TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

ECATEPEC
DIVISION DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA

BIOQUIMICA DE NITROGENO Y REGULACION

GENETICA

PROFRA. MARIA JAZMIN SORIA CHICO

Mecanismos de proteccin de la nitrogenasa a la

inactivacin por oxigeno

RESUMEN
MAPA CONCEPTUAL

JUAREZ ALEJANDRE KAREN LIZBETH

3501
Una de las vas ms importantes para el acceso al nitrgeno a los seres vivos es la
fijacin biolgica de nitrgeno (FBN), este proceso requiere un aporte de ATP, que
debe ser generado por fosforilacin oxidativa, de importantes cantidades de
oxgeno. Para reducir el N2 a 2NH3 se requiere de una fuente de poder reductor
(entre 400-500 mV a pH 7), as como un mnimo de 16 moles de ATP por mol de
N2 fijado.
La enzima principal responsable de la Fijacin Biolgica del Nitrgeno es la
Nitrogenasa (Nasa), que es una enzima que fcilmente se intoxica por 02, lo que
puede causar su inactivacin irreversible.
La Nasa est constituida por dos componentes:
- La Fierro protena o dinitrogenasa reductasa
- La Fierro - Molibdeno protena o dinitrogenasa.
Estas dos son inactivadas por la presencia del 02, aunque la Fe-protena es ms
sensible (T en aire =30-45 s) que la Fe- Mo-protena (T en aire =10 min).
De acuerdo con el estrs de O2 a la que es sometida, la inhibicin de la Nasa in
vivo por 02 puede ser leve o total. Dependiendo a la cantidad de exposicin del 02
y en ausencia de sntesis de protenas, la inhibicin puede ser completa,
parcialmente reversible o irreversible.
La Fe-Mo-protena, su inactivacin es irreversible y es bastante compleja se realiza
en tres etapas con cambios en el espectro EPR aerbico satisface el alto costo
energtico (ATP), podra causar un dao, por la inactivacin de la Nitrogenasa por
el oxgeno.
Los microorganismos fijadores de nitrgeno han realizado una serie de estrategias
para poder sobrevivir; las adaptaciones empleadas para integrar la FBN a los
requerimientos fisiolgicos son diversos y especficos.
ESTRATEGIAS
Los microorganismos pueden proteger a su Nasa del 02 por ms de un mecanismo:
1. Evasin del 02 y desarrollo en ambientes anaerbicos
2. Generacin de barreras fsicas de proteccin que impidan la difusin del 02 hacia
la Nasa; sin embargo, en aerobios obligados, estas barreras no excluyen
completamente el 02; la composicin de la barrera es importante, ya que no debe
afectar la difusin del substrato N2 al sitio activo del complejo enzimtico.
3. Eliminacin metablica del 02 para reducir su concentracin a niveles aceptables
cerca del complejo enzimtico.
4. Modificacin de la Nasa, de tal manera que sea resistente a la inactivacin.
5. Sntesis de novo de la Nasa alterando el equilibrio entre la inactivacin y la
sntesis.
PROTECCIN RESPIRATORIA
Esta estrategia la podremos explicar con el funcionamiento de Azotobacter al fijar
nitrgeno.
Dalton & Postgate postularon el concepto de que una actividad respiratoria
desacoplada protega a la Nasa de la inhibicin por 02.
La Azotobacter es capaz de ajustar su tasa de respiracin a un amplio rango de
aporte de 02. Est demostrado que la cadena respiratoria de Azotobacter vinelandii
es ramificada y el citocromo oxidasa terminal bd (d), cuya funcin es reducir el 02 a
H20, es crucial para impedir el dao por 02; una mutante alterada en ese citocromo
fija nitrgeno slo en condiciones de microaerofilia. Este mecanismo se denomina
proteccin respiratoria e involucra al citocromo d. Varias lneas de evidencia
experimental lo sostienen:
1. El nivel de la oxidasa terminal d se incrementa cuando el aporte de 02 al cultivo
aumenta y se incrementa dos a tres veces ms en condiciones de FBN.
2. Bajo estas condiciones, el consumo de carbono y fuente de energa est
parcialmente desacoplado del anabolismo; el flujo de electrones va preferentemente
hacia la oxidasa d.
3. Las mutantes del complejo d no fijan nitrgeno en aerobiosis, evidencia gentica
del papel esencial de esta oxidasa en la proteccin respiratoria.
Bertsova indica que Azotobacter vinelandii posee dos cadenas transportadoras de
electrones, una de las cuales tiene una relacin de H+ /e de 5 e incluye a la NADH
