Anti-Cancer Activity Of Lokal Alpinia galanga L(SW) Rhizome Extracts On Cancer Cell

Line Of Human And Mice Transplanted With Primary Tumor Cells.

Disertasi

Herla Rusmarilin

Institut Pertanian Bogor

Program Pascasarjana
Ilmu Pangan
2003

Abstract

In recent decades, cancer is one of the degenerative diseases that occurs in human of all age
groups. Cancer as a series of metabolic abnormalities causes illness and eventual death of the patient,
so that the cancer needs special attention. Research showed that ACA (l acetoxy chavicol acetate)
contained in Alpinia galanga rhizomes had a capability to inhibit cancer growth induced by
carcinogenic agent.
Lengkuas (Alpinia galanga (L) SW) belongs to Zingiberaceae family and classified as herbal
plants, which is used a lot as spice of ingredient of traditional drug.
The aim of this research was to investigate the effectiveness of rhizome extracts of Alpinia galanga
in suppressing the growth of cancer cells by both in vitro and in vivo methods.
The objectives of this research were to investigate : (1) the effects of harvesting rime of Alpinia
galanga rhizome (i.e., 7, 8, 9, 10. 11, 12 months), duration of extraction (i.e., 3, 6, 12, 24, 48, and 60
hours), temperature and duration of storage and various solvents (i.e., chloroform, ethyl acetate,
ethanol and aqua destilata) on the quantity of ACA contained in the extracts, analyzed by using GC-
MS (Gas Chromatography Mass Spectrometer) and HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). (2) the effects of Alpinia galanga rhizome extracts on the human cancer cell line
proliferation (i.e., lung cancer/A 549, leukemia/K 562, primary melanoma/A 375, lymph node
metastases of melanoma, servix cancer/HeLa and primary cancer of human/serous adenocarcarcinoma
papillare ovarii),(3) the effects of Alpinia galanga extracts (i.e., 50, 100, 250, 500 and 750 mg/kg body
weight) on growth of cancer cells (breast cancer/compact tubular carcinoma and alveolar
rhabdomyosarkoma) transplanted on C3H mice.
The result indicated that the highest concentration of ACA was 1.62% dry basis obtained from the
extract of red Alpinia galanga and ethyl acetate used as solvent. The better harvesting time was 9
months and 48 hours of extraction time. The suggested storage of A. galanga rhizomes was 4 weeks in
low temperatur (7-10C). The extract showed a strong anti-oxidative activity, it was stronger than -
tocoferol (induction period of ekstract was 4.30 and -tocoferol was 1.80).
The results indicated that the highest concentration of l acetoxychavicol acetate, present in the
rhizome extracts of red A. Galanga caused a significant reduction of the growth of lung carcinoma (A
549 cell line) were 100% inhibition by 100 g/ml and 95% by 50 g/ml. Highest concentrations of
ACA in the extract were needed to suppress the proliferation of human primary serose
adenocarcinoma papillare ovarii,, i.e. 76.4% inhibition by 200 g/ml and 41.8% inhibition by 50
g/ml.
The results of toxicity test in vivo of A. galanga based on LD 50 was 765 mg/kg body weight.
According to macroscopic and microscopic finding, the results indicated that the dose of 750 mg/kg
body weight was relatively better than the lower concentrations. However, the lession scores showed
that doses of 50 and 750 mg/kg body weight were the best result of mammary gland cancer tissue, and

Herla Rusmarilin: Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw),2003
USU Repository2006
for rhabdomyosarcoma the best results were obtained from the doses of 250 and 500 mg/kg body
weight. Based on the lession scores and the statistical values, the concentration of 50 mg/kg body
weight was the best result to suppress the tumor growth of breast cancer, and 500 mg/kg body weight
for rhabdomyosarcoma.

Herla Rusmarilin: Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw),2003
USU Repository2006
 Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw)
Pada Alur Sel Kanker Manusia Serta Mencit Yang Ditransplantasi
Dengan Sel Tumorprimer

