homogeneizacin de la pechuga. Se cort un pedazo de pechuga de pollo que

pes 37,870 g, este se cort en pequeos trozos y se almacen en fro.
Posteriormente se agreg a la licuadora los pedazos de pechuga junto con 116
mL de amortiguador A, se licu en pulsos (cada uno de 3 segundos) por 6 veces.
Luego se filtr el licuado con dos capas de gasa sobre un embudo, el precipitado
obtenido (restos de pechuga) fue desechado junto con las gasas usadas,
mientras que el filtrado fue recogido para el tratamiento posterior.
Este filtrado se almacen a 4C durante 7 das.

Precipitacin por salado. El filtrado se deposit en tubos de centrfuga y se

centrifug a 7000 rpm (5751 gravedades) con una temperatura de 4C. El
precipitado se descart, y del sobrenadante se tom una alcuota de 500 L,
estos 110 mL de sobrenadante obtenido se trataron con sulfato de amonio. Se
agregaron 35,86 g de (NH4)2SO4 en pequeas cantidades y se homogeneiz con
la ayuda de un agitador magntico esto se hizo para lograr una saturacin
aproximada del 55%. Posteriormente, el sobrenadante tratado se agreg a tubos
de centrfuga y se centrifug a 10000 rpm (11738 gravedades) durante 10 min
con una temperatura de 4C. El precipitado de descart, mientras que del
sobrenadante obtenido se recolect una alcuota de 500 L, este sobrenadante
se rotul y almacen a 4C durante 7 das.
Soluciones para actividad enzimtica. Para determinar la actividad enzimtica
se tuvo que preparar una solucin Buffer de carbonato de sodio y bicarbonato de
sodio, para esto se agregaron 0,2176 g de NaHCO 3 y 0,2659 g de Na2CO3 y se
afor a 25 mL obteniendo una concentracin aproximada de 0,1 M para cada
uno, a esta solucin se le ajust el pH a un valor de 10 agregando gotas de
NaOH 1M, esto se verific con la ayuda del pHmetro. Para preparar la solucin
de lactato 0,3 M se agregaron 603 L de cido lctico concentrado, el pH de esta
solucin se ajust a un valor de 9,8 agregando gotas de NaOH 1 M, y con ayuda
del pHmetro. La solucin de NAD+ se prepar disolviendo 99,8 mg de NAD+ en
agua destilada y aforando a 25 mL.

Actividad Enzimtica. En un tubo para centrfuga de 50 mL se mezcl 3 mL de

la solucin lactato 0,3 M, 3 mL de solucin NAD+ 6mM y 11,4 mL de buffer
NaHCO3 y Na2CO3. Se deposit 2,8 mL de esta mezcla en una celda del
espectrofotmetro y se fij el blanco a 340 nm, seguidamente se agreg a la
celda 200 L de la alcuota 1 y se midi el cambio de absorbancia cada 20
segundos por 3 minutos, estas medidas se realizaron en el modo cintica en el
espectrofotmetro. Luego se hizo el mismo tratamiento para la segunda alcuota,
los datos obtenidos son mostrados en las figuras 3 y 4.

Saturacin al 75% con (NH4)2SO4. Luego de haber saturado la mezcla del

sobrenadante al 55% con (NH4)2SO4, se agreg 14,3000 g de este mismo
compuesto para llevar la mezcla a una saturacin del 75%, posteriormente se
centrifug a 10000 rpm durante 10 minutos. Se obtuvieron 97 mL de
sobrenadante, del cual se tom una alcuota de 5mL, el sobrenadante restante
fue descartado en residuos txicos y la alcuota se rotul y almacen a 4C. El
sobrenadante y el precipitado se muestran en la figura 1 y 2 respectivamente.

Figura 1. Sobrenadante Figura 2. Precipitado

obtenido. disuelto.
Purificacin por Dilisis. La solucin para resuspender el precipitado fue
preparada con 91,3 mg de Tris este se disolvi y se ajust el pH hasta 8,5
agregando gotas de HCl 1 M, posteriormente se afor a 25 mL. Posteriormente,
se agregaron 5 mL de solucin de Tris al precipitado y se tom una alcuota de
500 L, esta alcuota se rotul y almacen a 4C.
Para realizar la dilisis se prepar una solucin tampn de H3BO3, donde se
mezclaron 4,1490 g de H3BO3 con 4,1155 g de NaOH, y posteriormente el pH
fue ajustado a un valor de 8.5 agregando gotas de HCl 1M, esta solucin se
rotul y almacen a 4C para realizar la dilisis en la prxima sesin.

Absorbancia(alcuota 1)

2,5

2,3
Absorbancia

2,1

1,9

1,7

1,5

1,3
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo (segundos)

Figura 3. Actividad enzimtica para alcuota 1.

 Absorbancia(alcuota 2) 2da vez
1,15

1,1

1,05
Absorbancia

0,95

0,9

0,85

0,8
Tiempo (segundos)

Figura 4. Actividad enzimtica para alcuota 2.

Resultados y anlisis.

- Para la realizar la lisis celular y extraer la protena se escogi a

homogenizacin por licuado, ya que la protena de inters (lactato
deshidrogenasa) se encuentra en el citoplasma.
- Despus de haber filtrado el homogenizado, se someti a centrifugacin a
5751 gravedades con el fin de precipitar tejidos, clulas completas, ncleos
celulares y membranas plasmticas producto de la lisis celular.
- Al sobrenadante que se obtuvo se le aadi sulfato de amonio, con el fin de
disminuir las interacciones de las protenas presentes con el solvente del
medio, de esta manera las interacciones hidrofbicas entre las protenas
aumentan y de esta forma se precipitan las protenas. A esta concentracin
de 55% de sulfato de amonio no se precipita el lactato deshidrogenasa ya que
la fuerza inica del medio no es lo suficientemente fuerte.
- De acuerdo a lo observado en la figura 3, la actividad enzimtica tuvo una
grfica de tipo Michaelis-Menten y de esta forma se puede ver que la enzima
tuvo un comportamiento normal, esperado. En la figura 4, no se obtuvo una
curva de tipo Michaelis-Menten, este se debi a que la enzima se encuentra
 desnaturalizada a causa de la concentracin de la sal usada para la
precipitacin.

Bibliografa

- Gonzlez de la Rosa, C., Lpez Camacho, P., Prez Hernndez, G. and

Vzquez Contreras, E. (2014). Manual de prcticas de Laboratorio de
Bioqumica. 1st ed. Cuajimalpa: Universidad Autnoma Metropolitana,
pp.15-29.

- Snchez Nieto, S. and Greaves Fernndez, N. (2013). Manual de

prcticas de Bioqumica experimental. 1st ed. Ciudad de Mxico:
Universidad Nacional Autnoma de Mxico, pp.8-13, 29-33.