PRACTICA 13. DETERMINACIN DE Listeria monocytogenes.

Bacteriologa y Laboratorio Clnico.

Universidad de Santander (UDES).

Mayo 10 del 2017.

Bohorquez Valero, Luis Alfonso; Pinto Pinto, Silvia Lucia; Sandoval Pabon, Ludwing; Zambrano
Arguello, Angie Daniela.

luisalfonsobv@hotmail.com; silviapinto500@gmail.com; ludwing.sandoval@hotmail.com;

adza1796@gmail.com

Introduccin Fecha de toma de muestra:

Nombre del producto:
Listera monocytogenes (LM) es un Marca:
patgeno emergente. Los procesos que Color:
originan estas bacterias pueden ser Temperatura:
muy graves, pudiendo, en fetos, pH:
neonatos, nios y ancianos, ocasionar Tipo y estado de envase:
secuelas que perduran toda la vida del Direccin de la empresa:
paciente e incluso la muerte. LM es una Nmero de registro sanitario:
bacteria ampliamente difundida en la Nmero de lote:
naturaleza. Su presencia en los Razn por la cual se solicita el
alimentos est determinada por su anlisis:
extensa distribucin en el ambiente -
tierra, aguas servidas, materia fecal,
vegetacin, ensilados y entorno de la Metodologia
produccin de alimentos - lo que
confiere una importante oportunidad
para contaminarlos. La listeriosis es
una enfermedad de transmisin
alimentaria que se presenta por casos
espordicos en brotes. A comienzos
de la dcada de los 80, LM se
manifest como un patgeno
emergente por alimentos. Su revelacin
obedece al uso extensivo de la
refrigeracin por el hombre. La
conservacin y la industrializacin de
los alimentos trajeron como
consecuencia algunos cambios que
dieron lugar a brotes masivos por
Listeria en lugar de casos espordicos.
La contaminacin con LM preocupa
tanto a profesionales de la sanidad
como a industriales y gobiernos, por la
elevada tasa de mortalidad de la
enfermedad.

