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1. Estimacin de la vida til microbiolgica: uso de herramientas predictivas.

Como ha sido comentado en muchas revisiones, la microbiologa predictiva de alimentos se


constituye hoy por hoy en una herramienta valiosa para el sector agroindustrial, ya que permite
obtener resultados en menor tiempo minimizando el uso de materiales de laboratorio, mano de
obra, y reduciendo por tanto costo econmico. Sin embargo, la microbiologa tradicional an
sirve de apoyo a la microbiologa predictiva. El modelamiento predictivo que integra el
comportamiento microbiano con otras variables del proceso ha empezado a ganar inters en la
industria agroalimentaria para predecir la vida til (Banks, 1994). Sin embargo, la
determinacin de la vida til es un tema complejo como es difcil predecir los efectos de las
variables de almacenamiento y las condiciones de abuso que un producto puede experimentar
(Williams, 1992).

La gran variedad y nmero de microorganismos alterantes encontrados en los productos


alimenticios significa que los modelos de prediccin de alteracin son menos fciles de
desarrollar que los modelos de microorganismos patgenos y su aplicacin es mucho ms
limitada (Pin y Baranyi, 1998). Al igual que ocurre con el anlisis de riesgos y el HACCP, la
prediccin de la vida til debe considerar todas las etapas en la produccin de un alimento.
Deben obtenerse datos exactos acerca de las materias primas utilizadas, la formulacin de
productos, montaje de productos, tcnicas de procesamiento, condiciones de higiene, tipo de
empacado empleado, almacenamiento y procesos de distribucin y el manejo final del
consumidor. Slo cuando todas estas reas estn representadas puede hacerse posible una
prediccin fiable de la vida til (McMeekin y Ross, 1996b; Dalgaard, 1995).

El realizar un estudio de vida til puede implicar una amplia utilizacin tanto de recursos
tecnolgicos como financieros. Sin embargo, el desarrollo de modelos de prediccin podra en
un plazo prudencial reducir el uso de estos recursos y mejorar el tiempo de utilizacin
(Neumeyer y col., 1997a). Los estudios se han llevado a cabo sobre una gran variedad de
alimentos para determinar la vida til (por ejemplo en productos crnicos: Devlieghere et al.,
1999; Kant-Muermans et al., 1997; Neumeyer et al., 1997a, b; Vankerschaver et al., 1996). Sin
embargo, estos estudios no han utilizado un modelo capaz de incorporar todas las variables que
puedan tener un impacto sobre el crecimiento microbiano. Los principales factores que influyen
en la estabilidad microbiana en los alimentos son la temperatura, pH y actividad de agua. La
temperatura en particular puede variar significativamente a travs de la produccin y
distribucin (Geeraerd et al., 1998).
La mayora de los estudios han utilizado modelos dependientes de la temperatura, tales como el
modelo de la raz cuadrada (Ratwkosky et al., 1983) o el modelo de Arrhenius, y si bien es
cierto que con la mayora de los alimentos la temperatura es el principal factor que afecta la vida
til, no es la nica variable (Einarsson, 1994; Gill y Jones, 1992a; Gill et al., 1988; Einarsson y
Ericksson, 1986). La mayora de los modelos dinmicos propuestos (Baranyi et al., 1993a,
1996b; Van Impe et al., 1995, 1992) es necesario el empleo de ms de una variable fluctuante
para predecir con precisin la vida til de los productos alimenticios. Los mtodos prcticos
utilizados en la elaboracin de modelos predictivos de vida til necesitan avanzar ms
(McDonald y Sun, 1999). Los mtodos estndares de anlisis microbiolgicos aunque son
eficaces an son lentos. Las investigaciones futuras deberan tener en cuenta el corto perodo de
vida de gran parte de alimentos refrigerados y el hecho de que los resultados son necesarios
rpidamente (Gibbs y Williams, 1990). El uso de tcnicas microbiolgicas ms rpidas que las
actuales ser necesario en el futuro.

Vamos a explicar dos mtodos clsicos para la determinacin de la vida til de alimentos, un
primer modelo desarrollado por Monod-Hinshelwood para la estimacin de la caducidad
microbiolgica y en segundo lugar, el modelo de Arrhenius empleado fundamentalmente en la
estimacin de la caducidad fsico-qumica, aunque puede emplearse en la estimacin
microbiolgica como veremos en el ejercicio descrito en el numeral 6.

De todas formas, cabe recordar que los modelos de prediccin microbiolgica son en muchos
casos generales y variados y por tanto pueden extrapolarse para la estimacin microbiolgica de
la vida til de diversos alimentos. de los modelos secundarios son modelos de tipo cintico

1.1 El modelo de Monod-Hinshelwood (descrito por McMeekin y Ross, 2002)


Esta aproximacin puede ser usada para el clculo de la vida til microbiolgica. En palabras de
McMeekin y Ross (2002) la experiencia ha mostrado que para la mayora de los casos donde
estn implicadas asociaciones de microorganismos alterantes, el tiempo en el cual ocurre o se
desarrolla la alteracin de los alimentos est directamente relacionada con el tiempo de
generacin de aquel microorganismo que juega el papel predominante en dicha asociacin.
Esto es, que si conocemos la microbiota alterante predominante en los alimentos perecederos y
sabemos cmo cambia su poblacin en el tiempo (si asumimos que la ocurrencia de alteraciones
especficas se da despus de la fase de latencia), puede establecerse la vida til del mismo
mediante la siguiente relacin (aproximacin de MonodHinshelwood):
Ec.1 de Monod-Hinshelwood
Donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteracin bajo las mismas condiciones
extrnsecas e intrnsecas medidas; N s (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la poblacin de
seguridad (valor mximo permisible antes de considerarse alterado el producto); N 0(ufc/g o cm2)
es el valor correspondiente a la poblacin inicial presente en el producto; T g es el tiempo de
generacin de la poblacin alterante especfica. As una vez N s y Tg han sido determinados para
esas condiciones de almacenamiento, es muy fcil determinar el tiempo de vida til
reemplazando en la frmula anterior, y por tanto, puede establecerse el mantenimiento de la
calidad de estos productos bajo estas condiciones. Por lo tanto, todo lo que se requiere para
estimar la vida til de ese alimento es conocer la poblacin inicial (N 0).

