ANALISIS

DE CASO INDIVIDUAL EN INTERVALOS POST MORTEM SOBRE LA PRESERVACION DE TEJIDO CEREBRAL

Abstract

En la autopsia, el tiempo transcurrido desde el momento de la muerte se documenta rutinariamente y se anota como el
intervalo post-mortem (PMI). El PMI de muestras de tejido humano es un parmetro frecuentemente descrito en
estudios de investigacin y se prefiere un PMI comparable cuando se comparan diferentes poblaciones, es decir,
pacientes de enfermedad frente a pacientes de control. En teora, un PMI corto puede aliviar la desnaturalizacin no
experimental de la protena, la actividad enzimtica y otros cambios qumicos tales como el pH, lo que podra afectar la
integridad de las protenas y los cidos nucleicos. Estudios previos han comparado el PMI en masa observando muchos
casos individuales diferentes, cada uno con un PMI nico, que puede verse afectado por la varianza individual. Para
superar este obstculo, en este estudio de hipocampo humano segmentos de los mismos individuos fueron muestreados
en diferentes momentos despus de la autopsia la creacin de una serie de PMIs para cada caso. Luego se examin el
tejido congelado y fijo mediante Western blot, RT-PCR e inmunohistoqumica para evaluar el efecto del PMI extendido
sobre las protenas, los cidos nucleicos y la morfologa de los tejidos. En nuestros resultados, los perfiles de
inmunotincin para la mayora de las protenas se mantuvo sin cambios, incluso despus de PMI de ms de 50 h, sin
embargo, por Western blot distintivo patrones de degradacin se observaron en diferentes especies de protenas.
Finalmente, la integridad del ARN fue menor despus del PMI extendido; Sin embargo, la preservacin del ARN fue
variable entre los casos que sugieren que los factores antemortem pueden desempear un papel ms grande que el PMI
en la integridad de la protena y del cido nucleico.

Introduccion

En el campo de la neuropatologa, un parmetro que es variable y difcil de controlar es el tiempo transcurrido entre la
muerte y el muestreo del tejido para hacer un diagnstico. Muy a menudo, el cuerpo se refrigera esperando la autopsia,
sin embargo, el intervalo post-mortem (PMI) puede variar de 1 h a ms de 24 horas. Para realizar un diagnstico preciso,
la preservacin de los tejidos para el anlisis morfolgico y la preservacin antignica para el anlisis
inmunohistoqumico es crucial. A menudo, el ADN y el ARN tambin se purifican para anlisis genticos o para fines de
investigacin. Los cambios que ocurren durante este intervalo afectan la actividad enzimtica, la integridad del cido
nucleico, la modificacin oxidativa y la integridad de la protena.

Durante el tiempo de pre-autopsia, mientras que los cuerpos se almacenan a 4 C, las secciones medias del cerebro se
enfran ms lentamente y por lo tanto ms afectados por las enzimas y los procesos biolgicos que las porciones
laterales. Recientemente, los estudios post-mortem de imgenes que investigan el potencial de imgenes in vivo de la
isquemia y la esclerosis mltiple han comenzado a tener en cuenta PMI, lo que demuestra una necesidad de estudiar
directamente su efecto [2, 3]. Un largo PMI se ha demostrado que afectan a la integridad de ARN en microarrays
experimentos [4], mientras que los factores apoptticos y el pH se han encontrado para ser no relacionados con PMI [5
- 7]. Los residuos fosforilados en el cerebro del ratn se ven afectados de forma dramtica por PMI, y el mismo estudio
confirm que mientras el almacenamiento de tejido a 4 C no inhibe la desfosforilacin, retard la disminucin de los
niveles de protena total en comparacin con almacenamiento a temperatura ambiente [8]. ]. De hecho, GSK3 se
desfosforil rpidamente en sus residuos de fosfoserina, con un 95% de desfosforilacin en tan slo 10 min postmortem
[9]. Un estudio compar el tejido de la biopsia del cerebro humano mantenido hasta 4 h despus del muestreo y
encontr una prdida similar de tau fosforilada en 1 h [10].