Disertasi

Herla Rusmarilin

Institut Pertanian Bogor

Program Pascasarjana
Ilmu Pangan
2003

Abstrak

Kanker merupakan salah satu penyakit degeneratif yang membutuhkan perhatian khusus, karena
sebagian besar penderita kanker berakhir dengan kematian. Dari penelitian-penelitian sebelumnya telah
dibuktikan bahwa l asetoksi khavikol asetat (ACA) yang terkandung dalam lengkuas mempunyai
potensi untuk menurunkan kejadian kanker yang disebabkan oleh induksi senyawa karsinogen.
Lengkuas merupakan salah satu tanaman berumpun dari famili Zingiberaceae yang banyak digunakan
sebagai rempah atau ramuan obat tradisional.
Penelitian ini bertujuan untuk melihat sejauh mana lengkuas dapat berperan sebagai anti-kanker
yang diharapkan dapat digunakan sebagai tumor chemoprevention. Juga untuk membuktikan bahwa
ekstrak rimpang lengkuas lokal (Alpinia galanga (L) Sw) mempunyai kemampuan menghambat
pertumbuhan berbagai jenis alur sel kanker manusia secara in vitro maupun pada mencit percobaan.
Penelitian ini mencakup ekstraksi dan identifikasi senyawa ACA dari rimpang lengkuas lokal
(Alpinia galanga (L) Sw); pengaruh jenis/varietas, umur panen, waktu ekstraksi. suhu dan lama
penyimpanan terhadap kadar ACA lengkuas; aktivitas antioksidan; dan aktivitas anti-kanker pada alur
sel kanker dan sel kanker primer manusia secara in vitro dan pada mencit yang ditransplantasi dengan
sel tumor primer. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode pelarut dengan teknik maserasi dan
kristalisasi. Pelarut yang digunakan adalah kloroform, etil asetat. alkohol dan air.
Jenis lengkuas yang digunakan adalah putih dan merah pada berbagai umur panen (7. 8, 9, 10, 11
dan 12 bulan) serta variasi waktu ekstraksi 3, 6, 24, 48 dan 60 jam. Perbandingan bubuk lengkuas
dengan pelarut adalah 1: 8 (b/v). Identifikasi kadar ACA ekstrak lengkuas menggunakan metode GC-
MS dan HPLC yang sebelumnya telah difraksinasi menggunakan kolom kromatografi dan diuji dengan
kromatografi lapis tipis dengan berbagai perbandingan pelarut hexan : dietil eter (1:1). Alu sel kanker
manusia yang digunakan adalah A 549 (sel kanker paru-paru, K 562 (sel kanker leukemia), A 375
(melanoma primer), melanoma metastase dan HeLa (sel kanker serviks); sel kanker primer manusia
adenokarsinoma papilar serosa, mencit C3H yang ditransplantasi dengan tumor payudara dan
rhabdomiosarkoma.
Sebagai bahan ekstraksi adalah bubuk lengkuas kering. Bubuk lengkuas dibuat dari rimpang
lengkuas segar, digiling dengan penggilingan listrik dan disaring dengan ayakan 60 mesh. Selanjutnya
dikeringkan dengan alat pengering beku. Bubuk lengkuas diekstrak menggunakan pelarut khloroform,
etil asetat, alkohol atau akuades. Supernatan yang dihasilkan dipekatkan dengan rotary vacuum
evaporator, ditambahkan petroleum eter dan disimpan dalam lemari pendingin suhu -30C. Endapan
yang terbentuk direkristalisasi dan dipekatkan dengan gas nitrogen, sehingga diperoleh ekstrak
lengkuas.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar ACA tertinggi yang diperoleh dari ekstrak khloroform
rimpang lengkuas merah dengan umur panen 9 bulan yaitu sebesar 0.56% berat kering dengan
Herla Rusmarilin: Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw),2003
USU Repository2006
rendemen sebesar 3.07% (b/b) dari bubuk lengkuas. sedangkan ekstrak lengkuas yang diperoleh setelah
fraksinasi dengan kolom kromatografi menghasilkan rendemen berbentuk kristal putih sebesar 1.92%
(b/b) dari ekstrak lengkuas dan 0.059% (b/b) dari bubuk lengkuas. Waktu ekstraksi yang optimal
diperoleh selama 48 jam. Penyimpanan rimpang lengkuas merah pada lemari pendingin (suhu 7-10 C)
menunjukkan hasil yang lebih baik daripada penyimpanan pada suhu kamar (28-30C). Makin lama
rimpang lengkuas disimpan, kadar ACA-nya makin menurun. Untuk mempertahankan kadar ACA,