Si la anterior aproximacin se aplica a diferentes temperaturas, entonces puede evaluarse el


efecto de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano, transformando los datos de velocidad
de crecimiento o tiempo de generacin en una grfica de dependencia de la temperatura (como
ha sido usada por Mossel e Ingram, 1955), y obtener una constante que indique como cambia la
velocidad de crecimiento con el cambio de la temperatura. En este caso debera considerarse
calcular k a diferentes intervalos de temperatura constantes (por ejemplo el modelo de Q 10 ; el
cual muestra como vara k cada vez que se incrementa o disminuye en 10C la temperatura de
almacenamiento.

Un modelo similar haba sido establecido por Svante August Arrhenius (Sueco, 1859-1927) en
1889, cuando descubri que la velocidad de las reacciones qumicas aumenta con la
temperatura, en una relacin proporcional a la concentracin de molculas existentes.

1.2. El modelo de Arrhenius (efecto de la temperatura sobre la velocidad de alteracin)

Las aproximaciones modernas de la Microbiologa Predictiva de Alimentos han tratado de


entender y establecer un vnculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que
regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, etc.
La gran mayora de los modelos secundarios son modelos de tipo cintico (McDonald y Sun,
1999; Labuza y Fu, 1993), de los cuales el ms comnmente usado ha sido el modelo de
Arrhenius.
Los modelos cinticos para la determinacin de la vida til en alimentos son generalmente
basados en la ocurrencia de fenmenos y estos no han sido desarrollados para un alimento en
particular. Sin embargo, los parmetros experimentales y ambientales de un modelo pueden
aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es normalmente considerada
como el factor ms importante en las reacciones de deterioro de los alimentos, especialmente,
para la alteracin microbiana donde la velocidad de crecimiento especfico y la fase de latencia
son altamente dependientes de la temperatura (Giannuzzi et al., 1998). La ecuacin de
Arrhenius fue derivada empricamente basada en consideraciones termodinmicas (Labuza y
Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reaccin cambia cuando se emplean
diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994). La forma ms simple de esta
ecuacin es:

Ec 2. Arrhenius

Donde, k es la velocidad de reaccin; A {(ufc/ml, g o cm 2)/tiempo} es un factor pre-exponencial


parmetro a ser determinado (intercepto de y en una grfica de Lnk vs 1/T) , R es la
constante de los gases (8.314 J mol -1 K-1 ), T es la temperatura absoluta (K), y Ea es
denominada como la energa de activacin de la reaccin lmite de velocidad-crecimiento (Ross
y McMeekin, 1994). Si en la ecuacin anterior los valores de k son calculados a diferentes
temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una lnea recta en la cual la
pendiente (m) es igual E a/R (Dominic, 2004; McDonald y Sun, 1999; Labuza et al., 1992;
Labuza y Riboh, 1982). As el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificacin de
Whiting y Buchanan (1993) como un modelo secundario.

Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el


crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento especfico
(Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi et al., 1998), y la ecuacin de Arrhenius puede escribirse
como:

Ec 3

Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las grficas pueden
no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuacin anterior no puede encajar muy bien por debajo
de los datos ptimos o por encima de las temperaturas de crecimiento. Entonces, las grficas
obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de
temperatura (McDonald y Sun, 1999; Labuza y Fu, 1993). As la ecuacin que ha sido utilizada
mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es
el modelo de la raz cuadrara propuesto por Ratkowsky et al., en 1982 (Giannuzzi et al., 1998;
Neumeyer et al., 1997; Willocx et al., 1993; Adair et al., 1989).

Ec4:

Ejercicio d e e s ti m aci n de l a vi da ti l empleando m o de l os predictivos y test


acelerados de tiempo.

En el proceso de pasteurizacin de la leche a 72C por 15 segundos se busca reducir la carga


total microbiana un 99,99%. El producto est pensado para ser mantenido en condiciones de
refrigeracin (4C 0,5C). La variable microbiolgica a controlar es el recuento total de
4
viables, cuyo lmite mximo de crecimiento permitido es 4x10 ufc/ml. Si la carga inicial

es de 10x106 bacterias por ml, al final del proceso se detecta que la poblacin final
remanente es de 1000 ufc/ml.

Determine la vida til a 4C empleando los datos del test acelerado de tiempo durante 12
horas mostrados a continuacin:

Tabla 01: Datos para calculos


Para el clculo de la vida til pueden emplearse varios modelos predictivos, pero vamos a
comenzar con la aproximacin de Arrhenius.
-
1. El primer paso una vez obtenida la poblacin en unidades logartmicas (ln ufc ml
1
) es calcular la velocidad de crecimiento especfica () para cada temperatura. Esta
-1
puede obtenerse de diversas maneras, una es graficando en las ordenadas el ln ufc ml
en fase exponencial y en las abscisas el tiempo (min), y a partir de esta grfica
obtener la ecuacin de la recta en cuyo caso la pendiente es igual a la velocidad de
-1 -1
crecimiento especfica (ufc ml min ). Otra forma es calculando a partir de la
siguiente expresin:

Tabla 2 .Tambin puede emplearse el uso de software especficos como el DMFit,


MicroFit, etc.
2. Con los resultados de para cada temperatura procedemos a calcular las constantes del
modelo de Arrhenius: energa de activacin (Ea) y el Factor pre-exponencial A. Para
este caso graficaremos en las ordenadas el ln a cada temperatura y en las abscisas el
inverso de cada temperatura absoluta (1/T). Recordemos que cuando se grafica de esta
forma, la pendiente de la recta (m) que se obtiene es igual a: Ea/R (y que por tanto
Ea = m*R, que en todos los casos ser positiva); y el intercepto en el eje y cuando
X=0 es el factor pre-exponencial en logaritmo (LnA).

Figura 1. Relacin entre la velocidad de crecimiento vs temperatura


mediante la cintica de Arrhenius

De la grfica podemos inferir que: Ea = (m*R)

-1 -1
R = 8,314472 J mol K

Ea = (13679 Ln ufcK/ml*min * 8,314472 J/molK)

Ea = 113733,662 Ln ufc*J/ml*min*mol.