Mientras que los casos sospechosos de enfermedad neurodegenerativa se dan a menudo con alta prioridad para la
autopsia rpida, las muestras de tejido de pacientes control no afectados, aunque son tan importantes para los estudios
de tejidos humanos, con frecuencia no se recogen con el mismo rigor con respecto a minimizar el tiempo entre la muerte
y la autopsia. Esto se debe principalmente al hecho de que los tejidos no son el foco para determinar la causa de la
 muerte. De hecho, mientras que el efecto de PMI es a menudo debatido, los estudios realizados hasta la fecha no han
probado sistemticamente los efectos de la demora en muestras de pacientes individuales. La mayora de los estudios
slo han comparado diferentes casos o modelos animales diferentes para evaluar las variables del PMI. Para superar
algunas de estas debilidades experimentales, hemos muestreado, fijado, e incrustado tejido hipocampal humano en
mltiples puntos de tiempo de casos individuales. Utilizando el punto de tiempo inicial como control y los puntos de
tiempo subsiguientes como muestra experimental, el PMI fue una variable aislada dentro de un solo caso. La morfologa
de los tejidos, una variedad de anticuerpos comunes utilizados para la inmunohistoqumica o anlisis de transferencia
de Western, cambios de fosforilacin y integridad de ARN se examinaron en este estudio. Con este enfoque
experimental, se analiz el efecto del PMI sin requerir una gran poblacin de muestra para controlar las diferencias
fisiolgicas. Los hallazgos de este estudio son importantes para los estudios de tejidos humanos que utilizan autopsia y
muestras de tejido archivadas.

Materiales y mtodos

El tejido de la autopsia se obtuvo de los Hospitales Universitarios de Case Medical Center bajo un protocolo IRB (03-00-
26) aprobado por la Universidad de Hospitales del Centro Mdico del caso de la Junta de Revisin Institucional que
contiene Renuncia de Consentimiento, Renuncia de Asentimiento y permiso de los padres y renuncia de HIPAA
Autorizacin.

Se resecaron grandes secciones del hipocampo y se almacenaron en un recipiente de plstico cerrado a 4C. En puntos
de tiempo experimentales predeterminados, se retir una parte del hipocampo resecado y se coloc a -80C o en formol
formaldehdo tamponado al 10%. El tejido restante se devolvi a 4C hasta el punto de tiempo subsiguiente, momento
en el que se utilizaron un fijador idntico y procedimientos de muestreo / almacenamiento (Fig. 1A).

El tamao de la muestra inicial determin cuntos puntos de tiempo podran ser recogidos por caso. Para cada tiempo
de muestreo, se recogi un rea de seccin transversal de aproximadamente 2-4 mm de espesor del hipocampo,
incluyendo regiones de giro dentado y cornus ammonus fcilmente identificables. Los dos casos con el PMI inicial ms
corto (aproximadamente 4 y 5 h) se utilizaron para el anlisis de ARN y protenas.

Las muestras de tejido fijadas fueron embebidas en parafina, seccionadas a 6 m con un micrtomo y analizadas
histoqumicamente e inmunohistoqumicamente. tabla 1 Enumera los detalles del caso y los PMIs estudiados para cada
caso, y la figura 1 muestra un esquema del procedimiento de recoleccin de tejido.

Table 1. Cases used in the study and the tissue collection times for each case.

