SECUENCIACIN DE ADN Biologa

y
Geologa

Una tcnica propia de la Ingeniera Gentica es la determinacin de la

secuencia de nucletidos de un ADN, conocida como secuenciacin de dicho
cido nuclico.

Se ha conseguido gracias a las enzimas de restriccin y a la

posibilidad de obtener numerosas copias de un cido nuclico por clonacin.

Se pueden conseguir muchos fragmentos, de diversos tamaos y lo que

se trata es de recomponer la molcula original como si se tratase de un puzzle.

As se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano.

El mtodo ms usado para la secuenciacin es el conocido como

tcnica de terminacin de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado
conocindose actualmente como la tcnica del didesoxi.

Se denomina as por ser necesario los didesoxirribonucletidos (figura

1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos
un nucletido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.

Figura 1

Como los nucletidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay
que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucletido ser imposible
que se una otro nucletido y la cadena terminar aqu

Abreviadamente, ste sera el mtodo a seguir:

Como la tcnica se basa en la sntesis de ADN, para hacer la reaccin de
secuenciacin se necesita:

Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que
se va a secuenciar.
 SECUENCIACIN DE ADN Biologa
y
Se necesita un "cebador" (pequea hebra de ADN de reducido nmero Geologa
de nucletidos) para iniciar la sntesis. Es un corto oligonucletido
complementario del extremo de la cadena.

Tambin desoxinucletidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP,

dCMP.
Por ltimo didesoxirribonucletidos de una base en cada una de las
cuatro reacciones de secuenciacin: didesoxi de ADENINA (ddATP)
didesoxi de TIMINA (ddTTP) didesoxi de CISTEINA (ddCTP)
didesoxi de GUANINA (ddGTP)

Al aadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el cebador,

pero cesa al incorporarse un didesoxinucletido (Figura 4).

Posicin 5

Posicin 10

Figura 4
Posicin 14
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y
Geologa

Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen

de la situacin del didesoxinucletido incorporado. En el caso expuesto en el
dibujo, esta reaccin de secuenciacin se hace con un didesoxi de ADENINA,
lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podr continuarse la
polimerizacin de nuevos nucletidos, nos queda por tanto un pequeo
fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN
original, en ese lugar estar el nucletido complementario que lleva TIMINA.

En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14

nucletidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA.

Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciacin, cada una con un

didesoxirribonucleotido distinto. Los fragmentos resultantes se separan por
tamao mediante electroforesis, se autorradiografan, y la sucesin de bandas
de cada una de las cuatro reacciones, comparndolas entre s,dan la secuencia
del ADN. (Figura 5)

COMENTARIO

1. Qu importancia tiene el uso de didesoxirribonucletidos?

2. Qu posible aplicacin se le puede dar a este mtodo?
3. Qu es la Taq ADN polimerasa? Para qu se emplea?