LnA = 41,371 Ln ufc/ml*min

3. Una vez obtenidos los parmetros procedemos a calcular a 4C (277K)


reemplazando en la ecuacin de Arrhenius.
Por tanto, la velocidad de crecimiento especfico a 4C es de 0,0003316 Ln ufc/ml*min.

4
4. Procedemos a estimar entonces la vida til a 4C. Si nuestro valor lmite es 4,0x10
ufc/ml (10,5966 Ln ufc/ml). Si tenemos que por cada minuto se incrementa 0,0003316
Ln ufc/mln {recordemos que se obtiene del Ln ufc/ml vs tiempo (min)}, en cuanto
tiempo se alcanzarn las 10,5966 Ln ufc/ml que es nuestro valor lmite?

5. Podemos usar una sencilla regla de tres:

1 min 0,0003316 ln ufc/ml

X? 10,5966 ln ufc/ml

X = 31955,97 minutos, aproximadamente 31956 minutos, o el equivalente a 22


das.

Con el empleo de la cintica de Arrhenius, obtendramos un producto con una vida


til media de 20 a 22 das si se conserva a temperatura de 4C.
Si usamos la aproximacin de Monod-Hinshelwood, debemos conocer el tiempo de
generacin a la temperatura problema, en este caso a 4C.

1. El primer paso y para este caso, debemos calcular k para cada temperatura,
aunque tenemos varias opciones, emplearemos en este caso la frmula:

Tabla 3.Donde Tg equivale al tiempo de generacin

2. El segundo paso es graficar el Log10Tg para cada temperatura experimental en


las ordenadas y la Temperatura en crecimiento
Figura 2. Relacin entre el tiempo de generacin (expresado en unidades
Log 10) vs temperatura de crecimiento.

3. A partir de la ecuacin de la recta calculamos el Log 10Tg a 4C.

Si y = 1,27ln(x) + 5,8484, entonces a 4C


(x). Log10Tg = 1,27*ln(4) + 5,8484

Log10Tg = 1,27*1,386 + 5,8484

Log10Tg = 1,761 + 5,8484

Log10Tg = 4,0878

4,0878
Tg = 10

Tg = 12240,7 min a 4C

4. Con los datos anteriores de Tg a 4C, procedemos a establecer la vida til mediante
la ecuacin:

Con el empleo del modelo de Monod-Hinshelwood, obtendramos un producto con una


vida til media de 45 das si se conserva a temperatura de 4C.

2. CRECIMIENTO MICROBIANO

Se entiende por el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto,
no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular,
sino al demogrfico de una poblacin.

El crecimiento microbiano es un proceso autocataltico: no habr crecimiento sin la presencia de


al menos una clula viable, y la tasa de crecimiento aumentar de acuerdo con la cantidad de
biomasa viable presente. La pauta de crecimiento es la misma para bacterias y hongos.
Las bacterias requieren determinadas condiciones para multiplicarse rpidamente, esta
multiplicacin rpida es la que causa problemas relacionados con la seguridad del alimento.
En condiciones ideales este crecimiento rpido puede llegar a un tiempo de generacin menor
que 20 min.

2.1. FASES DE CRECIMIENTO MICROBIANO:

El crecimiento de un cultivo microbiano se divide en etapas claramente diferenciables:

a) Fase de latencia: Etapa en la cual un inculo proveniente de otro medio de N de


microorganismos viables cultivo al ser puesto en un medio fresco no crece.
b) Fase exponencial: Etapa en la que las clulas estn dividindose, por lo que crecen de
manera exponencial. La velocidad vara de una especie a otra y depende de parmetros
ambientales como la temperatura.
c) Fase estacionaria: Etapa en la que los nutrientes se agotan y el crecimiento
exponencial cesa. Hay actividad metablica de sntesis y energa.
d) Fase de muerte: Las clulas ya no crecen ni realizan actividades metablicas. Hay
lisis celular.

Figura 3.curva de la fase de crecimiento microbiano

2.3. Factores para el crecimiento Microbiano

Los factores que influyen en el crecimiento microbiano en los alimentos y por tanto las
asociaciones que se desarrollan, tambin determinan la naturaleza de la alteracin y cualquier
riesgo para la salud que se planteen. La fase logartmica de crecimiento puede verse afectada si
se acorta su longitud, controlando los factores de crecimiento.

Hace ms de 40 aos Mossel e Ingram dividieron estos factores que influyen en el desarrollo de
las asociaciones microbianas en los alimentos:

2.3.1. Factores intrnsecos

Nutrientes
pH

Potencial redox

Actividad de agua

Constituyentes antimicrobianos

Estructuras antimicrobianas

2.3.2. Factores ambientales o extrnsecos

Humedad relativa

Temperatura

Atmsfera gaseosa

2.3.1. FACTORES INTRINSECOS

2.3.1.1 CONTENIDO DE NUTRIENTES

Del mismo modo que los seres humanos, los microorganismos son capaces de utilizar los
alimentos como fuente de nutrientes y de energa. Los microorganismos en los alimentos,
para multiplicarse y desarrollar su fisiologismo normal, necesitan los elementos siguientes:

Agua.
Fuente de energa.
Fuente de nitrgeno y vitaminas.
Factores de crecimiento afines, como sales minerales.

2.3.1.2 PH.

La acidez o la alcalinidad de un medio tienen gran influencia en la estabilidad de


macromolculas tales como las enzimas, lo que justifica que tanto el crecimiento como el
metabolismo de los microorganismos estn influidos por el pH.