Etiquetado de la muestra
Resultados

Discusin
Temas para revisin
Fundamento de medios:
Caldo LEB:
Medio de cultivo utilizado para el
enriquecimiento de Listeria spp.
El medio de cultivo contiene los
nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano. Las sales de
fosfato, forman un sistema buffer que
evitan cambios bruscos de pH y as se
favorece el desarrollo de Listeria spp.
El piruvato de sodio permite recuperar
clulas injuriadas presentes en la
muestra.
Agar Oxfor:
 Medio de cultivo, que con
el agregado de
antimicrobianos, permite el crecimiento
y aislamiento selectivo de Listeria spp.
Medio de cultivo selectivo y diferencial,
que contiene los nutrientes necesarios
para el adecuado desarrollo bacteriano
de Listeria spp.
Es diferencial para el desarrollo de
Listeria spp, debido a que el producto
de hidrlisis de la esculina en presencia
de iones Fe3+ forma un compuesto
fenlico de color negro. La selectividad
para Listeria spp., se obtiene por el
agregado del Suplemento Selectivo
para Oxford Modificado Agar Base,
debido a que contiene antibiticos que
inhiben total o parcialmente el
desarrollo de la flora acompaante
presente en la muestra.
Agar Palcam:
BD PALCAM Listeria Agar (agar
PALCAM BD para Listeria) es un medio
selectivo de diferenciacin para el
aislamiento y la deteccin de Listeria
monocytogenes y otras especies de
Listeria a partir de alimentos y
muestras clnicas.
El agar PALCAM se basa en la frmula
de van Netten et al, quienes
desarrollaron este medio selectivo y
diferencial para su uso en el
aislamiento y recuento de las especies
de Listeria a partir de muestras
alimentarias. APHA y AFNOR
recomiendan utilizar el medio PALCAM
para detectar Listeria monocytogenes
en alimentos, y la International Dairy
Federation lo recomienda como medio
en placa adicional para la deteccin de
las especies de Listeria en la leche y
los productos lcteos. Health Canada
tambin recomienda el medio PALCAM
para la deteccin de L. monocytogenes
en alimentos y muestras ambientales,
as como lo recomienda OADC para la
deteccin del organismo en los
alimentos. Asimismo, se puede utilizar
para el aislamiento de L.
monocytogenes a partir de
muestras clnicas.
En BD PALCAM Listeria Agar, la base
de agar sangre Columbia suministra los
nutrientes y cofactores necesarios para
el crecimiento de Listeria. Se logra
selectividad en el medio mediante la
presencia de cloruro de litio, sulfato de
polimixina B, acriflavina-HCI y
ceftazidima, que suprime el crecimiento
de la mayora de los organismos
diferentes de las especies de Listeria
presentes en alimentos y muestras
clnicas. La concentracin de
ceftazidima se reduce de 20 mg/L a 8
mg/L para mejorar el crecimiento y la
recuperacin de Listeria. La
diferenciacin en el medio PALCAM se
basa en la hidrlisis de esculina y la
fermentacin del manitol. Todas las
especies de Listeria hidrolizan la
esculina, como lo demuestra el
oscurecimiento del medio. El producto
de la hidrlisis, la esculetina (=6,7-
dihidroxicumarina), reacciona con iones
frricos hasta producir un complejo de
marrn a negro. A veces pueden crecer
en estos medios organismos diferentes
de Listeria, tales como los estafilococos
o enterococos. El manitol y el indicador
de pH, el rojo fenol, se han aadido
para diferenciar las cepas
fermentadoras de manitol de las
especies de Listeria. La fermentacin
de manitol se demuestra por un cambio
de color del medio de rojo a amarillo
debido a la produccin de cidos.
Agar Tripticasa de Soya:
El TSA Agar es un medio de uso
general que permite el crecimiento
tanto de microorganismos exigentes
como no exigentes, que incluyen
bacterias aerobias y anaerobias.
Permite visualizar reacciones
hemolticas que producen muchas
especies bacterianas. Tiene por base
una fuente proteica (digeridos trpticos,
digeridos proteicos de soja) con una
 pequea cantidad de
hidratos de carbono
naturales, cloruro sdico y 5% de
sangre. Es un medio recomendado
para la deteccin y recuento de una
amplia gama de microorganismos. La
presencia de Lectina y Tween permite
neutralizar la actividad antibacteriana,
facilitando la investigacin de los
grmenes en productos o superficies
que contengan: Aldehdos, derivados
fenlicos, o amonio cuaternario. La
aportacin de casena y peptonas de
soja al Agar de Tripticasa-soja hace el
medio muy nutritivo por el suministro de
nitrgeno orgnico, particularmente
aminocidos y pptidos de cadena ms bacteriano capaz de sintetizar
larga. La presencia de estas peptonas
en el medio permite el cultivo de una
gran variedad de grmenes aerobios y
anaerobios que crecen rpidamente,
as como los del gnero Candida.
Tambin permite el crecimiento de
algunos grmenes exigentes como
estreptococos, pneumococos, Brucella,
corinebacterias, Erysipelothrix y
