2016

INFORME DE LABORATORIO
CUANTIFICACIN DE PROTENAS Y AZCARES REDUCTORES

ANA SOFA CRDOBA

PROFESORADO EN QUMICA
M.U.N 931
1 Informe DE LABORATORIO
Cuantificacin de protenas y azcares reductores

Alumna: Crdoba, Ana Sofa

Carrera: Profesorado en Qumica
M.U.N: 931
Plan: 2005

CUANTIFICACIN DE PROTENAS MTODO DEL

CIDO BICINCONNICO (BCA)

Introduccin:

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula,

ellas constituyen ms del 50% del peso seco de la clula. Estimar la concentracin
de protenas es necesario no solo en laboratorios de investigacin, sino tambin
en la industria alimentaria, farmacutica y biotecnologa en general. Existen
muchos mtodos para la determinacin de protenas. La determinacin de
protenas por BCA es un mtodo altamente sensible. Este mtodo combina la
reaccin de las protenas con Cu++ en un medio alcalino (produciendo Cu+) con
un reactivo para la deteccin de Cu+ altamente selectivo y sensitivo como el cido
bicinconnico.

Fundamento:

El cido bicinconnico, en la forma de su sal de sodio soluble en agua, es un

reactivo altamente sensible y especfico para el ion Cu+, con el que forma un
complejo color prpura intenso en medio alcalino. La cuantificacin por BCA
combina la reaccin de Biuret (reaccin de la protena con Cu++ en un medio
alcalino para producir Cu+). El producto de esta reaccin presenta un color
prpura mencionado anteriormente, formado por la interaccin de dos molculas
de BCA con el ion Cu+, es soluble en agua y exhibe una fuerte absorbancia a una
longitud de onda de 562 nm. Esto permite la cuantificacin espectrofotomtrica
de protena en solucin acuosa por medio de una curva de calibracin.

La curva de calibracin es una representacin grfica en un eje de

coordenadas, de la Absorbancia (eje de ordenadas: y) frente a la Concentracin
(eje de abscisas: x). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida
(soluciones patrn) y se determinan sus absorbancias, construyndose la curva
de calibrado que es una recta. La concentracin de una solucin problema
(desconocida), se averigua por interpolacin de la absorbancia de la solucin de
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores
la muestra en la curva de calibracin, o a travs de la ecuacin de la recta (y =
mx + b), donde:

absorbancia (y) = constante (m). concentracin (x) + absorbancia del blanco (b)

Procedimiento: (no se realizaron blancos)

Se prepararon 5 soluciones patrones de Albmina Srica Bovina (BSA) de

distintas concentraciones, y se dej encubar las mismas por espacio de 30
minutos a 37C. Posteriormente, se procedi a construir una curva Excel
midiendo los valores de densidad ptica (DO) de cada una de estas soluciones por
duplicado. A esta curva obtenida en Excel se le realiz el tratamiento matemtico
del mtodo de regresin lineal para obtener la ecuacin de la recta, fundamental
para calcular la concentracin de protenas de las muestras problemas.

Adems, tambin se prepararon las soluciones de las muestras problemas.

Se prepar 5 mL de reactivo de trabajo mediante el tratamiento de 4,9 mL de
reactivo A y 0,1 mL de reactivo B. Luego se tom 25 L de muestra problema y
se adicion a tubos eppendorf y se adicion 200 L de reactivo de trabajo y se
mescl en vortex. En este procedimiento no se realizaron blancos. A las
soluciones de muestra problema se las llev a un bao por tiempo de 30 minutos
a 37C. Posteriormente, se procedi a realizar la lectura de DO de las mismas
por duplicado. Las muestras provenan de cultivos de microorganismos de
PROIMI.
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores

Resultados:

Curva Estndar Protenas

Concentracin DO DO promedio
Estndares
(g/mL) (562 nm) (562 nm)
0,209
STD 1 62,5 0,205
0,201
0,289
STD 2 125,0 0,2925
0,296
0,474
STD 3 250,0 0,4785
0,483
0,789
STD 4 500,0 0,787
0,785
1,36
STD 5 1000,0 1,365
1,37

Curva de calibracin para protenas a 562 nm

1,6

1,4

1,2
DO (Densidad ptica)

0,8
y = 0,0012x + 0,1487
0,6
R = 0,998
0,4

0,2

0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentracin de protenas (g/mL)
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores
Seal obtenida para las muestras
Concentracin Concentraciones x10 Desvo Concentracin
Muestras DO
(g/mL) (g/mL)* estndar promedio (g/mL)
1125,25 1,499
11252,50
M1 17,68 11265,00
1127,75 1,502
11277,50
1103,58 1,473
11035,83
M2 695,32 10544,17
1005,25 1,355
10052,50
1095,25 1,463
10952,50
M3 47,14 10985,83
1101,92 1,471
11019,17
1012,75 1,364
10127,50
M4 164,99 10244,17
1036,08 1,392
10360,83
1003,58 1,353
10035,83
M5 117,85 10119,17
1020,25 1,373
10202,50
En esta determinacin no se realizaron blancos.
*Como a las muestras se las diluy en una relacin 1:10, las concentraciones promedio se
deben multiplicar por un factor de 10 para obtener la concentracin final de protenas en las
muestras reales

Tiempo Concentracin
(d) de protenas (g/mL)
2 11265,00
4 10544,17
6 10985,83
8 10244,17
10 10119,17

Comparacin entre los resultados

obtenidos
12000
Concentracin de protenas (g/mL)

10000
8000
6000
4000
2000
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (d)
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores

CUANTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES

MTODO DEL DNSA

Introduccin:

Los carbohidratos son las sustancias ms ampliamente distribuidas en la

naturaleza, despus del agua. En todos los seres vivos se encuentran presente
los carbohidratos, ya que la ribosa y la desoxirribosa son parte de su material
gentico. En la clula, los carbohidratos cumplen una funcin estructural y
energtica.