I deshidrogenasa y la oxidasa terminal o; mientras que, la otra incluye a la NADH II
deshidrogensa desacoplada y el citocromo parcialmente acoplado d ( H+ /e de 1),
esta ltima funcionando bajo condiciones de fijacin de nitrgeno, que es menos
efectiva en produccin de ATP, pero consume oxgeno para la proteccin de la
Nasa.
La respiracin depende del tipo de fuente de carbono y de la concentracin de
oxgeno disuelto (DOC). Los sustratos carbonados que mantienen bajas
velocidades de respiracin, y producen un alto rendimiento energtico, indican que
se utiliza una va ms efectiva de produccin de ATP. Esto implica que la FBN neta
depende de la regeneracin de ATP ms que del consumo celular de 02. En cultivos
continuos de A. vinelandii se encontr una dependencia de la poza de ATP y la
fijacin de nitrgeno. Se observ una relacin lineal entre la cantidad de nitrgeno
fijado y la concentracin celular de ATP, a pesar de las diferencias considerables
del consumo de 02, de la clase de sustrato, del factor limitante del crecimiento y el
ambiente de 02.
PROTECCION CONFORMACIONAL
Cuando el mecanismo de proteccin respiratoria est saturado (estrs de 02), o bien
bajo condiciones de limitacin en fuente de carbono, la Nasa de A. vinelandii se
inactiva; sin embargo, si la concentracin de 02 disminuye a niveles compatibles
con la fijacin de nitrgeno se recupera la actividad, an en ausencia de sntesis de
novo de la enzima. Adems, los extractos crudos del microorganismo son
relativamente resistentes a la exposicin del 02; en estas condiciones se aisl un
complejo inactivo formado por los dos componentes de la Nasa y una protena.
Posteriormente, esta protena se caracteriz nombrndola protena Shethna o
FeSII; adjudicndole una funcin de proteccin de la Nasa durante el estrs de 02.
El mecanismo que regula la formacin del complejo in vivo no se conoce, pero
podra invocar cambios en el flujo de electrones hacia las protenas de la Nasa y de
su estado redox. Este mecanismo se denomina proteccin conformacional.
Los autores proponen el modelo en el cual la proteccin respiratoria es el
mecanismo principal responsable de la proteccin de la Nasa de A. vinelandii y de
A. chroococcum, cuando crecen en condiciones ptimas; mientras que, en periodos
cortos de crecimiento, con fuente de carbono limitada, la proteccin
conformacional es capaz de proteger temporalmente a la Nasa de su inactivacin
irreversible y degradacin.
Maier & Moshiri observaron que la mutante feSII es menos viable que la silvestre
cuando fija nitrgeno, limitacin en fuente de carbono y en presencia de oxgeno;
presenta tambin una frecuencia de mutacin ligeramente ms elevada que la cepa
silvestre. Los autores proponen que la Nasa y otros poderosos reductores asociados
a la fijacin de nitrgeno sean la fuente del dao por especies de oxgeno reductoras
y que la produccin de estas especies quizs sea minimizada parcialmente por la
protena Shethna.
AUTOPROTECCION
En Azotobacter chroococcum cuando el mecanismo de proteccin respiratoria no
est funcionando al mximo nivel, la reduccin del 02 por la Nasa puede cooperar
para evitar su inactivacin. Esta reaccin denominada autoproteccin implica que la
Nasa es capaz de reducir el 02 siempre y cuando las clulas mantengan un aporte
de poder reductor y energa (ATP). La reaccin de la Nasa y el 02 genera radicales
de 02 txicos que depende de las concentraciones de 02 y Fe-protena-MgADP-, el
02 es reducido por ese componente al radical superxido 02 - o H202. Estos
productos seran eliminados por la catalasa, y el superxido dismutasa (SOD), por
lo que estas enzimas tienen una funcin crucial en la fijacin de nitrgeno aerbica.
Dingler & Oelze demostraron que la actividad total de las enzimas catalasa y SOD,
aumenta al doble cuando las clulas fijan nitrgeno. Adems, los resultados
obtenidos con la mutante FeSII cuando fija nitrgeno, y Fe limitado, en esas
condiciones la actividad SOD disminuye hasta cinco veces, y la mutante es menos
viable, probablemente debido a la acumulacin de los radicales del 02 txico.

