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OBSERVACIN E IDENTIFICACION

DE SALMONELLA SP. Y
ESCHERICHIA COLI EN ALIMENTOS
1 OBSERVACIN E IDENTIFICACION DE SALMONELLA SP. Y ESCHERICHIA COLI

ndice

OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 3
MARCO TERICO ............................................................................................................................ 4
Instrucciones ................................................................................................................................... 6
Morfologa colonial bacteriana en medios de cultivo. ................................................................ 9
PARTE EXPERIMENTAL............................................................................................................... 11
I. MATERIALES Y REACTIVOS .......................................................................................... 11
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 13
CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 17
ANEXOS........................................................................................................................................... 18

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2 OBSERVACIN E IDENTIFICACION DE SALMONELLA SP. Y ESCHERICHIA COLI

INTRODUCCION
En este laboratorio a desarrollase se ver la forma como se identifica a la
salmonella y a la Escherichia coli, cosa que es muy importante ya que en la
industria de productos crnicos como otras industrias alimentarias se identifica a
gran escala para determinar su calidad de buen producto.
Los productos crnicos, considerados como la principal fuente de protena para
los humanos, son tambin el vehculo ms frecuente en la produccin de
intoxicacin alimentaria, como consecuencia de un inadecuado sistema de
calidad higinico sanitario en los procesos de sacrificio y faenado animal. El
ganado sano alberga diversos patgenos tales como Escherichia coli,
Salmonella spp. y Listeria spp, entre otros, los cuales se encuentran
habitualmente como flora normal en tracto gastrointestinal, piel y pezuas . Los
tejidos internos de la carne en canal se consideran estriles, caracterstica que se
ve alterada si no se aplican las adecuadas prcticas de manufactura durante los
procesos de sacrificio y faenado de la canal, lo que conlleva a contaminacin con
suciedad, materia fecal y polvo, entre otros, situacin que es directamente
proporcional al uso de las normas higinico sanitarias en la planta de
procesamiento. Identificacin de Salmonella y Escherichia coli en manos y
guantes de manipuladores en planta de sacrificio y faenado.
E.coli y Salmonella spp son responsables de toxoinfecciones alimentarias
generadas a partir del consumo de productos crnicos contaminados, definiendo
stas como la ocurrencia de dos o ms casos de una enfermedad similar
producida por la ingestin de un alimento comn.

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OBJETIVOS

Identificar la presencia de Salmonella spp y Escherichia coli en la muestra a


analizar.

Evaluar la carga microbiana de un alimento (carne de res molida), y analizar


si la muestra se encuentra apta para el consumo humano segn la norma
sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e
inocuidad para alimentos y bebidas de consumo humano RM 591-2008
MINSA.

Reconocer el adecuado medio de cultivo y las condiciones de temperatura


requerida para el crecimiento microbiano de Salmonella Sp y Escherichia
coli.

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MARCO TERICO

ESCHERICHIA COLI
Es una de las especies bacterianas ms minuciosamente estudiadas, y no solamente por
sus capacidades patognicas, sino tambin como sustrato y modelo de investigaciones
metablicas, genticas, poblacionales y de diversa ndole. Forma parte de la familia
Enterobacteriaceae.

Ella est integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, mviles con flagelos
peritricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar
MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos
en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos,
reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporcin G+C de 39 a 59% en su
DNA. Se trata de bacterias de rpido crecimiento y amplia distribucin en el suelo, el
agua, vegetales y gran variedad de animales.
E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del nio, y establece
con el husped una relacin estable de mutuo beneficio. Como integrante de la flora
normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de
contaminacin fecal cuando est presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con
otros similares agrupados bajo la denominacin de "bacterias coliformes". Estas son
entero bacterias que pertenecen al gnero Escherichia y a otros relacionados como
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en comn la capacidad de
fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con produccin de cido y gas.
IDENTIFICACION DE E.COLI EN MACCONKEY

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SALMONELLA SPP.
1. Generalidades