lengkuas segar sebaiknya disimpan pada suhu (7-10C) sampai dengan 4 minggu, karena masih
mengandung ACA sebesar 0.44%. Pada penyimpanan lebih lanjut yaitu 6 minggu menyebabkan
penurunan kadar ACA lebih dari setengahnya menjadi 0.21%. Sedangkan penyimpanan pada suhu (28
- 30C) sebaiknya sampai dengan 2 minggu, karena kadar ACA-nya masih cukup tinggi yaitu sebesar
0.43%. Penyimpanan lebih lama menyebabkan kandungan ACA menurun tajam menjadi 0.05% dan
0.01%, yaitu pada penyimpanan 4 dan 6 minggu.
Pada uji anti-oksidatif, ekstrak khloroform lengkuas hasil maserasi dengan atau tanpa fraksinasi
menggunakan kolom khromatografi yang dilakukan dengan metode tiosianat terbukti mempunyai
aktivitas antioksidan. Kedua jenis ekstrak tersebut memiliki faktor protektif masing-masing sebesar
4.33 dan 4.50, sedangkan -tokoferol sebesar 1.79. Nilai 4.33 atau 4.5 menunjukkan bahwa ekstrak
lengkuas mempunyai efek antioksidasi yang lebih kuat dibanding -tokoferol. Penambahan ekstrak
lengkuas ternyata dapat mempertahankan oksidasi asam linoleat sampai dengan 30 dan 31 hari.
Sedangkan senyawa ACA murni (diperoleh dari Kinky University, Japan) ternyata dapat melindungi
asam linoleat dari pengaruh oksidasi selama 46 hari dengan faktor protektif sebesar 6.71. Hal ini
membuktikan bahwa senyawa ACA murni mempunyai efek antioksidasi lebih kuat dibanding yang
lain.
Untuk menghasilkan kadar ACA yang tinggi diperlukan pelarut lain yang bersifat tidak beracun.
Ekstraksi lengkuas merah umur panen 9 bulan dan maserasi selama 48 jam, menggunakan pelarut etil
asetat ternyata memberikan hasil yang lebih tinggi daripada khloroform, alkohol atau air yaitu sebesar
1.62 0.02% berat kering. Identifikasi senyawa ACA ekstrak lengkuas dilakukan dengan HPLC.
Kandungan ACA yang tinggi diduga memberikan respon aktivitas antioksidan yang lebih kuat. Oleh
karena kandungan ACA pada ekstrak lengkuas putih rendah, maka tidak diteliti lebih lanjut. Ekstrak
etil asetat lengkuas merah digunakan untuk penelitian selanjutnya.
Ekstrak etil asetat lengkuas ternyata dapat menghambat proliferasi sel kanker dalam kultur baik
menggunakan alur sel kanker maupun sel kanker primer manusia. Penghambatan proliferasi sel kanker
diukur berdasarkan jumlah sel yang hidup dalam kultur dengan hemositometer. Penghambatan ini
dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi ekstrak lengkuas. Mekanisme penghambatan yang terjadi
diduga karena opoptosis yaitu kematian sel terprogram. Penghambatan proliferasi sel kanker paru-paru
(A 549) sebesar 100% pada konsentrasi ekstrak etil asetat 100 g/ml dan terendah 95% pada
konsentrasi 50 /ml, sedangkan penghambatan tertinggi terhadap sel kanker primer yang diambil dari
jaringan kanker ovarium adenokarsinoma papilar serosa adalah sebesar 76.36% pada konsentrasi 200
g/ml dan terendah 41.82% pada konsentrasi 50 g/ml.
Metode bioassay menggunakan sel Wish yang diinfeksi oleh virus encephalomiocarditis
menunjukkan bahwa IFN- merupakan salah satu komponen imun yang dapat menghambat
pertumbuhan kanker. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan untuk dapat melihat sejauh mana
IFN- berperan di dalam penghambatan proliferasi jaringan kanker. Hasil penelitian ini membuktikan
bahwa IFN- dapat menekan pertumbuhan virus encephalomiocarditis secara tidak langsung. Diduga
ekstrak lengkuas dapat menginduksi terbentuknya IFN- pada alur sel kanker A 549, K 562, A 375,
melanoma metastase dan HeLa. Diantara sel kanker yang diuji, sel leukemia (K 562) merupakan alur
sel kanker yang membutuhkan konsentrasi interferon tinggi untuk menghambat pertumbuhannya. Sel
leukemia yang diuji berasal dari efusi pleura. Untuk menghambat proliferasi sel K 562 sebanyak 76.74
% diperlukan IFN- sebesar 299 unit/ml.
Hasil uji toksisitas secara in vivo berdasarkan pengukuran LD50 terhadap mencit jantan dan betina