Additional samples Additional samples

Case Age Gender Neuropathological Diagnosis Initial PMI (xed) (frozen)

(h)

A 42 M No signicant gross or histopathologic 17.25 +25.5 (42.75 h total) NA

abnormality
B 73 F Alzheimers disease 5.00 +44.5 (49.5 h total) +20.5 (25.5 h total)
Braak VI +44.5 (49.5 h total)
C 75 M Severe atherosclerosis of 22.50 + 4 (26.5 h total) NA
intracranial arteries +19 (41.5 h total)
D 77 M Moderate atherosclerosis of intracranial vessels 23.00 +23 (46 h total) NA
E 78 M Alzheimers disease 4.50 +2 (6.5 h total) +1 (5.5 h total)
Braak VI +26 (30.5 h total) +2 (6.5 h total)
+49 (53.5 h total) +5.5 (10 h total)
+18 (22.5 h total)
+26 (30.5 h total)
+49 (53.5 h total)
Fig. 1. Protocolo de muestreo de tejido y morfologa del tejido con aumento de PMI. (A) El diagrama muestra cmo los tejidos del
hipocampo fueron muestreados en los diferentes puntos de tiempo. El nmero de puntos de tiempo recogidos dependa del tamao de la
muestra original del hipocampo. Coomassie mancha azul de las muestras de los dos casos con inicialmente bajo PMI recogidos en diferentes
tiempos PMI y congelados. Se prepararon homogeneizados y se colocaron cantidades iguales de protena en el gel. (B) El caso B no muestra
prdida aparente de la carga proteica total, mientras que el caso E muestra una tincin de Coomassie ms dbil en puntos de tiempo de 30
y 53 h. (C) Morfolgicamente, se observan cambios mnimos de tejidos o celulares con aumento de PMI mediante tincin de Nissl. (D) El
anlisis de transferencia de Western para NeuN encuentra que no hay disminucin de la banda de NeuN con PMI en el caso B, pero el caso
E muestra niveles de NeuN globales ms bajos y una prdida de NeuN a los tiempos de PMI ms largos. El caso E de inmunotincin muestra
que tanto las neuronas piramidales como las neuronas dentadas de giro muestran la localizacin neuronal esperada de NeuN en todos los
tiempos PMI. Barra de escala = 20 m.


Las secciones de parafina se hidrataron con dos inmersiones de 10 min en xileno seguido por equilibrado en una serie
de disoluciones de alcohol descendente tambin durante 10 min cada una. Entre las soluciones de alcohol del 95% y el
70%, las secciones de tejido se sumergieron durante 30 min en una solucin al 3% (H2O2) y despus de la solucin final
de alcohol se sumergieron las secciones en TBS durante al menos 10 min.

El anlisis inmunohistoqumico se centr en una serie de anticuerpos que se utilizan rutinariamente para los datos
neuropatolgicos y anatmicos normales. Anticuerpos para el colgeno IV, SMI-34 (antiphosphonoprofilamentos,
Abcam), HNE (marcador de la peroxidacin lipdica, Alpha Diagnostic Internations), -tubulina (Invitrogen, clon B-5-1-2),
COX-1 (citocromo oxidasa 1 , Molecular Probes), ADN de doble hebra (Millipore), NeuN (Millipore), tau fosforilado
Ser396 / 404 (PHF1, don de Peter Davies), tau fosforilado Ser202 / Thr205 (AT8, Thermofisher), GFAP (marcador
astroctico Invitrogen) Y rRNA (Millipore). Tambin se realiz la tincin de Nissl (cresol violeta).

Para el anlisis de transferencia Western, la materia gris de las muestras congeladas de los dos casos que tenan el PMI
inicial ms corto se homogeneizaron en volumen 10X de tampn de lisis (Cell Signaling Technologies) con inhibidores de
proteasa e inhibidores de fosfatasa aadidos (Roche Diagnostics). . Las muestras se centrifugaron a 4 C, y los
sobrenadantes se recogieron y alcuotron. Para este experimento, el efecto del tiempo de almacenamiento sobre la
estabilidad de la protena fue el parmetro experimental, por lo que para superar cualquier discrepancia en los niveles
de carga, BCA se utiliz para determinar la concentracin de protena, y 200 l de soluciones madre a 1 mg /
Sobrenadante de muestra. 10 \ mu g o 30 \ mu g de protena por pocillo se resolvieron mediante electroforesis en PAGs
SDS al 10% y la protena se transfiri a membranas inmovilizadas.