En general, las bacterias crecen con mayor rapidez a pH comprendido entre 6,0 y 8,0 (tabla
4.), las levaduras entre 4,5 y 6,0, as como los hongos filamentosos entre 3,5 y 4,0; aunque
hay bacterias capaces de crecer a pH bajos como consecuencia de su metabolismo productor
de energa, por ejemplo, los lactobacilos y las bacterias acticas cuyo crecimiento ptimo
generalmente tiene lugar a un pH comprendido entre 5,0 y 6,0. Si a un alimento se le cambia
el pH, ya sea por encima o por debajo del neutro, los microorganismos crecern con mayor
lentitud.
Tabla 4: lmites de pH segn tipo de microorganismos

2.3.1.3 POTENCIAL REDOX (EH).

Una reaccin de oxidacin-reduccin (O/R) o de potencial redox (Eh) se produce como


consecuencia de una transferencia de electrones entre tomos o entre molculas. Desde hace
muchos aos se conoce que los microorganismos presentan diferentes grados de sensibilidad
al potencial de oxidacin-reduccin del medio de cultivo.

En general, el potencial redox de un sustrato se puede definir como aquel en el que el


sustrato pierde o gana electrones con mayor facilidad. Cuando un elemento o compuesto
pierde electrones, se dice que el sustrato ha sido oxidado, mientras que un sustrato que gana
electrones se ha reducido.

En relacin con los microorganismos, el potencial redox indica las relaciones de oxgeno
entre ellos, y es utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de
generar energa y sintetizar nuevas clulas. Los microorganismos aerobios necesitan para
crecer valores redox positivos, mientras que los anaerobios frecuentemente requieren valores
negativos. Los microorganismos de acuerdo con su potencial de oxidacin-reduccin se
dividen en los grupos siguientes:

a) Aerobios estrictos:Los microorganismos aerobios estrictos en el hbitat de los


alimentos usan el oxgeno como aceptor final de electrones en la respiracin (Bacillus
subtilis, B. megaterium, Acinetobacter, etc.), por consiguiente, tienen necesidad de
oxgeno y de elevado Eh, por lo que predominarn en la superficie de los alimentos
expuestos al aire o en aquellas zonas de los mismos en las que el aire pueda ser
utilizado fcilmente; de manera que Pseudomonas, por ejemplo, Ps. fluorescens que
crece a un Eh comprendido entre +100 y +500 mV. Otros bacilos gramnegativos
oxidativos producen muclagos y olores desagradables en la superficie de la
carne, Bacillus subtilis posee un potencial redox de crecimiento comprendido entre -100
y +135 mV, produce viscosidad en la textura abierta del pan y las especies de
Acetobacter que crecen en la superficie de las bebidas alcohlicas, oxidan el etanol a
cido actico para producir alteracin o vinagre.
b) Anaerobios estrictos: Los microorganismos anaerobios obligados solo tienden a crecer
a potenciales redox bajos o negativos, no pueden utilizar el oxgeno como aceptor final
de electrones; dentro de ellos los Clostridios tienen gran importancia en microbiologa
de los alimentos. Tienen la posibilidad de crecer donde las condiciones sean anaerobias,
por ejemplo, en la profundidad de los tejidos y en los estofados de carne, en los
alimentos envasados y enlatados al vaco causando alteracin. Entre los
microorganismos anaerobios ms importante para la salud pblica se
encuentra Clostridium botulinum.
c) Anaerobios facultativos: Los anaerobios facultativos como los que forman las familias
Vibrionaceae, Enterobacteriaceae y Corynebacteriaceae pueden utilizar el oxgeno
como aceptor final de electrones, pero en su ausencia tambin pueden utilizar una
diversidad de aceptores de electrones (NO3-, SO42-). Estos organismos pueden crecer
en la superficie y en el interior de los alimentos, algunos poseen actividad proteoltica o
lipoltica. Con frecuencia sus productos de desechos son cidos orgnicos.
Debido a su profusa distribucin, su amplio rango de actividad enzimtica y su
capacidad para descomponer los compuestos orgnicos, dichos microor-ganismos
pueden competir en una amplia gama de ambientes y con frecuencia son responsables
de la alteracin de los alimentos de bajo Eh; a esto se debe que sean importantes
microorganismos alteradores de los alimentos; aunque algunos como los lactobacilos se
pueden utilizar para cambios beneficiosos en la elaboracin de varios alimentos.
Algunos microorganismos anaerobios facultativos como las enterobacterias tienen gran
relevancia para la salud pblica.
d) Microaerfilos: Estos microorganismos necesitan una cantidad muy reducida de
oxgeno para su crecimiento, lo cual se debe tener en cuenta a la hora de cultivarlo en el
laboratorio, uno de los microorganismos importantes desde el punto de vista de
enfermedad para el humano a travs de los alimentos es Campylobacter spp.
2.3.1.4 ACTIVIDAD DE AGUA.

La vida tal y como nosotros la conocemos depende totalmente de la presencia de agua en


estado lquido, por tanto, los microorganismos necesitan de agua libre o disponible para su
crecimiento. Los solutos como sal y azcar, as como los mecanismos de deshidratacin
disminuyen el agua disponible y reducen el rango de crecimiento microbiano.

La actividad acuosa de un alimento o solucin (Aa) se define como el cociente entre la presin
parcial del agua existente en la atmsfera en equilibrio con el sustrato (alimento) (P) y la
presin parcial de la atmsfera en equilibrio con el agua pura a la misma temperatura:

Aa = P/Po.

Tabla 5. Niveles mnimos de activad acuosa que permiten el crecimiento de los


microorganismos que se citan a temperaturas prximas a la ptima

A continuacin, se definen 3 grupos de microorganismos asociados a diferentes tipos de


alimentos de acuerdo con su actividad acuosa o su presin osmtica:
a) Halotolerantes: Capaces de crecer en presencia de elevadas concentraciones de sal.
b) Osmotolerantes: Capaces de crecer en presencia de elevadas concentraciones de
compuestos orgnicos no ionizados como son los azcares.
c) Xelotolerantes: Capaces de crecer en alimentos secos.