El gnero Salmonella pertenece a la familia


Enterobacteriaceae. Son bacilos gram
negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 m, anaerobios
facultativos, no formadores de esporas,
generalmente mviles por flagelos pertricos
(excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa,
maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa
ni sacarosa. Son generalmente catalasa
positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos
a nitritos. Son viables en diferentes condiciones ambientales, sobreviven a la
refrigeracin y congelacin y mueren por calentamiento (mayor a los 70 C). El
serotipo de Salmonella est determinado por los siguientes tres tipos de antgenos:
el antgeno somtico (O), el antgeno flagelar (H) y el antgeno de virulencia (Vi).
Los antgenos somticos son lipopolisacridos componentes de la pared celular y se
han identificado 60 antgenos diferentes. Los antgenos flagelares son protenas
localizadas en el flagelo mvil. El antgeno de virulencia es un polisacrido
termolbil localizado en la cpsula. Antes del 1 de Julio de 1963 se utilizaban 3
especies de Salmonella: S. typhi, S. choleraesuis y S. enteritidis y la mayora de los
serotipos pertenecan a esta ltima especie. En la actualidad, todas las especies y
subgrupos anteriores de Salmonella y Arizona se consideran de la misma especie,
pero pueden separarse en 6 subgrupos. La nica excepcin la constituye S. bongori
que por estudios de hibridacin de ADN se constat que es una especie distinta. Por
lo tanto, existen 2 especies y 6 subespecies de S. entrica en el esquema actual
utilizado por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
a. Salmonella entrica:
S. entrica subespecie entrica (I): comprende la mayora de los serotipos
S. entrica subespecie salamae (II)
S. entrica subespecie arizonae (IIIa)
S. entrica subespecie diarizonae (IIIb)
S. entrica subespecie houtenae (IV)
S. entrica subespecie indica (VI)
b. Salmonella bongori (antes subespecie V)
La mayora de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre
caliente pertenecen a la subespecie I (entrica) y llevan un nombre relacionado con
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el lugar geogrfico donde fueron aisladas. Como las serovariedades no tienen nivel
taxonmico de especie, escapan al Cdigo Internacional de Nomenclatura
Bacteriana y por ello deben escribirse en letra tipo romano, no itlica, por ejemplo:
Salmonella entrica subespecie entrica serovariedad Typhimurium. Las
serovariedades de las subespecies restantes y S. bongori se designan con el nombre
de la subespecie seguido de la frmula antignica, por ejemplo: Salmonella
subespecie IV 50: b:- (S. entrica subespecie houtenae 50).
La serotipificacin es til para definir, monitorear y controlar brotes y epidemias.
Un segundo mtodo de clasificacin que se utiliza con frecuencia es el esquema de
Kaufmann-White. En este esquema, varios serotipos de Salmonella se clasifican
dentro de once serogrupos. Los mismos estn basados en un antgeno mayor y uno o
varios antgenos somticos menores. Recientemente se ha desarrollado un tercer
esquema de clasificacin basado en las tcnicas de hibridacin del ADN.

Agar Mc Conkey
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies
de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de
sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo
de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las
colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por
Pluripeptona 3.0 litro de agua destilada. Reposar
Lactosa 10.0 5 minutos y mezclar hasta
Mezcla de sales 1.5 uniformar. Calentar suavemente
biliares y hervir 1 a 2 minutos hasta
Cloruro de sodio 5.0 disolver. Esterilizar en
Agar 13.5 autoclave a 121C durante 15

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Rojo neutro 0.03 minutos.


Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 0.2

Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar
aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 C.

Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica

Resultados

Microorganismos Colonias
Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae ATCC Rosadas mucosas
700603
Salmonella typhimurium ATCC Incoloras,
14028 transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras,
transparentes
Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras,
transparentes
Enterococcus faecalis ATCC Diminutas, incoloras,
29212 opacas

Caractersticas del medio


Medio preparado: rojo prpura

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.

Presentacin
x 100g :Cdigo: B02- x 500g :Cdigo: B02-
114-05 114-06

Condiciones generales para el cultivo de Mac conkey de microorganismos

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El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve


afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son
ajenos por completo al propio medio.
1. disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de


contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas.
En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras
del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que
tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la 5
preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma
ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que,
adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que
la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las
protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias
tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios
sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de
cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades
metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de
ciertos microorganismos.
2. Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo


productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros
tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de
medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
3. Temperatura

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Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15


y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso
a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C,
y los saprofitos tienen rangos ms amplios.
4. Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos
medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)
5. Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es


imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en
las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua
que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar
as que se deseque el medio
Morfologa colonial bacteriana en medios de cultivo.

Cuando tienes un cultivo en agar (caja petri) siempre es relevante anotar la


morfologa colonial (colonias aisladas) de la cepa bacteriana para facilitar la
identificacin, los siguientes datos te sern de utilidad:
Generalmente se reporta la morfologa colonial tal como uno la percibe, por ejemplo
si se ves que las colonias bacterianas son como puntitos, pues reportan que son
puntiformes, si son lisas pues reportan que son lisas.

Si observas que estn como moco, pues reportan que estn mucosas, si su color es
amarillento pues reportan que son de color amarillento, y as sucesivamente.,
tambin puedes agregar caractersticas que consideres importante para identificarlas,
por ejemplo el olor., Aun as checa las siguientes imgenes para orientarte.

