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El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de
ciencia y arte. Inicialmente fue considerada como una tcnica particularmente difcil de
aprender. Sin embargo, hoy en da estas dificultades estn superadas gracias a factores
como los medios de composicin definida, la disponibilidad de antibiticos, las
instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores
estriles, etc), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri
ventiladas, etc).
Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante
subcultivos. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de
embrin.
Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para
disociar las clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular.
Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos
celulares es la aparicin de mltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron
numerosos mtodos de manipulacin en condiciones de asepsia que an hoy da se
utilizan.
En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular humana, las clulas HeLa. El
medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo,
extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano.
En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener
algunas clulas de mamfero en cultivo indefinidamente.
Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos enzimticos y se
pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en suspensin, sencillamente
se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as formados se denominan una lnea
celular. La formacin de una lnea celular a partir de un cultivo primario implica que:
Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de clula, se
puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las clulas entran en
una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar
(supuestamente por el acortamiento de los telmeros) y mueren. Sin embargo, algunas
clulas (como las de roedores y las tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a lneas
celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas clulas pueden surgir de forma
espontnea (exposicin a radiaciones ionizantes o a carcingenos qumicos) o
inducida (infeccin vrica o transfeccin de ADN) y son el resultado de un cambio
genotpico denominado transformacin.
Las clulas transformadas se caracterizan porque:
En 1952 se obtuvo la primera lnea celular continua humana. Son las denominadas
clulas HeLa, clulas extradas a partir de un tumor de cuello del tero de una paciente
afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks.
En los cultivos primarios, las clulas crecen durante un cierto nmero de pases que
depende, sobre todo, del tipo celular y de las condiciones de cultivo. As, los
hepatocitos de adultos slo se mantienen como cultivo primario, las clulas endoteliales
de cordn umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases y los
fibroblastos drmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo, al final todas
ellas entran en una fase de senescencia en la que se acumulan numerosas
anormalidades y se pierden las funciones especializadas, lo que conduce a la muerte del
cultivo.
Slo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante ms generaciones
de las esperadas. Ello es debido a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas
clulas forman lneas estables o cultivos celulares permanentes. En la mayora de los
casos se desconoce la razn de la aparicin de clulas inmortales pero se ve favorecida
por infecciones virales y por tratamientos con mutgenos, lo que podra estar
relacionado con la prdida, espontnea o inducida, de las vas de control de la
divisin celular. La capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como
lnea estable est relacionada directamente con su variabilidad gentica. Las lneas
celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides, como es el
caso de fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo y la glia humana. Las lneas que,
con frecuencia, se convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en lneas
celulares estables, como es el caso de las clulas epidrmicas. En general, una lnea
celular estable ser tanto ms fcil de establecer o cultivar cuanto ms indiferenciada
est, con las excepciones de las lneas tumorales de clulas diferenciadas.
Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las clulas
pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de
dividirse. Esta prdida de algunas de sus propiedades caractersticas puede deberse a
desdiferenciacin o a desadaptacin. La desdiferenciacin implica una prdida
irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. Por ejemplo, un hepatocito en
cultivo puede perder algunas enzimas (como la arginasa o las aminotransferasas), o ser
incapaz de almacenar glucgeno o de sintetizar las protenas del suero. En la
desadaptacin, la prdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algn tipo e
seal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta con recuperar esa seal para que la
caracterstica se vuelva a expresar. Por ejemplo, cuando crecen sobre una matriz de
colgeno, los hepatocitos de rata pueden volver a expresar la enzima tirosina
aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona).
Una muestra de tejido es siempre heterognea. Sin embargo, al cabo de uno o dos pases,
las lneas celulares cultivadas son homogneas, es decir, su morfologa y su
composicin son uniformes. La presin selectiva de las condiciones de cultivo da lugar
a un cultivo homogneo del tipo celular ms vigoroso. A partir de ese momento se
pueden obtener rplicas idnticas en cada subcultivo y las caractersticas de la lnea
celular se conservan durante varias generaciones o de forma indefinida si la lnea celular
se conserva en nitrgeno lquido. Esto facilita mucho el tratamiento estadstico de los
resultados.
c) Economa
d) Cuestiones ticas
a) Tcnica sensible
b) Cantidad y coste
Producir 1 gramo de clulas en cultivo cuesta 10 veces menos que obtenerlas a partir del
tejido de un animal. En un laboratorio normal se pueden conseguir hasta 10 gramos de
clulas sin que se resienta mucho el presupuesto de investigacin. Para producir hasta
100 gramos de clulas hay que incrementar tanto el instrumental como el personal. Para
producir cantidades mayores se necesitan instalaciones de tipo industrial.
c) Inestabilidad
Muchas lneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotacin cromosmica
aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para
diferenciarse. Es posible, por tanto, encontrar diferencias significativas en la lnea
celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas
estables que se resiembran cada determinado tiempo o despus de un determinado
nmero de generaciones a partir de un stock congelado.
d) Desdiferenciacin e identificacin de las clulas
Por tanto, hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos in
vitro porque pueden diferir de lo que pueda observarse in vivo.