Estos trminos no definen estrictamente grupos exclusivos de microorganismos, pero son


tiles en el contexto de los estudios de determinados alimentos.
Si bien es cierto que algunos microorganismos crecen mejor a Aa reducida, por ello
pueden ser definidos como:
a) Halfilos: Microorganismos que son capaces de crecer en presencia de elevadas
concentraciones de sal y ata?en principalmente a las bacterias, como las halobacterias
que incluyen gneros tales como Halobacterium y Halococcuspertenecientes a
las Archebacterias. Son obligadamente halfilas, suelen encontrarse en los lagos salados
o en las charcas de agua salada y pueden causar la alteracin proteoltica del pescado
salado y desecado.
b) Xerfilos: Microorganismos que crecen ms rpidamente bajos condiciones de relativa
sequedad y estn representados por mohos y levaduras.
c) Osmfilos: Microorganismos que crecen en hbitat con altas presiones osmticas, este
trmino se aplica habitualmente a las levaduras tolerantes al azcar.

Tabla 6. Grupos principales de alimentos en relacin con su activad acuosa

El valor limitante de la actividad de agua para el crecimiento de cualquier microorganismo es


aproximadamente de 0,6, de modo que por debajo de este valor la alteracin de los alimentos no
es microbiolgica.
2.3.2 FACTORES EXTRINSECOS
2.3.2.1 HUMEDAD RELATIVA.

La humedad relativa y la actividad acuosa estn relacionadas entre s, de modo que la humedad
relativa es esencialmente una medida de la actividad de agua en la fase gaseosa. Cuando se
almacena un alimento que tiene actividad acuosa baja en una atmsfera de humedad relativa
elevada, el agua pasar desde la fase gaseosa al alimento. Es posible que transcurra mucho
tiempo para que la masa del alimento aumente su actividad de agua, pero puede haber una
condensacin en las superficies que origine zonas localizadas de elevada actividad de agua, en
estas zonas en que los propgulos han permanecido viables, pero que no han sido capaces de
crecer, pueden ahora germinar y crecer.

El almacenamiento de frutas y hortalizas frescas requiere un control muy cuidadoso de la


humedad relativa. Si esta es excesivamente baja, en algunas hortalizas disminuir el contenido
de agua y se mustiarn. Si es excesivamente elevada, puede haber condensacin y es posible
que se inicie su alteracin microbiana.

2.3.2.2 TEMPERATURA.

Los microorganismos crecen dentro de una amplia escala de temperaturas. A presin


atmosfrica puede haber crecimiento microbiano dentro de un intervalo de temperatura
comprendido aproximadamente desde -8 hasta 100 C. La exigencia ms importante es que el
agua se encuentre en estado lquido y por tanto disponible para mantener el crecimiento. Ningn
organismo ha sido capaz de crecer en todas las temperaturas de este intervalo; las bacterias
normalmente se limitan a crecer en una escala de temperaturas en torno a los 35 C, mientras
que los mohos lo hacen con temperaturas algo inferiores a los 30C.

Cada microorganismo exhibe unas temperaturas mnimas, mximas y ptimas de crecimiento.


Estas temperaturas van a ser muy tpicas de un determinado microorganismo y van a estar
influidas por el pH, la Aa y la disponibilidad de nutrientes.

Sobre la base de las temperaturas de crecimiento, los microorganismos pueden ser clasificados
en varios grupos fisiolgicos (tabla 7).

Tabla 7. Temperaturas cardinales correspondientes al crecimiento microbiano


En microbiologa de los alimentos, los organismos mesfilos y psicrtrofos generalmente son de
vital importancia. Los mesfilos con temperatura ptima en torno a 37 C con frecuencia son de
origen humano o animal, e incluyen algunos de los ms importantes patgenos trasmitidos por
los alimentos como, Salmonella, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens.

Por regla general a su temperatura ptima crecen ms rpido que los psicrtrofos y por ello, la
alteracin de los productos perecederos o almacenados en el intervalo de temperaturas
correspondientes al crecimiento de los mesfilos es ms rpida que su alteracin en condiciones
de refrigeracin.

Figura 4: factores ambientales y crecimiento microbiano

3. MICROBIOLOGIA PREDICTIVA
Qu es y cmo surge la microbiologa predictiva?
La microbiologa predictiva dio sus primeros pasos a principios de los aos 90 y desde
entonces ha ido evolucionando para evaluar cuantitativamente cul es el
comportamiento (crecimiento, supervivencia o inactivacin) de microorganismos en los
alimentos en los diferentes momentos del proceso, envasado y distribucin, lo que
ayuda a optimizar dichos procesos, desarrollar tratamientos de inactivacin, nuevas
formulaciones de productos y condiciones de conservacin y envasado ms
seguras. Hoy da es una disciplina cientfica establecida y reconocida. Para generar un
modelo predictivo es necesario obtener un conjunto de datos experimentales que sern
utilizados para obtener un modelo matemtico que relaciona los parmetros respuesta
del microorganismo, como por ejemplo, la velocidad de crecimiento, con los factores
encontrados en los alimentos (pH, Aw, Temperatura, etc). La microbiologa predictiva
describe las distintas respuestas microbianas de los alimentos a los diferentes ambientes.
El control microbiolgico de los alimentos y de los factores que influyen en su deterioro
en cualquier punto de la cadena alimentaria cuenta con la microbiologa predictiva. Esta
disciplina, conocida en algunos sectores tambin con el nombre de ecologa microbiana
de los alimentos, describe las distintas respuestas microbianas de los alimentos a
distintos ambientes a partir de modelos matemticos y otros mtodos numricos y
estadsticos. Los factores que influyen en la contaminacin de alimentos son varios. Por
un lado, interviene la temperatura, el pH o la actividad de agua. La mayora de
patgenos no crecen por debajo de ciertas temperaturas y su modo de actuar es distinto
tambin en funcin del nivel de pH del alimento (cidos o alcalinos) y de su estructura
(mayor o menor concentracin de agua). Con la microbiologa predictiva se establece
un sistema de control microbiolgico que puede utilizarse en cualquier punto de la
cadena de produccin, desde la granja a la mesa. Uno de los principales objetivos de
este sistema es predecir qu puede suceder durante el almacenamiento o el procesado de
alimentos.