PRODUCCION DE ALGINATO
A. vinelandii produce alginato cuya sntesis es afectada por la tensin de 02,
especialmente en un medio libre de nitrgeno y limitado en fosfatos. El alginato es
una capa de polisacrido que protege a la clula de desecacin y estrs mecnico.
El aumento en la tensin de 02 conduce a la formacin de alginato de alto peso
molecular y contenido de cido L-gulurnido. La presencia de amonio inhibe la
produccin de alginato. La composicin de la cpsula de alginato vara de manera
significativa bajo condiciones de fijacin de nitrgeno, resultando ms compacta y
gruesa, formando una barrera efectiva para la transferencia de 02 a la clula. Con
base en estos datos, se propone que la produccin de alginato desempea un papel
preponderante en la proteccin de la Nasa en cultivos de A. vinelandii que crecen
en condiciones de limitacin de fosfatos.
MECANISMO DE PROTECCION EN CIANOBACTERIAS
Las cianobacterias son procariotes nicos fototrficos y oxignicos que combinan
los mecanismos de fotosntesis y respiracin en la misma clula. Adems, muchas
especies son capaces de crecimiento diazotrfico; fijan nitrgeno en condiciones
aerbicas y generan 02, durante la fotosntesis. Las estrategias de proteccin a la
Nasa son particularmente imperativas en cianobacterias fototrficas y diaztrofas.
Tres estrategias se consideran bsicas en estos procariotes:
1. Segregacin espacial de la Nasa y el proceso generador de 02 la fotosntesis
en clulas de diferente tipo. Alguna cianobacterias filamentosas reducen en
N2 a NH3 en clulas especializadas, sin capacidad reproductiva,
denominadas heteroquistes.
Varios factores influyen en la induccin del proceso de diferenciacin de
clula vegetativa a heteroquiste: Fuente de nitrgeno limitada, calidad de
fuente luminosa, intercomunicacin celular (un heteroquiste est separado
por diez clulas vegetativas), y fisiologa celular.

Al menos tres mecanismos funcionan en el heteroquiste para mantener un

ambiente de baja concentracin de 02 compatible con la actividad de la Nasa:

i.- El desarrollo de una envoltura celular especial constituida de glicolpidos,

lipopolisacridos y polisacridos, cuya funcin es retardar la difusin de los
gases.
ii.- El complejo fotosistema II y la Rubisco se inactivan, por lo tanto, no se
genera 02 durante el proceso luminoso, los pigmentos que captan la luz las
ficobiliprotenas son degradadas
iii.- El 02 residual es consumido durante la respiracin celular.

El proceso de diferenciacin a heteroquiste ocurre en un lapso de 24 h

posterior a la deteccin de las seales anotadas, e involucra una variedad de
cambios estructurales, bioqumicos y genticos. La formacin del
heteroquiste se divide, un tanto, arbitrariamente en tres etapas: La etapa
inicial incluye eventos que inician la diferenciacin. Se han caracterizado
algunos genes entre los que destaca un regulador global nombrado NtcA,41
y una serina proteasa HtrR.70 As como un pptido inhibidor que difunde
PatS, recientemente caracterizado, producido por las clulas en proceso de
diferenciacin y que acta como una molcula seal, cuya funcin es
modular el nmero de heteroquistes en el filamento por difusin e inhibicin
de la diferenciacin de las clulas vegetativas contiguas a heteroquiste;
adems de mantener un patrn determinado. La etapa intermedia conduce a
eventos necesarios para continuar la diferenciacin celular y la maduracin
del heteroquiste. Los genes identificados son aquellos cuyos productos estn
implicados en la sntesis de los componentes de la envoltura celular.
 Durante la etapa tarda se realiza la eliminacin programada de tres
elementos de DNA especficos. Este arreglo se observa en varias cepas de
Anabaena, aunque se ha estudiado con detalle en la cepa de Anabaena sp
PCC 7120, donde se conoce que un elemento de 11 kb se elimina por
recombinacin sitio especfica y que sta es indispensable para la expresin
de los genes nif.
Es pues, en el heteroquiste donde la FBN se realiza y los productos de la
misma son transportados a las clulas vegetativas continuas.

2. Segregacin temporal de la Nasa.

La estrategia de la segregacin temporal se observa en cianobacterias no
heteroqusticas: filamentosas y unicelulares. Este mecanismo refleja la
presencia o ausencia de la Fe- protena; ejemplos del mismo ocurren en
Gloeothece y Cyanothece. En Cyanothece, el complejo Nasa est
cuidadosamente controlado a nivel transcripcional y postranscripcional; la
sntesis inicia en las primeras horas del periodo de obscuridad y desaparece
de los cultivos durante la fase de luz de un ciclo alterno de luz obscuridad; en
paralelo, la degradacin del complejo se inicia en la ltimas horas del periodo
de oscuridad. El recambio de la protena refleja un equilibrio entre dos
componentes: sntesis y degradacin; Cyanothece recurre a un mecanismo
costoso energticamente pero efectivo. Por otra parte se demostr tambin
una relacin temp oral entre las actividades de fijacin de nitrgeno y
respiracin, las cuales se realizan simultneamente, en tanto que la
fotosntesis est separada temporalmente, durante ciclos de 24 h.