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Morfologa colonial bacteriana superficie.

Morfologa colonial bacteriana forma.

Morfologa colonial bacteriana borde.

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PARTE EXPERIMENTAL

I. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales

Mechero de Bunsen
Asa de siembra
Placas Petri
Contador de colonias
Termmetro
Reactivos

Agar Mc Conkey
Sal 8%
Agua destilada

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12 OBSERVACIN E IDENTIFICACION DE SALMONELLA SP. Y ESCHERICHIA COLI

- Asa de siembra - Placa Petri

- Mechero bunsen - Contador de colonias

- Carne molida - Agar Mc Conkey

- Desinfectantes - Solucin salina al 8%

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PASO N 1: LIMPIEZA Y ESTERILIZACION DEL AREA DE TRABAJO


Se prepara una disolucin de agua con cloro para pasar a desinfectar el rea de trabajo y despus de
unos minutos se flamea el rea de trabajo para asegurar la esterilizacin del medio.
PASO N 2: PESADO DE LA MUESTRA Y PREPARACION DE LA SOLUCION SALINA
En este caso preparamos dos pesadas para identificar dos tipos de microorganismos en una
concentracin distinta.

Para Identificacin de Salmonella.

Se pesa en la luna de reloj 25 gramos de la muestra (carne molida) en la balanza analtica y


luego se le agrega con 75 mL de solucin salina para completar los 100 mL de solucin.

Para Identificacin de Echerichia Coli.

Se pesa en la luna de reloj 10 gramos de la muestra (Carne Molida) en la balanza analtica y


luego le agregamos 90 mL de solucin salina. Preparados a 0.8% de un litro para tener una
concentracin de 0,1 de la mezcla (muestra- solucin salina).
PASO N 3: BAO MARIA DEL MEDIO DE CULTIVO Y ADICION A LA PROBETA
Al mismo tiempo que se diluye la muestra ya se puede estar poniendo a calentar el medio de cultivo
en bao mara para tenerlo en medio lquido. Una vez fundido el medio de cultivo se pipetea 20ml y
se le agrega en una probeta con un termmetro que se le medir entre ( 40-60 )C , en este caso se
tom una temperatura de 55C.

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PASO N 4: ADICION ALA PLACA PETRI


Luego se le adiciona 1 ml d de la muestra que se diluyo en el tubo de ensayo a la placa Petri y
despus se unos segundos de le agrega los 20ml del medio de cultivo lquido, se le tapa y se
homogeniza para as tener un mejor resultado y se deja enfriar. Una vez enfriado se cambiara de
tapa para que los vapores que quedaron no afecten los resultados.

SALMONELLA.

ECHERICHIA COLI.

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PASO N 5: CONSERVACION DE LA MUESTRA EN LA PLACA PETRI HASTA LA


LECTURA
Se mantiene en conservacin para que los microorganismos crezcan y despus de 3 das regresar y
hacer la lectura correspondiente.
PASO N 6: LECTURA DE LOS MICROORGANISMOS

A travs de una lupa y un contador de colonias digital se pudo observar los


resultados para cada microorganismo:

Bacteria E.Coli Salmonella sp.


Imagen

Los resultados:

Ensayo Resultado (UFC/g) Limite permisible por gr m

Escherichia coli. 410 5102

Ausencia/25g Ausencia/25g
Salmonella sp.

RM-591-2008/MINSA
Norma usada
Grupo alimentario: X.6

RESULTADO: La muestra de carne molida analizada, cumple con los requisitos de


inocuidad alimentaria de la RM-591-2008/MINSA en lo que a las bacteria E.Coli y
Salmonella sp. se refiere.

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16 OBSERVACIN E IDENTIFICACION DE SALMONELLA SP. Y ESCHERICHIA COLI

Observacin de la los microorganismos en el microscopio

La identificacin por tincin gram para ambas bacterias es igual ya que son de forma bacilos y
gran negativos:

Para la diferenciacin e identificacin especfica de cada bacteria se realizan una serie de


reaciones bioqumicas como:

Dando diferentes resultados para cada bacteria.

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17 OBSERVACIN E IDENTIFICACION DE SALMONELLA SP. Y ESCHERICHIA COLI

CONCLUSIONES

La muestra analizada present E. coli y Salmonella spp. dentro de los lmites


permisibles.

Se observ al cabo de 72 horas de la incubacin de nuestra muestra problema


(carne molida), present ausencia de Salmonella spp. por cada 25g de carne
molida, lo cual segn la norma es apta para el consumo humano.