Despus de bloquear con leche en polvo al 10%, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la
noche seguido de enjuague 5 veces durante 5 minutos cada uno en TBS-Tween. Se aplic un anticuerpo secundario
conjugado con HRP durante 1 h, seguido por enjuague de nuevo como se ha indicado anteriormente. Las bandas de
protenas se detectaron con reactivo ECL (Santa Cruz y Millipore). Tambin se realiz tincin con azul de Coomassie de
los geles de los dos casos PMI ms cortos. Los anticuerpos primarios utilizados para la deteccin en transferencias
Western incluyen -tubulina (Invitrogen), -actina (Millipore), GAPDH (Abcam), PHF1, AT8, NeuN y tau-5 (Pierce). La
cuantificacin se hizo en relacin con el valor ms alto por anticuerpo por caso o con relacin a la actina y se realiz un
anlisis de regresin para comparar los niveles relativos con los puntos de tiempo PMI.

Para comparar cmo el PMI afecta la estabilidad del ARN, se prepar ARN a partir de todos los puntos de tiempo PMI
recogidos de los dos casos con el PMI ms corto, aproximadamente 4 horas, y comparado con un patrn de ARN de
ratn, esencialmente 0 h PMI, preparado al mismo tiempo en una Bromuro de etidio gel manchado. RT-PCR cuantitativa
(qRT-PCR) se utiliz para evaluar dos comnmente medidas genes de limpieza: GAPDH y 2-microglobulina (B2M), como
se describe anteriormente [11].

La purificacin de ARN se realiz por duplicado para cada caso a partir del material de partida congelado original. Las
reacciones qRT-PCR se realizaron solamente en las muestras para las cuales se obtuvo suficiente ARN. Ambos casos (Caso
B y Caso E) se ensayaron al mismo tiempo tanto para la purificacin de ARN como para el anlisis de qRT-PCR.

Resultados

Integridad de las protenas y morfologa de los tejidos
Se utilizaron tejidos de pacientes individuales muestreados en diferentes momentos despus de la autopsia, para evaluar
la integridad de la protena y la morfologa del tejido. Se homogeneizaron muestras de tejido congelado, se determinaron
los niveles de protena y se resolvieron 30 g de protena por pocillo usando SDS-PAGE al 10% y se ti el gel con azul
de Coomassie. La Fig. 1B muestra los resultados de dos casos. Despus de 24 h, algunos "frotis" se notaban en el gel del
caso B y bandas ms dbiles en el caso E, pero en general las protenas resueltas fueron en gran medida sin cambios. Las
muestras de tejido fijadas despus de la PMI inicial y luego de hasta 49 h adicionales a 4C no presentaron cambios
sorprendentes en la morfologa neuronal usando tincin Nissl rutinaria (caso representativo mostrado en la Fig. 1C). Las
muestras de tejido contenan neuronas piramidales en las regiones de cornus ammonus y neuronas en las zonas
dentadas de giro detectadas por NeuN (Fig. 1D). Por Western blot, los niveles de NeuN no cambiaron con PMI en el caso
B, pero mostraron menos tincin en las muestras con los puntos de tiempo ms largos en el caso E (Fig. 1D),
correlacionando con el patrn de tincin de Coomassie mostrado en la Fig.

Efecto del PMI sobre las protenas del citoesqueleto

Los procesos axonales de las neuronas permanecieron inmunorreactivos para la -tubulina despus de 48 h en 3/6 casos
(Fig. 2A), y las protenas del neurofilamento eran todava fcilmente detectables con PMI extendido, aunque una cierta
prdida de intensidad es aparente (Figura 2A). Por Western blot, los niveles de actina y GAPDH no disminuyeron incluso
en el punto de tiempo de 48 h, sin embargo, los niveles de tubulina disminuyeron dramticamente despus de 22 h (Fig.
2B). Los niveles relativos de protena se basaron en el valor ms alto para cada caso y se us un anlisis de regresin
para determinar que la actina y la GAPDH no eran significativamente ms bajas con el aumento de PMI, pero los niveles
de tubulina mostraron una correlacin inversa significativa con el aumento de PMI (Fig. 0,02).