3. Eliminacin metablica del 02.

La proteccin respiratoria de la Nasa ocurre tambin en los dos tipos de
cianobacterias (heteroqusticas y unicelulares). ste sera uno de los
mecanismos que explica el desarrollo de las cianobac- Soto-Urza y Baca
Proteccin de la Nitrogenasa frente al Oxgeno 44 terias unicelulares en luz
continua. En las cianobacterias unicelulares Gloeothece y Cyanothece y las
heteroqusticas Anabaena y Nostoc, bajo condiciones de FBN las actividades
respiratorias son elevadas, lo que resulta una estrategia esencial para
proteger la enzima del 02 atmosfrico y fotosinttico. Otro aspecto descrito
en los microorganismos fijadores de nitrgeno es la presencia de
hidrogenasas. Las cianobacterias poseen al menos dos hidrogenasas; la
utilizacin del H2 es benfica para los organismos debido a que el H2 es
consumido en una reaccin oxgeno dependiente, eliminndolo del entorno
de la Nasa. Esta reaccin puede generar ATP y poder reductor, lo cual
minimiza la prdida de energa por la formacin de H2 de la Nasa, a la vez
que se consume 02. En efecto, la Nasa de Anabaena mirabilis es
significativamente ms tolerante al 02 en presencia de H2. La actividad de
hidrogenasa est tambin presente en A. chroococcum y A. vinelandii; la
 respiracin dependiente de H2 es benfica para el microorganismo cuando
fija nitrgeno en condiciones limitantes de carbono y fosfato. Recientemente
en algunas cepas de Bradyrhizobium japonicum se introdujo el opern de la
hidrogenasa en sus cromosomas, la expresin de los componentes del
sistema hidrogenasa se verific por inmunoqumica, y el reciclado del H2
aument en los microorganismos modificados genticamente.
ESTRUCTURAS DIFERENCIADAS
Diazosomas. Azoarcus es una bacteria aerbica de metabolismo respiratorio
estricto; sin embargo, fija nitrgeno slo bajo condiciones de microaerofilia. La
concentracin de 02 disuelto (DOC) es crucial para permitir que la generacin de
energa y el proceso de FBN sensible al 02 ocurran simultneamente. Cuando
Azoarcus fija nitrgeno en baja tensin de 02, sufre un proceso de diferenciacin
llamado hiperinduccin. La actividad de la Nasa se incrementa paralelamente al
consumo de la fuente de carbono y la velocidad de respiracin, en tanto que la
velocidad de crecimiento no se altera de manera significativa. El proceso se
caracteriza por cambios morfolgicos y fisiolgicos drsticos; las clulas desarrollan
membranas internas; el componente Fe-protena se localiza en estas membranas,
en tanto que, en clulas en proceso de fijacin de nitrgeno sin hiperinduccin, la
Nasa se localiza en el citoplasma. Resulta interesante que, en condiciones de
represin de la Nasa (0.1 mM de NH4Cl) y en mutantes nifHK minus no se observen
esas membranas internas. Estas estructuras muy organizadas son denominadas
diazosomas.28 La tasa respiratoria mxima en las clulas hiperinducidas
mantiene una actividad de Nasa significativa a DOC.
La eficiencia de la conservacin de la energa en la cadena respiratoria puede
incrementarse empleando una oxidasa terminal que genere importante produccin
de ATP. Los componentes de esta cadena respiratoria estaran en el sistema
membranario nif especfico (diazosomas), formado en el citoplasma durante la
hiperinduccin de Azoarcus. Otro rasgo importante de la formacin de diazosomas
en Azoarcus es que dicha formacin es inducida cuando se coinocula un
ascomyceto. Las bacterias adheridas al micelio estn en contacto con bajas DOCs,
y se mantienen durante periodos prolongados.
PROTECCIN EN LA SIMBIOSIS RHIZOBIALEGUMINOSA
La simbiosis rizobia -leguminosa ha seleccionado una solucin elegante a la
paradoja del oxgeno. Por una parte, la estrategia construida por la planta como una
barrera fsica a la difusin del 02, y por la otra las estrategias fisiolgicas y
bioqumicas de la planta y la bacteria, las cuales responden a una situacin casi de
anoxia en el ndulo
1. Fisiologa del ndulo. La respiracin y la FBN en los ndulos de races se estima
est limitada por la velocidad de aporte del 02 a los ndulos. Una delgada
barrera de difusin en el cortex interno restringe el acceso al tejido central donde