Un medio de cultivo adecuado para el correcto crecimiento de E. coli y


Salmonella spp. es el agar Mc Conkey el cual debe ser aadida al inoculo
entre temperaturas de 40 a 50C.
La carne molida analizada result ser ptimo para el consumo segn los
lmites permisibles para E. coli y Salmonella spp.

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ANEXOS

Salmoneliosis

1. Caractersticas de la enfermedad

La salmonelosis es considerada una


zoonosis de distribucin mundial y de
origen alimentario. La va de
transmisin es fecal-oral a travs de
alimentos y agua contaminada con
heces humanas o animales, materiales
y utensilios de cocina contaminados o
por contacto directo de persona a
persona. Desde el punto de vista
epidemiolgico, puede manifestarse
como casos espordicos o brotes con
un nmero variable de afectados. La susceptibilidad es universal. La
salmonelosis se puede presentar como una enfermedad no sistmica o
gastroenteritis que se caracteriza por un perodo de incubacin de 12 a 72 horas.
Puede manifestarse en forma aguda con fiebre ligera (resuelve en 2 - 3 das),
naseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea durante unos das o una semana. La
gravedad de los sntomas puede variar desde ligero malestar a deshidratacin
grave y en algunos casos pueden quedar secuelas crnicas (sntomas de artritis
que pueden aparecer 3 a 4 semanas despus de los sntomas agudos). Otra
manifestacin clnica de la enfermedad es la sistmica, tambin conocida como
fiebre entrica o fiebres tifoidea y paratifoidea, con una incubacin de entre 3 y
56 das y sntomas de fiebre, dolor de cabeza, sensibilidad abdominal,
constipacin, manchas en la superficie del cuerpo de color rojo, infeccin del
flujo biliar, hemorragias provocadas por lceras y perforacin del intestino
causando peritonitis.

2. Epidemiologa
En el perodo 1995-1999, Salmonella fue el segundo agente causal ms
importante (35,3%) de brotes de enfermedad transmitida por alimentos (ETA)
en Amrica Latina y el Caribe. Durante el perodo 1993-2002 ocurrieron en
Argentina 60 brotes de salmonelosis que produjeron 889 enfermos y 4 muertos.
El 6,7 % de los brotes fue causado por Salmonella serovariedad Enteritidis, el
1,7% por S. arizonae y en el 90% de los casos no se pudo identificar la
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serovariedad correspondiente. Con relacin a los alimentos involucrados en


dichos brotes el 25% correspondi a derivados de huevo, mayonesa y carne de
aves. Segn el Ministerio de Salud de la Nacin el porcentaje acumulado a la
semana 47 del ao 2010 para las gastroenteritis por fiebre tifoidea y paratifoidea
es de 22 % contra 38 % correspondiente a la misma semana del ao 2009,
siendo la regin ms afectada la del Noroeste Argentino (NOA) para ambos
aos.

3. Reservorio y fuentes de infeccin


Los principales reservorios de Salmonella son las
aves de corral, el ganado bovino y el porcino. Por
lo tanto, son fuentes de infeccin las carnes de
estos animales y los huevos. El hombre tambin
es reservorio de esta bacteria lo que revela la
importancia de considerar a los manipuladores de
alimentos portadores como fuente de infeccin. Tambin se han identificado
como fuentes de infeccin los vegetales frescos consumidos crudos en
ensaladas. Alimentos asociados: carnes crudas, pollo, huevos, leche y derivados
lcteos, vegetales frescos, pescados, salsas y aderezos para ensaladas, mezclas
para pasteles, postres a base de crema, gelatina en polvo, cacao y chocolate.

4. Prevencin
Las principales causas de infeccin son los alimentos crudos o que hayan
sufrido coccin insuficiente, adems de la contaminacin cruzada que ocurre
cuando los productos cocidos entran en contacto con alimentos crudos o con
superficies o materiales contaminados (como las tablas para cortar). Por lo tanto,
la coccin adecuada y la higiene durante la manipulacin de los alimentos
pueden prevenir en gran medida las infecciones causadas por Salmonella. No
olvidar estos consejos a la hora de manipular alimentos:

LIMPIAR: Lvese las manos y lave las superficies frecuentemente


SEPARAR: No propague la contaminacin
COCINAR: Cocine hasta una temperatura adecuada
ENFRIAR: Refrigere prontamente

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BIBLIOGRAFIA
Norma sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad
sanitaria e inocuidad para alimentos y bebidas de consumo humano.
RM-591-2008 MINSA

R.G Board(1988). Introduccin a la microbiologa de los alimentos.

Egea, Javier. Toxicoinfecciones bacterianas I: salmonelosis.

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