Efecto del PMI sobre las mitocondrias y la peroxidacin lipdica
La Inmunohistoqumica con un anticuerpo de COX-1, una protena mitocondrial, no mostr ninguna prdida de
inmunoreactividad en cualquier caso, incluso despus de 48 h (Fig. 3]. El patrn tpico y los niveles neuronales de COX-
1 permanecieron sin cambios tras el PMI extendido. Adems, el producto de peroxidacin lipdica 4-hidroxinonenal
tambin estaba presente a niveles similares en neuronas en diferentes PMI.



Fig. 2. Efecto del PMI sobre las protenas del citoesqueleto. (A) Los cuerpos y procesos neuronales de las clulas se inmunotinizan
utilizando anticuerpos contra las protenas alfa tubulina y neurofilamento incluso a tiempos PMI ms prolongados. Barras de
escala = 50 m.
(B) Sin embargo, por Western blot, mientras que las protenas actina y GAPDH no muestran correlacin con PMI veces, detectable
tubulina niveles disminuyen significativamente despus de un PMI de 22 h. (C) Los niveles relativos se basaron en la banda
reactiva ms alta por caso. En el grfico que muestra la cuantificacin de la tubulina, tanto el caso E (crculos negros) como el
caso B (crculos blancos, muestran una prdida significativa de la reactividad de la mancha Western de tubulina con tiempo de
PMI (p <0,02 utilizando el anlisis de regresin. O GAPDH Las barras de error representan SEM de tres experimentos separados.



Efecto del PMI sobre la fosforilacin de tau
Para este estudio, elegimos examinar las protenas tau fosforiladas que son relevantes para la investigacin de
enfermedades neurodegenerativas. El tau fosforilado es un componente principal de la patologa neurofibrilar asociada
con la enfermedad de Alzheimer. Incluso despus de un PMI de 53 h, los enredos neurofibrilares eran todava fuertes y
claramente inmunorreactivos para tau fosforilado (Fig. 4A). Por Western blot, los anticuerpos primarios PHF1, tau-5 y
AT8 (no mostrados) detectaron bandas en todos los puntos de tiempo PMI (Figura 4B). El caso B tena niveles ms altos
de tau fosforilado comparado con el caso E, que requera un tiempo de exposicin mucho ms largo comparado con el
caso B para revelar las bandas tau en la misma mancha. Adems, mientras que el caso B mostr pocos cambios en la
reactividad de PHF1 con el tiempo PMI, el caso E mostr niveles variables que no se correlacionan con tau-5, actina o
PMI (Fig. 4C). Estos resultados pueden reflejar diferentes niveles de neurodegeneracin y muestreo de la poblacin
neuronal a travs del hipocampo.

Fig. 3. Efecto del PMI sobre las mitocondrias y la peroxidacin lipdica. Ni la morfologa de las mitocondrias ni la
inmunoreactividad de COX-1 se ven afectadas incluso por el PMI ms largo estudiado. La peroxidacin lipdica demostrada por
un anticuerpo a 4-hidroxinonenal tambin permanece sin cambios con el tiempo. Barras de escala = 50 m.






Efecto del PMI en otras protenas comnmente examinadas
GFAP es uno de los marcadores comunes para la astrocitosis. La inmunocitoqumica con un anticuerpo GFAP no mostr
cambios significativos en la tincin de astrocitos con aumento de PMI (Fig. 5). Adems, un anticuerpo para colgeno IV
mostr intensidad de tincin equivalente de los vasos, incluso en el ms largo PMI (Fig. 5].