Desde el punto de vista qumico, los carbohidratos pueden definirse como

polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas y sus derivados. Los azcares
reductores son aquellos que se encuentran en equilibrio con su forma de cadena
abierta pudiendo reducir a reactivos especficos como el reactivo de Tollens. Por
lo tanto, existen varios mtodos de anlisis de este tipo de hidratos de carbono.
Uno de ellos es el mtodo del DNSA.

Fundamento:

El mtodo DNSA (tcnica de Miller) es una tcnica colorimtrica que

emplea el cido 3,5-dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes
en una muestra. Esta tcnica sirve para cuantificar los azcares reductores
producidos durante una fermentacin. El reactivo DNSA reacciona por medio de
una reaccin redox con los azcares reductores generando un producto coloreado.
La intensidad del color se puede medir por mtodos espectrofotomtricos, y es
proporcional a la concentracin de azcares reductores. La medicin de la
densidad ptica se realza a una longitud de onda de 640 nm utilizando una curva
de calibracin.

Procedimiento:

Se prepararon soluciones patrones de glucosa a distintas concentraciones,

a las que se les medi la DO a 640 nm. Luego se prepararon soluciones de las
muestras problemas. A 500 L se le adicion 50 L de HCl 1N, se mezcl en vortex
y se llev a ebullicin durante 10 minutos. Luego se dej enfriar a 4C por 10
minutos y se adicion 50 L de NaOH 1N y 750 L de reactivo DNSA (10 g de
cido 3,5-dinitro saliclico, 2 g fenol, 0,5 g sulfito de sodio, 200 g tartrato de sodio
y potasio en 500 mL de NaOH 2% (p/v), llevado a 1 L de agua destilada). Luego
se lleva la mezcla a ebullicin por 15 minutos y se detiene la reaccin a 4C por
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores
10 minutos. Finalmente se lee la DO. Se realiz un blanco con 500 L de agua
destilada para reemplazar el volumen de muestra y se procede a tratarla igual a
las soluciones incgnitas.

Resultados:

Curva Estndar Azcares

Concentracin DO (640 DO
(g/L) nm) promedio
0,050
Blanco 0,0 0,051
0,051
0,143
SDT 1 0,1 0,142
0,141
0,204
STD 2 0,2 0,215
0,225
0,468
STD 3 0,4 0,468
0,468
0,667
STD 4 0,6 0,665
0,663
0,834
STD 5 0,8 0,831
0,828
1,010
STD 6 1,0 0,991
0,972
7 Informe DE LABORATORIO
Cuantificacin de protenas y azcares reductores

Curva de calibracion para azcares a 640nm

1,200

DO (Densidad ptica)
y = 0,9678x + 0,0517
1,000
R = 0,9952
0,800

0,600

0,400

0,200

0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Concentracin de azucar (g/mL)

Seal obtenida para las muestras

Concentraciones Concentraciones Desvo Concentracin
Muestra DO
(g/mL) x 50 (g/mL)* estndar promedio (g/mL)
0,372 0,33 16,55
M1 0,77 16,01
0,351 0,31 15,46
0,330 0,29 14,38
M2 0,22 14,22
0,324 0,28 14,07
0,334 0,29 14,58
M3 0,88 13,96
0,310 0,27 13,34
0,278 0,23 11,69
M4 0,95 12,36
0,304 0,26 13,03
0,337 0,29 14,74
M5 0,22 14,58
0,331 0,29 14,43
*Como a las muestras se las diluy en una relacin 1:50, las concentraciones promedio se
deben multiplicar por un factor de 50 para obtener la concentracin final de azucares en
las muestras reales

Tiempo Concentracin
(d) de azcares (g/mL)

2 16,01
4 14,22
6 13,96
8 12,36
10 14,58
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Cuantificacin de protenas y azcares reductores

Comparacin entre los resultados

obtenidos
18,00
Concentracin de azcares (g/mL)

16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (d)

Conclusiones:

Los resultados obtenidos en el anlisis de la concentracin de protenas en

las muestras problemas, arrojaron valores que distaban los esperados. En teora
la concentracin de protenas debera haber disminuido, pero los resultados
obtenidos no fueron estos, ya que descendan y luego ascendan, es decir que
presentaban una irregularidad.

En cuando al anlisis de las muestras de azcares reductores, estos se

aproximaron ms a lo esperado, que la concentracin disminuyera, a pesar de
que la concentracin de la muestra problema M5 tiene un aumento en relacin
con las dems.

Estas diferencias es los resultados obtenidos y aquellos esperados, pueden

deberse a errores en la preparacin de las soluciones en las muestras.