Figura. Teora de los salto de obstculos


VENTAJAS DE LA MICROBIOLOGIA PREDICTIVA
Una de las principales ventajas de la aplicacin de modelos predictivos es la versatilidad
y flexibilidad que proporcionan, siendo una herramienta de gran utilidad para
fabricantes de alimentos a la hora de:
Asegurar la calidad y seguridad alimentaria
Tomar decisiones sobre el diseo y la composicin de nuevos productos (nuevas
formulaciones de alimentos)
Estimar la vida til de los alimentos, en coherencia con la legislacin aplicable
y, por lo tanto, poder predecir y actuar sobre el deterioro de los alimentos. Los
modelos predictivos microbiolgicos son la base que se utiliza en los anlisis
cuantitativos de riesgos.
El diagnstico microbiolgico est basado en tcnicas de laboratorio que requieren un
tiempo asociado al crecimiento de los microorganismos, el cual tiene un impacto
desfavorable en la toma de decisiones, especialmente en la industria. El tiempo
requerido para la revitalizacin de las clulas y su recuento a travs de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC), es de al menos 48 horas. Adems, para la identificacin
de patgenos es comn recurrir a pruebas bioqumicas o de medios selectivos, lo cual
conduce a esperar das o incluso semanas para obtener resultados. Por tal motivo se han
desarrollado mtodos rpidos para obtener resultados en menor tiempo, entre los cuales
estn los propuestos por la Microbiologa Predictiva. Puede ser utilizada para modelar el
crecimiento, sobrevivencia o muerte de los microorganismos en funcin de los
principales factores de conservacin de alimentos, especialmente cuando estos factores
son utilizados de manera conjunta en los llamados mtodos combinados de
conservacin. En otras referencias, se sita el inicio del uso de la Microbiologa
Predictiva en la dcada de 1930, cuando Scott estableci que el conocimiento de la
velocidad de crecimiento de ciertos microorganismos a diferentes temperaturas era de
vital importancia para los estudios sobre el deterioro de la carne fresca.

La industria alimentaria est creando continuamente nuevos hbitats para los


microorganismos mediante el diseo y reformulacin de alimentos, atendiendo a la
demanda de productos ms frescos, naturales y sin conservantes artificiales. La
obtencin de estos nuevos productos supone en muchos casos un reto para las empresas
que deben satisfacer a consumidores cada vez ms exigentes en cuanto a la calidad
sensorial y funcionalidad de los alimentos, pero a su vez asegurando que el producto en
su conjunto posee las suficientes condiciones barrera frente al desarrollo de
microorganismos patgenos y alterantes. Conocer cmo afectan los cambios en la
composicin de los alimentos, en la seguridad de los mismos y en su estabilidad durante
el almacenamiento es bsico. Los modelos predictivos son una manera rpida y eficaz
de evaluar el potencial de crecimiento de microorganismos. Los modelos predictivos en
el campo de la microbiologa en ordenadores permiten estimar la tasa de crecimiento
microbiano y cmo se producir el desarrollo de un microorganismo particular bajo
condiciones especficas. Algunas de las herramientas desarrolladas son un software para
predecir el deterioro e inocuidad de productos del mar (SSSP), un sistema capaz de
predecir la vida til y el crecimiento bacteriano de Listeria monocytogenes en estos
productos, as como mtodos para realizar una evaluacin cuantitativa del riesgo (ECR),
destinado a la evaluacin de riesgos asociados con la contaminacin microbiana de los
alimentos.
3.1. CLASIFICACION DE LOS MODELOS PREDICTIVOS
Los modelos predictivos se clasifican en funcin de su complejidad como primarios,
secundarios y terciarios. A continuacin se presenta una breve descripcin de
estos tres tipos de modelos.
A) Modelos primarios: Los modelos primarios se ocupan de la descripcin de
los cambios del nmero microbiano (crecimiento, multiplicacin,
inactivacin), en funcin del tiempo. Para la cuantificacin de los
microorganismos se pueden incluir Unidades Formadoras de Colonias (UFC),
biomasa, medidas de absorbancia, o niveles de los metabolitos
producidos.Muchos de los modelos primarios que se han desarrollado hasta
ahora, son modelos que determinan la cantidad de poblacin microbiana. En
estos modelos, el desarrollo de un nmero total de clulas de una
poblacin es descrito por un sencillo conjunto de parmetros: mximo valor
de crecimiento (A), velocidad de crecimiento (m) y tiempo de latencia (A). La
bibliografa sugiere que la suma del comportamiento de clulas de manera
individual es igual al de la poblacin, y esto es lo que lleva al desarrollo de
enfoques ms mecansticos para la Microbiologa Predictiva. Lo anterior
conduce a las tcnicas de modelacin probabilstica, en las que los parmetros
del modelo estn casualmente distribuidos dentro de la poblacin total. Esto
significa que los parmetros del modelo son parte de una distribucin aleatoria,
lo cual puede representar la variabilidad biolgica entre las clulas individuales.
Los modelos de probabilidad se toman ms tiles cuando el tamao del inculo
es pequeo y el tiempo de latencia individual es altamente variable dentro de
esta pequea poblacin. Como ejemplos de modelos primarios se encuentran la
ecuacin de Gompertz, ecuacin Baranyi y Roberts y el Modelo lineal en tres
fases.
B) Modelos secundarios. Los modelos predictivos secundarios caracterizan los
parmetros que aparecen en los modelos primarios, en funcin de las
condiciones del medio, como la temperatura, pH, aw, etc., observndose la
interaccin entre dos o ms factores sobre el crecimiento microbiano.
Antiguamente, los modelos secundarios para el tiempo lag slo se referan al
efecto que presentaba la temperatura de incubacin; sin embargo, en la
actualidad han surgido modelos que incluyen otros factores relevantes como
las condiciones de pre- enriquecimiento. Otros autores han desarrollado
modelos secundarios independientemente del tiempo de generacin y el tiempo
de latencia, como por ejemplo enfoques polinomiales (Gibson et al., 1988;
Buchanan y Philips, 1990; Zaika et al., 1998) y enfoques de redes neuronales
artificiales de baja complejidad (Zwietering et al., 1994; Geeraerd et al.,
1998; Garca- Gimeno et al., 2002). Entre otros ejemplos de los modelos
secundarios estn la ecuacin de Arrhenius, los modelos de raz cuadrada y el
modelo de superficies respuesta (Buchanan y Klawitter, 1991).