Efecto del PMI sobre los cidos nucleicos
El ARN se extrajo de las muestras de tejido congelado recogidas de los casos B y E. La figura 6A muestra el gel teido con
bromuro de etidio del ARN purificado con el aumento de PMI del caso B. Aunque se obtuvo una cantidad significativa de
ARN despus de 49,5 h, incluso en el ms corto PMI de 5 h no se observa ARN intacto, cuando se compara con ARN de
ratn. El ADNc se produjo con xito a partir de estas muestras de ARN y los genes de mantenimiento comn, GAPDH y
B2M, fueron detectados con xito por qRT-PCR, indicando que el ARN significativamente degradado puede generar
productos cortos en el anlisis de qRT-PCR (Figura 6B). El caso B mostr ligeros aumentos en la media de Ct con aumento
de PMI para B2M y GAPDH, lo que refleja la degradacin del ARN observada en el gel. Sin embargo, para el caso E, los
rendimientos de ARN de las muestras recogidas en los puntos de tiempo posteriores, 30,5 y 53,5 h PMI, eran demasiado
bajos para realizar qRT-PCR, incluso despus de mltiples intentos de purificacin de ARN. En general, se observ una
media de Ct ms alta (superior a 30) confirmando la degradacin total del ARN observada en el gel, en la que slo se
observaron frotis y bandas de ARN no definidas (datos no mostrados).


Morfolgicamente, un anticuerpo especfico para ARN ribosmico (ARNr) corrobora los resultados de qRT-PCR de tal
manera que, en todos los casos, la intensidad de inmunotincin de ARNr disminuy con el tiempo. La Fig. 6C muestra las
neuronas del hipocampo del tejido del Caso C fijado a las 22 h y 41 h PMI. A la inversa, el nmero y la intensidad de
ncleos teidos usando un anticuerpo contra el ADN permanecieron sin cambios incluso despus de 46 h a 4C (Fig. 6D)



Discusin

Los experimentos sobre PMI tienen limitaciones, ya sea comparando diferentes casos o condiciones de
almacenamiento, teniendo que usar varias regiones de tejidos, o incluso modelos animales que no imitan los ajustes
de la autopsia del da a da. Este estudio caracteriz el efecto de PMI dentro de los mismos tejidos del paciente,
controlando cuidadosamente la regin del cerebro analizada y manipulacin de tejidos, pero eligiendo una
seleccin de casos de autopsia aleatoria y examinando protenas utilizadas comnmente para el diagnstico y
estudios de investigacin, con el objetivo de determinar los efectos de PMI extendido. Aun as, la temperatura del
tejido cerebral en el momento de la autopsia no se midi y puede ser ms relevante que el PMI, ya que puede no
correlacionarse con el tiempo PMI debido a los muchos otros factores de confusin. De hecho, un estudio clsico
encontr que se necesita 30 horas para que el cerebro humano se enfre cuando el cuerpo se refrigera a 8 C.

Una conclusin del presente estudio es que las muestras de pacientes individuales son muy diferentes incluso
cuando se recogen, almacenan y se manejan bajo las mismas condiciones y por el mismo personal.

 Fig. 4 Efecto del PMI sobre la fosforilacin de tau: (A) Los enredos neurofibrilares estn bien teidos por el
anticuerpo fosforilado tau PHF1 tanto para el caso de PMI bajo (6,5 h) como con PMI extendido (53,5 h). (B) Los
niveles de tau fosforilados no parecan correlacionarse con el aumento de PMI por transferencia de Western (PHF1,
AT8- no mostrado), sino que eran variables en el caso E (60 segundos, tiempo de exposicin mostrado) y similares
en el caso y similar en el caso B (slo 1 s de tiempo de exposicin de la misma mancha). (C) La cuantificacin no
revel ninguna tendencia de PMI con los niveles de PHF1, AT8 o tau5 en el caso E o en el caso B.