strain C3H yaitu sebesar 765 mg/kg berat badan. Konsentrasi 765 mg/kg berat badan merupakan batas
Herla Rusmarilin: Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw),2003
USU Repository2006
konsentrasi tertinggi yang dapat membunuh 50% mencit percobaan. Di atas dosis 765 mg/kg berat
badan, kematian mencit kemungkinan terjadi karena keracunan akibat ekstrak lengkuas. Penelitian
dilanjutkan dengan uji antitumorigenesis melalui transplantasi, yaitu pemindahan jaringan kanker
primer payudara jenis karsinoma tubular padat dan rhabdomiosarkoma alveolar melalui
intraperitonial mencit yang sebeIumnya telah diberi ekstrak lengkuas sebanyak 0.2 ml dengan dosis 50,
100, 250, 500, 750 mg/kg berat badan selama 10 hari. Pemberian ekstrak dilanjutkan sampai dengan
mencit percobaan perlakuan kontrol mati, yaitu 42 hari untuk mencit dengan kanker payudara
karsinoma turbular padat dan 20 hari untuk rhabdomiosarkoma.
Hasil penelitian jaringan kanker pada mencit yang ditransplantasi dengan sel kanker primer
menunjukkan bahwa dosis ekstrak lengkuas 750 mg/kg berat badan mencit karsinoma tubular padat
dan 500 mg/kg berat badan mencit rhabdomiosarkoma memberikan gambaran makroskopik yang lebih
baik dibanding dosis yang lebih kecil. Pada akhir penelitian menunjukkan bahwa kelompok dengan
perlakuan dosis tinggi, rasio berat jaringan kanker terhadap berat badan mencit relatif kecil dibanding
kelompok dosis rendah. Demikian juga dengan volume dan berat jaringan kanker. Pertumbuhan
jaringan kanker yang relatif kecil menunjukkan bahwa ekstrak lengkuas dapat menghambat proliferasi
sel kanker. Ratio berat jaringan kanker payudara karsinoma tubular padat terhadap berat badan mencit
pada akhir penelitian yaitu 2.02% pada dosis 750 mg/kg berat badan dan 8.45% pada dosis 50 mg/kg
berat badan. Sedang pada kanker rhabdomiosarkoma alveolar, ratio terendah sebesar 7.34% pada dosis
750 mg/kg berat badan, tertinggi 11.98% pada dosis 50 mg/kg berat badan.
Gambaran mikroskopik menunjukkan bahwa kelompok perlakuan dosis tinggi ditemukan adanya
daerah nekrosa yang luas. Hal ini membuktikan bahwa ekstrak lengkuas efektif menghambat
pertumbuhan jaringan kanker, dengan akibat terjadinya kematian sel di daerah jaringan kanker
tersebut. Berdasarkan hasil Skoring Lesio dan analisa statistik rnenunjukkan bahwa dosis 50 mg/kg
berat badan ekstrak etil asetat lengkuas merah merupakan perlakuan yang paling baik untuk
penghambatan pertumbuhan jaringan kanker payudara karsinoma tubular padat. Sedangkan untuk
jaringan kanker rhabdomiosarkoma alveolar, pemberian dosis 500 mg/kg berat badan merupakan
perlakuan yang paling baik. Salah satu faktor imun yang dapat menghambat pertumbuhan kanker telah
dibuktikan dengan uji IFN- secara in vitro.
Kesimpulan hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat lengkuas merah umur 9 bulan
dengan waktu maserasi 48 jam mengandung ACA tertinggi yaitu sebesar 1.62 0.02%. Penghambatan
tertinggi terjadi pada sel kanker A 549 sebesar 100% konsentrasi 100 g/mI ekstrak etil asetat
lengkuas. Ekstrak etil asetat lengkuas mempunyai potensi dalam rnenghambat semua jenis alur sel
kanker dan sel kanker primer manusia. Dosis 50 mg/kg berat badan merupakan perlakuan yang paling
baik dalam rnenghambat pertumbuhan jaringan kanker karsinoma tubular padat dan dosis 500 mg/kg
berat badan untuk jaringan kanker rhabdomiosarkoma. Salah satu faktor imun yang dapat menghambat
pertumbuhan kanker telah dibuktikan dengan uji IFN-.
Tampaknya aktivitas anti kanker ekstrak lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak lengkuas
dalam meningkatkan IFN- oleh alur sel kanker paru-paru, leukemia, melanoma primer, melanoma
metastase dan kanker serviks.

Herla Rusmarilin: Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Lengkuas Lokal (Alpinia Galanga (L) Sw),2003
USU Repository2006