EXERCCIOS Enzimas restrio e PCR-RFLP

1) As enzimas de restrio:
a) Quebram ligaes fosfodiester somente em posies opostas na fita dupla de DNA
b) Atuam especificamente sobre seqncias de bases com repeties em tandem.
c) Reconhecem stios palindrmicos e retiram bases das duas fitas do DNA.
d) Ligam-se a stios com espaamento regular ao longo do DNA.
e) Clivam as duas fitas de DNA dentro de stios palindrmicos.

2) Os stios de restrio:
a) so mais frequentes em DNA viral.
b) so muito raros em DNA eucarioto.
c) ocorrem com uma frequncia proporcional ao seu tamanho (em pb).
d) so tanto mais raros quanto maiores (em pb), em qualquer DNA.
e) podem conter trechos compostos pela repetio de uma nica base.

3) Suponha que um pesquisador quer analisar se 1 indivduo possui um polimorfismo de substituio de T

por A na posio 27 do gene X (X27TA), localizado no cromossomo 2. Os indivduos portadores dessa
mutao apresentam risco maior de apresentarem a doena de Parkinson. Para analisar tal polimorfismo,
ele amplificar o segmento de DNA alvo (Figura 1) por PCR e ir realizar uma digesto do produto
amplificado com a endonuclease de restrio RicII. O stio de clivagem desta enzima de restrio
5GTAA 3 e seu padro de clivagem 5GTAA3.

Figura 1. Segmento do gene X que ser amplificado por PCR. Para facilitar, as fitas 3-5 de cada alelo
do gene X amplificado foram omitidas.
Alelo 1
5 CTGCAAGCGTAAGTCTAACATCGGTATATGTA 3

Alelo 2

5 CTGCAAGCGTAAGTCTAACATCGGTATATGTA 3
Aps a digesto, ser realizada uma eletroforese dos fragmentos de restrio e o resultado analisado.
Quais aos tamanhos dos fragmentos de restrio que podero aparecer na eletroforese do indivduo?

4) A figura abaixo representa um segmento de DNA com 4.900 pares de bases (pb). As setas indicam
stios de restrio para duas enzimas (enzima X e enzima Y).
Enzima Enzima Enzima Enzima

Segmento de
DNA
pb pb pb pb pb

a) Explique como os princpios da eletroforese permitem a separao dos fragmentos de DNA.

b) Quais resultados voc esperaria observar na eletroforese aps a digesto do segmento de DNA com a
enzima X?
c) Quais resultados voc esperaria observar na eletroforese aps a digesto do segmento de DNA com a
enzima Y?
d) Quais resultados voc esperaria observar na eletroforese aps a digesto do segmento de DNA com
ambas as enzimas?

5) Caso ocorresse um polimorfismo no segmento de DNA acima que abolisse o primeiro stio de restrio
da enzima X, quais os diferentes resultados que voc esperaria encontrar na eletroforese aps a digesto
do segmento de DNA com as enzimas X e Y?

6) O diagnstico molecular do Papiloma vrus humano ou HPV envolve inicialmente a deteco do DNA
viral nos materiais clnicos provenientes das mucosas genitais e posteriormente a determinao do tipo
de HPV presente. O isolamento do DNA viral e a tipagem do HPV so realizados utilizando a tcnica da
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) associada a anlise de Polimorfismo de Fragmentos de
Restrio (PCR-RFLP). A identificao do tipo de HPV presente na amostra pela tcnica de PCR-RFLP,
alm de auxiliar na conduo do tratamento, permite determinar se os tipos presentes so de alto ou
baixo potencial para o desenvolvimento de neoplasias cervicais. Em relao a tcnica de PCR-RFLP,
assinale a alternativa correta.

(a) A tcnica de PCR-RFLP envolve a PCR do DNA extrado da amostra, digesto do produto amplificado
com enzimas de restrio e eletroforese dos fragmentos gerados.
(b) As etapas da tcnica de PCR-RFLP so: (1) digesto do DNA extrado da amostra biolgica
com enzimas de restrio, (2) PCR do produto da digesto com primers especficos e (3) eletroforese do
produto amplificado.
(c) Ela utiliza exonucleases, as quais so enzimas de restrio que clivam o DNA a partir das
extremidades dessa molcula.
(d) Ela utiliza exonucleases ou endonucleases para clivagem do DNA. Ambas so enzimas de restrio
que clivam no interior da dupla hlice em sequncias especficas.
(e) As enzimas de restrio utilizadas na tcnica de RFLP clivam o DNA em locais inespecficos e geram
padres iguais de fragmentos de restrio.