C) Modelos terciarios:
Los modelos terciarios tienen varias formas, empezando por combinar los
dos primeros niveles de modelos (primario y secundario), basados en experimentos
de laboratorio. Un ejemplo representativo de este tipo de modelos es el "Pathogen
Modeling Program", creado y puesto a disposicin de la comunidad cientfica
gratuitamente por la USDA; dicho modelo permite importar una serie de datos de
temperatura para predecir la vida til. Otro ejemplo es el "Seafood Spoilage
Predictor" (Dalgaard et al., 2002), el cual incluye a microorganismos
deteriorativos especficos para alimentos del mar. Finalmente, los modelos
terciarios permiten incluso incorporar modelos predictivos en una red de
evaluacin de riesgos microbiolgicos, como por ejemplo el SERA ("Salmonella
enteritidis Risk Assesment") del USDA. Los modelos terciarios son informticos.

3.2. CONSTRUCCIN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS

La construccin de un modelo predictivo implica las siguientes etapas: seleccin de


cepas de microorganismos, generacin de datos, aplicacin de un modelo primario,
secundario o terciario y validacin del modelo aplicado. Las etapas iniciales de
este proceso son de fundamental importancia para la correcta aplicacin del mismo, por
lo que se describen a continuacin:
Seleccin de cepas de microorganismos.
Existen varios criterios que se emplean para elegir la cepa a utilizar para la construccin
de un modelo. Puede elegirse una cepa nica o una mezcla de diferentes cepas
(cocktail). Las mezclas de cepas estn siendo empleadas ampliamente en los modelos
predictivos, debido a que tienen una representacin ms real de la situacin que presenta
un alimento. Antes de elegir una cepa es muy importante poner en claro la intencin a
la que va dirigido el modelo, por ejemplo: El modelo se va a utilizar para predecir
el posible crecimiento de una especie de patgeno en particular, o es un modelo de una
flora de microorganismos deteriorativos de un alimento especfico?. El utilizar una cepa
que ya haya sido estudiada en otros experimentos cientficos o incluso con el propsito
de crear otros modelos, proporciona la ventaja de tener conocimientos sobre esa cepa en
particular. Por otro lado, la eleccin de una cepa aislada a partir de un alimento para el
cual se quiere generar el modelo, da la ventaja del conocimiento del producto.
Mtodo de recuento de clulas viables.
El mtodo ms utilizado para monitorizar el crecimiento de una poblacin bacteriana es
el recuento de clulas viables. Sin embargo, como se ha discutido anteriormente, el
anlisis microbiolgico convencional presenta varias limitaciones, entre las cuales el
tiempo requerido para la revitalizacin, enriquecimiento e incubacin de las muestras es
probablemente la ms importante. Adems, para la identificacin de un microorganismo
se requieren medios selectivos y pruebas bioqumicas, lo que puede demorar el
resultado por das o incluso semanas. Debido a estas limitaciones, ha sido necesario
recurrir al desarrollo de mtodos rpidos que permitan disponer de los resultados en
horas. Para la estimacin exacta de los parmetros de una curva de crecimiento son
importantes el nmero y la calidad de los recuentos hechos por expertos
tcnicos. Para facilitar el recuento del crecimiento microbiano se estn desarrollando y
estandarizando mtodos alternativos como citometria de flujo, turbidimetria,
impedanciometria, microscopa, entre otros. Al comparar con los recuentos viables, la
turbidimetria y la impedanciometria son considerados mtodos automticos, los cuales
permiten analizar un elevado nmero de experimentos, mientras que la citometria de
flujo y la microscopa permiten obtener informacin adicional, como puede ser el estado
fisiolgico de las clulas (Rasch,2004).
Mtodo de citometra de flujo.
La citometria de flujo permite la medicin de diversas caractersticas fsicas y qumicas
de clulas individuales en suspensin, proporcionando as una indicacin de la
heterogeneidad de una poblacin de clulas eucariotas y procariotas en cuestin de
minutos (Davey y Kell, 1996; Alvarez- Barrientos et al., 2000; Novo et al., 2000). Las
clulas individuales confinadas dentro de un chorro de agua pasan rpidamente por una
ventana de medicin, en la cual varios parmetros de millones de clulas por
segundo pueden ser medidos simultneamente con alta precisin (Vives- Rego et al.,
2000). La dispersin de la luz refleja el tamao y la estructura celular, mientras que las
mediciones de fluorescencia permiten determinar el contenido celular de cualquier
constituyente que pueda ser marcado con un tinte fluorescente (Walber et al., 1997). De
esta manera, la citometria de flujo combina la ventaja de ser una tcnica de clulas
individuales, con el poder de medir millares de clulas en corto tiempo. Los datos
resultantes no slo son un promedio de mediciones de clulas, sino tambin son una
distribucin de los parmetros medidos en las clulas. Con la citometria de flujo, la
posibilidad de medicin de una distribucin de datos da una estimacin de la
heterogeneidad de la poblacin microbiana y, de ese modo, tambin la posibilidad
de detectar subpoblaciones que, por ejemplo, son resistentes a un tratamiento bajo
ciertas condiciones de investigacin.