Pasteurella.
Listeria Monocytogenes y su
importancia en la industria
alimentaria:
El gnero Listeria comprende un grupo
de bacterias Gram-positivas
relacionadas con otras de los gneros
Bacillus, Clostridium, Enterococcus,
Streptococcus y Staphylococcus. Los
microorganismos del gnero Listeria
son bacilos anaerobios facultativos que
no forman esporas ni contienen
cpsula y se aislan de suelos, agua,
efluentes, numerosos alimentos y de
las heces de personas y animales. Los
rumiantes domsticos probablemente
juegan un gran papel en el
mantenimiento de Listeria spp. en el
medio rural, mientras 2-10% de las
personas son portadoras de LM en
heces sin, aparentemente, efectos
adversos en su salud. LM puede
convertirse en endmico en las plantas
de procesado de alimentos.
Adems del reconocimiento de
LM como un patgeno
emergente de origen alimentario, los
aos 80 marcaron tambin el inicio de
investigaciones acerca de su virulencia.
El estudio de su actividad hemoltica,
clsicamente considerada un factor de
virulencia de las cepas patgenas,
permiti la identificacin del gen
responsable de dicha actividad (hly) y
de su papel para evitar la destruccin
de Listeria en el interior de fagosomas
y de su proliferacin bacteriana
intracelular. Este gen no solamente fue
el primer factor de virulencia de Listeria
identificado sino, tambin, el primer gen
productos que permiten la
supervivencia de bacterias en el interior
de las clulas eucariotas del
hospedador. La identificacin del gen
hly permiti rpidamente su
localizacin en el genoma de LM y la
caracterizacin gentica de los genes
prximos en un fragmento gentico de
9,4 kb asociado a la virulencia de LM y
con funciones esenciales para su
supervivencia intracelular. Dicho
fragmento gnico posee los genes inlA
e inlB involucrados en la produccin de
internalinas (IntA e IntB) que facilitan la
invasin de macrfagos y hepatocitos,
de los genes hly y plc que codifican la
listeriolisina O (LLA) y la fosfatidil
inositol fosfolipasa C (PI-PLC)
importantes en la lisis vacuolar y
divisin intracelular, el gen actA
productor de ActA y que facilita el
movimiento intracitoplsmico de LM
debido a la polimerizacin de la actina,
de los genes plcB productor de una
fosfolipasa C (PCPLC) que hidrolizada
por la metaloproteinasa del gen mpl
para ser funcional facilita la protrusin,
lisis celular y fagocitosis por otra clula
eucariota y por el gen prfA cuya
protena PrfA regula el opern completo
de virulencia de LM.
LM es un microorganismo ubicuo. Se
encuentra en el intestino de animales y
 personas que actan
como portadores y,
tambin, ampliamente distribuido en
ambientes naturales como suelo, agua,
efluentes, pastos y ensilados dnde
sobreviven durante perodos extensos
de tiempo. Tambin se encuentra en el
suelo, paredes, techos y equipos de
plantas de procesado de alimentos y se
ha aislado de una gran variedad de
alimentos listos para consumo (RTE)
de origen vegetal, lcteo, marino o
crnico y en ensaladas y frutas. Los
alimentos listos para consumo (RTE) se
consideran como aqullos preparados
para su consumo directo sin necesidad
de cocinado u otros tratamientos
culinarios que reduzcan a un nivel
aceptable la presencia de
microorganismos preocupantes.
Responsable de toxiinfecciones
alimentarias (TIA), sino tambin el
papel de algunos alimentos en la
transmisin de la enfermedad. Por ello,
los alimentos ms comnmente
asociados a brotes de listeriosis son
los: (i), alimentos listos para consumo
(RTE) de origen vegetal, lcteo, crnico
y de pescados ahumados, (ii),
alimentos que se mantienen durante
mucho tiempo en refrigeracin (iii),
alimentos no sometidos a tratamientos
listericidas durante su conservacin y
procesado, (v), alimentos con riesgo de
contaminacin tras su procesado (vi),
alimentos cuyos ingredientes facilitan el
desarrollo de LM y (vii) alimentos
consumidos por individuos
inmunocomprometidos y mujeres
embarazadas. En el caso de derivados
crnicos picados y en los emulsionados
de mucha preparacin y manejo, la
posible contaminacin con LM es muy
elevada. En los derivados crnicos
fermentados, posiblemente, la
presencia de LM es menor aunque su
supervivencia sea posible.
Tcnicas rpidas y moleculares:
Medida de la biomasa microbiana:
Puesto que el mtodo
convencional de recuento de
microorganismos en placa es muy
laborioso, se han desarrollado mtodos
para estimar de manera indirecta el
nmero de microorganismos presentes
en los alimentos. El desarrollo de
dichos mtodos est ntimamente
ligado al de la instrumentacin
necesaria para detectar las seales
relacionadas con el crecimiento
microbiano. El principio en el que se
basan estos sistemas es que dichas
seales (niveles de ATP, enzimas
especficas, pH, impedancia,
conductancia y capacitancia elctrica,