 prevalece una importante demanda y una baja concentracin de 02. Bajo
condiciones de estrs, la barrera presenta variaciones a la difusin del 02, que
se reflejan en variaciones en la actividad metablica del ndulo. Se considera
que mecanismos metablicos alternativos colaboran para mantener el 02 en
concentraciones compatibles con la fijacin de nitrgeno. El aporte de 02 a los
ndulos est regulado para proporcionar un flujo adecuado de DOC en el
citoplasma de las clulas infectadas de los ndulos. Los siguientes aspectos
interviene en la regulacin de la DOC: i).- Las clulas infectadas del tejido
central del ndulo constituyen un tejido compacto, que abate intensamente el
02 (contienen ms mitocondrias que otros tejidos de la planta, y miles de
bacteroides por clula); ii).- El acceso de 02 atmosfrico est restringido en el
cortex interno de los ndulos, por una delgada capa de clulas con pocos
espacios intracelulares que contienen el gas, que constituye la barrera de
difusin, iii).- En estas condiciones de aporte restringido de 02, la concentracin
considerable de oxileghemoglobina (Lb02), confinada en el citosol de la clula
infectada donde estn embebidos los simbiosomas, facilita el flujo de 02 a los
bacteroides del simbiosoma.
2. Transporte de 02 en las clulas infectadas.
Las clulas infectadas contienen muchos simbiosomas. La PBM tiene
propiedades y sistemas de transporte nicos; que le proporcionan al espacio del
simbiosoma caractersticas especiales para el funcionamiento del bacteroide. El
citoplasma de las clulas infectadas contiene de 3-4 mM de leghemoglobina
(Lb). El 02 atraviesa la membrana plasmtica, la cual presenta baja resistencia
a su difusin, disolvindose en la solucin del citoplasma y alcanza el equilibrio
con la Lb, en su forma de Fe+2 , para oxigenarla parcialmente (Lb02); se ha
indicado que la concentracin de 02 en equilibrio con Lb est en el rango de 5-
60 nM, y puede contribuir a la fosforilacin oxidativa de mitocondrias y
bacteroides. La liberacin del 02 de la Lb02 a las mitocondrias y simbiosomas
est controlada por: la [Lb], su oxigenacin relativa y cintica de oxidacin; la
velocidad de disociacin de la Lb02 es 7 veces mayor que la velocidad de la
respiracin, de tal manera que no constituye un factor limitante. Las
mitocondrias de la clula infectada se localizan en gran nmero cerca de la
interface del espacio intracelular sobre los simbiosomas. Su papel principal es
el aporte de esqueletos de C y ATP para la asimilacin de NH3 fijado del N2;
proporcionar ATP y energizar la membrana del simbiosoma para el transporte
de cidos dicarboxlicos. As la mitocondria desempea un papel protector, al
consumir 02 en la periferia de las clula infectadas y permite que la [02] se
mantenga favorable (2M). En preparaciones de mitocondrias de ndulos, las
cinticas aparentes de respiracin se alteraran cuando el ADP exgeno es
limitante; el consumo de 02 no se afecta a baja concentracin del mismo, pero
se reduce significativamente a [02] > 50 nM. Por lo tanto, la [ADP] es un
regulador potente de la demanda de 02. La determinacin de la carga
energtica de adenilatos AEC (ATP + 0.5 ADP/ATP + ADP + AMP) en
 condiciones de 10% de aporte de 02 a las clulas infectadas del ndulo
disminuye, lo que indica que el sitio primario de limitacin de 02 son los
bacteroides.
3. Papel de la oxidasa terminal.
Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium son microorganismos que viven en
vida libre en el suelo; en el laboratorio en cultivo, o en simbiosis (como
bacteroide), en el citoplasma de las clulas infectadas del ndulo. En estas
condiciones estn expuestos a concentraciones de 02 que varan de rdenes
de magnitud 10,000 veces entre una solucin acuosa saturada y la que se
encuentra dentro de las clulas infectadas del ndulo. Los Rhizobia manipulan
estos extremos al inducir diferentes oxidasas respiratorias con diferentes
afinidades por el 02. La oxidasa de gran afinidad es necesaria para mantener
un metabolismo energtico eficiente en simbiosis, donde la concentracin de 02
libre se estima corresponde a 5-25 nM.