El uso de la citometra de flujo en Microbiologa Predictiva est limitado por los costos
de los equipos; sin embargo, existen reportes de su uso. Tal es el caso de las
investigaciones de Sorensen y Jacobsen (1997), quienes usaron citometra de flujo para
enumerar las clulas viables de Debaryomyces hansenii en diferentes
condiciones ambientales. Los datos de crecimiento fueron empleados para modelar el
tiempo de latencia (A) y la mxima velocidad de crecimiento (max), en funcin
de la temperatura, pH y concentracin de NaCl.
Mtodo de turbidimetra.
La turbidimetria es un mtodo empleado para estudiar el crecimiento bacteriano a travs
de mediciones de densidad ptica, lo que permite tener una secuencia del
crecimiento microbiano en tiempo real. La densidad ptica o absorbancia se ha utilizado
desde hace varios aos para medir la concentracin, y es expresada en masa, nmero o
longitud media celular de suspensiones bacterianas. El fundamento de la tcnica es que
las partculas pequeas difractan la luz, dentro de ciertos lmites, de forma proporcional
a su concentracin. Las mediciones se hacen con un fotmetro o espectrofotmetro. De
acuerdo con McMeekin et al. (1997), en la turbidimetria, el crecimiento microbiano est
relacionado con la turbidez del medio. Estos autores resaltaron las limitaciones del
mtodo, siendo la ms importante que un recuento viable slo puede hacerse si el
equipo est calibrado para relacionar la absorbancia con un nmero de microorganismos
dado (Me Meekin et al.,1997). Sin embargo, es posible identificar los parmetros de
crecimiento cuando el tamao del inculo est por debajo del umbral de deteccin.
Para este caso es necesario conocer los recuentos celulares iniciales y la ecuacin
de calibracin (Brand et al., 1997).
Mtodo TTD (tiempos de deteccin).
Este mtodo consiste en medir, despus de un tratamiento trmico establecido, la
probabilidad de no crecimiento de una poblacin de microorganismos en suspensin en
condiciones de cultivo determinadas. Se trata de un anlisis que permite evaluar el
nmero ms probable de supervivientes (mtodo indirecto). Este mtodo depende de
la temperatura y el tiempo de tratamiento para lograr un efecto fisiolgico (Rasch,
2004).
Mtodo de microscopa.
La microscopa permite estudios directos de clulas individuales, lo que hace posible
dar un seguimiento a la misma clula durante largos periodos de tiempo. La
microscopa ha ido ganado inters con el desarrollo de programas computacionales
como el de interferometra ptica y el anlisis de imagen. Una de las ventajas de este
mtodo es que permite estudiar sistemas slidos cuya situacin es muy parecida a la que
presentan los sistemas alimentarios (Rasch, 2004). Hay pocos reportes
bibliogrficos del uso de la microscopa en el modelado predictivo. Sin embargo,
existen comparaciones con el mtodo TTD (tiempos de deteccin) para la
determinacin de la fase de latencia de clulas de Listeria monocytogenes (Martnez et
al., 2005). Se ha observado que la microscopa tiene ventajas sobre la TTD, ya que es un
mtodo directo que permite la observacin visual de la primera divisin celular,
mientras que la TTD depende del tiempo para la deteccin, la tasa de crecimiento y la
extrapolacin regresiva a la clula individual. Adems, cualquier tratamiento que resulte
en ausencia de la divisin celular no ser detectable a travs del mtodo TTD (Wu et
al., 2000).
3.3. VALIDACIN DE LOS MODELOS
La validacin de los modelos predictivos puede hacerse de dos formas:
a) Validacin matemtica que verifica la precisin de los modelos generados.
b) Validacin en el alimento (sistema real), en la cual lo que se requiere es
demostrar que el modelo predice con exactitud el comportamiento de los
microorganismos durante el procesado, almacenamiento y distribucin
(Geeraerd et al., 2004).
Los modelos predictivos permiten identificar los puntos crticos de control en un
proceso en el que se ha implantado un programa de Anlisis de Riesgo y Control de
Puntos Crticos (ARCPC). Los modelos predictivos son herramientas educativas,
especialmente para personas no preparadas en el rea de Microbiologa de Alimentos,
porque a travs de ellos se demuestra la importancia de mantener condiciones de
almacenamiento apropiadas 01an Impe et al., 2005). El Modelo Matemtico, es un
anlogo de una realidad fsica, por lo general ms simple e idealizada, es decir, es una
abstraccin de la realidad.

La clasificacin de los modelos, aun muestran una falta de claridad, ya que ningn plan
tiene el pleno apoyo de la comunidad cientfica, sin embargo podemos elegir por
adelantado la combinacin ms adecuada de condiciones de stress para llegar a la
formulacin de un producto estable y as evitar la descomposicin de mi alimento.

3.4. PASOS PARA LA OBTENCIN DE UN MODELO PREDICTIVO DE


CRECIMIENTO
a) Eleccin de microbiota de inters: En una primera fase se deben de obtener
cultivos de los microorganismos o bien sus formas de resistencia (esporas)
objetivo del estudio, seleccionando los serotipos o cepas microbianas de mayor
importancia, aislados autoctonos, etc.
b) Determinacin del rango experimental:Para la realizacin del modelos es
necesario establecer las condiciones experimentales que definen el alcance del
modelo, o rango de prediccin, es decir, definir que parmetros (T; pH, Aw,
Concentracin de conservantes; atmosfera;..) y en qu magnitud sern
estudiados.
c) Diseo experimental:Una vez definidos los parmetros, es necesario definir las
combinaciones de factores que sern experimentalmente estudiadas y que
proporcionarn robustez estadstica para la obtencin de los modelos.
d) Eleccin del modelo primario:El modelo primario define el comportamiento
del microorganismo en las condiciones a los que est sometido y permite extraer
parmetros de crecimiento, inactivacin, produccin de toxina, alteracin del
microorganismo que se utilizan para definir el modelo.
e) Obtencin de datos experimentales:En esta etapa se generarn datos primarios
que proporcionan la base de los modelos. Es necesario obtener datos de cada una
de las condiciones a estudiar y que proporcionen una respuesta definida por
parte del microorganismo ante ellas.
f) Obtencin del modelo secundario:Los parmetros obtenidos a partir de la
modelizacin de datos experimentales en los modelos primarios, utilizan para
obtener un modelo secundario que define el efecto de los parmetros estudiados
sobre la evolucin del microorganismo y por tanto su respuesta a las condiciones
estudiadas.
g) Obtencin del modelo terciario:Por ltimo, se obtienen modelos terciarios que
sirven de interface entre los parmetros que definen el modelo y parmetros
respuesta del microorganismo, como puede ser el tiempo necesario para llegar a
una determinada concentracin en el alimento; produccin de toxina; rango que
permite asegurar estabilidad etc.

Direcciones web
FMM:
ComBase: http://www.ifr.ac.uk/ComBase/
PMP 6.1:
http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm
Seafood Spoilage Predictor (SSP)
http://ww.dfu.min.dk/micro/ssp