etc.) se modifican paralelamente con el
crecimiento microbiano.
Todas las clulas vivas contienen ATP,
que se degrada muy rpidamente
mediante autolisis al morir las clulas.
En presencia de la enzima luciferasa y
el sustrato luciferina (procedentes de la
lucirnaga), oxgeno y magnesio, el
ATP facilita el paso de la luciferina a
oxiluciferina, generndose luz
(bioluminiscencia) que puede ser
detectada mediante un luminmetro.
Sistemas miniaturizados y kits de
diagnstico
Los sistemas miniaturizados surgen a
partir del concepto de la placa
microtituladora (96 pocillos, formato
8x12), que permite reducir el volumen
de reactivos y medio a emplear en los
ensayos, as como estudiar en un
formato manejable el efecto de un
compuesto sobre un gran nmero de
aislados o el de una serie de
compuestos sobre un aislado
determinado.
Esta lnea de investigacin ha permitido
desarrollar algunos de los medios de
cultivo selectivos que se encuentran en
el mercado actualmente. Entre los
sistemas miniaturizados de
identificacin microbiana disponibles en
la actualidad, basados en el
metabolismo de sustratos especficos
 por parte de los
microorganismos y su
deteccin mediante diversos sistemas
indicadores, destacan los siguientes:
tarjetas desechables para la
identificacin sencilla de colonias
sospechosas mediante pruebas
bioqumicas rpidas (O.B.I.S., Oxoid);
galeras que permiten la identificacin
de ms de 800 especies de bacterias y
levaduras (API, bioMrieux); tubos de
plstico con compartimentos que
contienen agar con distintos sustratos y
con una aguja en su interior que
posibilita la inoculacin del tubo de
forma rpida y sencilla a partir de una
nica colonia (BBL Enterotube y
Oxi/Ferm Tube, BD); y soportes
plsticos con pocillos de fcil
inoculacin que contienen sustratos
cromognicos y/o fluorog- nicos en
estado deshidratado que se rehidratan
en contacto con la muestra (BBL
Crystal, BD; RapID systems y MicroID,
Remel; Biochemical ID systems,
Microgen). Uno de los sistemas
miniaturizados y automatizados ms
conocidos y sofisticados es el sistema
VITEK (bioMrieux) que, basndose en
cambios de color de los sustratos o en
la produccin de gas de los cultivos
inoculados en los pocillos de una
tarjeta plstica que contiene los
sustratos bioqumicos en forma
deshidratada, puede identificar un
cultivo tpico de Escherichia coli en 2-4
h. Una rapidez similar en la obtencin
de resultados puede obtenerse con el
sistema Biolog (AES Chemunex) que
detecta la capacidad de los
microorganismos para oxidar 95
fuentes de carbono.
Mtodos inmunolgicos
Los mtodos inmunolgicos se basan
en la reaccin especfica entre un
antgeno y un anticuerpo policlonal o
monoclonal. En microbiologa de los
alimentos, el mtodo inmunolgico ms
empleado para la deteccin de
microorganismos o sus toxinas es el
ensayo ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) tipo
sndwich. En los ltimos aos, se han
desarrollado sistemas que permiten
realizar el ensayo ELISA de manera
automatizada, dirigidos
fundamentalmente a la deteccin de
Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria
monocytogenes, Campylobacter spp. y
toxinas estafiloccicas (Assurance EIA
y TRANSIA PLATE, Biocontrol; TECRA
VIA, Biotrace International; Salmonella
UNIQUE, Tecra; Detex, Molecular
Circuitry Inc.)
Mtodos genticos
A diferencia de los mtodos citados en
las secciones anteriores, que detectan
caractersticas fenotpicas sujetas de
manera natural a variacin, los
mtodos genticos se dirigen a la
deteccin de caractersticas celulares
mucho ms estables contenidas en los
cidos nucleicos. Una tcnica para
detectar dichas caractersticas en
ausencia de instrumentacin
especializada es la hibridacin de
cidos nucleicos. Los ensayos
comerciales actuales emplean sondas
genticas (oligonucletidos sintticos)
marcadas enzimticamente que, tras
hibridar con regiones especficas del
ARN ribosmico (una clula bacteriana
puede contener hasta 10.000 copias de
ARN ribosmico frente a una nica
copia de ADN cromosmico), catalizan
una reaccin que da lugar a un
producto coloreado a partir de un
sustrato cromognico, lo que es
indicativo de la presencia del
microorganismo en el alimento
(GeneQuence, Neogen).
Bibliografa
1. Caldo de aislamiento primario
Salmosyst:
 http://www.merckmillipore.com/
CO/es/product/Salmosyst-Broth-
base,MDA_CHEM-110153?
ReferrerURL=https%3A%2F
%2Fwww.google.com.co%2F
2. Agar Oxford:
http://www.britanialab.com.ar/es
panol/oxfordmodagarbase.htm

3. Agar Palcam:
https://www.bd.com/europe/regu
latory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-
PA-254539.pdf

4. Agara TSA:
http://www.laanunciataikerketa.c
om/trabajos/fregasuelos/medios
.pdf

5. Listeria Monocytogenes y su
importancia en la industria
alimentaria:
http://www.elika.net/datos/riesgo
s/Archivo21/Listeria.pdf

6.