Tal vez otros factores incluyendo la causa de la muerte, el envejecimiento, la enfermedad, los medicamentos, otras
intervenciones mdicas, la presencia de fiebre o hipotermia, y la salud en general en el momento de la muerte
puede afectar a la preservacin de los tejidos. Por ejemplo, la integridad del ARN fue muy diferente en los dos casos
analizados. A pesar de que estos dos casos tenan PMI inicial de 4 h, y luego fueron muestreados en puntos de
tiempo adicionales, un caso (caso B) tena mayor preservacin de ARN en comparacin con el otro caso (caso E).
De hecho, en las muestras del caso B almacenado hasta 49,5 horas a 4C, el ARN para los genes constitutivos
(housekeeping) habitualmente analizados, GAPDH y B2M, tena fragmentos suficientemente largos para ser
medidos por qRT-PCR, mientras que las muestras de ARN del caso E fueron ms extensamente degradadas incluso
en el tiempo PMI ms temprano. Estos resultados sugieren que la degradacin del ARN se incrementa
gradualmente por PMI, pero el estado inicial del ARN es ms crtico para el anlisis de ARN. Esto est de acuerdo
con la literatura anterior que muestra un sesgo en las lneas de tendencia con un PMI de ms de 9 h para algunas
transcripciones, pero no hay cambio en las trascripciones de genes constitutivos de -actina. Nuestros resultados
estn de acuerdo con otros estudios que concluyen que PMI tiene poco efecto sobre el ARN y que los factores de
antemortem pueden ser una mayor influencia. Adems, la integridad nuclear se mantuvo en todos los casos, incluso
despus de 48 h de almacenamiento antes de la fijacin, ya que la inmunotincin del ADN revel reactividad nuclear
fuerte y muy especfica, sin ninguna prdida de morfologa nuclear. Otros estudios han demostrado que la actividad
de reparacin del ADN tambin se mantiene hasta un PMI de 24 h en el modelo de roedor. Las conclusiones de
estos estudios son que mientras PMI efectivamente afecta la integridad del RNA recogida de una muestra de
pacientes especficos y debe ser una consideracin para los estudios humanos utilizando muestras de tejidos
archivados, la variabilidad entre los pacientes individuales es ms evidente. De hecho, la variacin de inmunotincin
NeuN e inmunotransferencia entre los dos casos que se muestran en la Fig 1 probablemente representan la
variabilidad del paciente individual y el estado de enfermedad, y no PMI, como se ha sugerido anteriormente [17].


Fig. 5. Efecto de PMI sobre GFAP y colgeno. Los astrocitos tambin mantienen su morfologa e inmunoreactividad
para la protena GFAP incluso a largo PMI, y la vasculatura cerebral no muestra prdida de estructura o niveles
detectables de colgeno.

Fig. 6 El ARN se degrada con el tiempo. (A) El gel teido con bromuro de etidio del caso B muestra cierta degradacin
del ARN con el tiempo. (B) qRT-PCR resultados muestran que hay un aumento de la media Ct con el aumento de PMI,
sin embargo corto fragmentos de ambos GAPDH y B2M fueron amplificados, incluso despus de 49,5 h para el caso B.
(C) Un anticuerpo rRNA muestra una disminucin similar de inmunoreactividad con el tiempo (D), pero un anticuerpo
para dsDNA sigue siendo robusto incluso despus de un PMI de 46 h. Barras de escala = 50 m.

Otro hallazgo importante de este estudio es que las protenas actina y GAPDH, a menudo utilizados como controles
internos de carga para los estudios de transferencia Western, permanecen intactos incluso en los PMI ms largos
estudiados, durante 48 h. Estos datos corroboran estudios realizados en cohortes de roedores con PMI diferentes
mostrando que la actina permanece estable hasta el punto de tiempo de 48 h. Por el contrario, una ligera
degradacin global de protenas como se detecta por el azul de Coomassie en un PMI de 24 h coincide con estudios
de roedores. Es importante destacar que otro control de carga interna comn, la tubulina, disminuye con el tiempo;
por 22 h PMI ms del 50% de la tubulina se pierde por anlisis de transferencia de Western blot. Esta observacin
se confirm en dos casos separados. De hecho, en un caso, los niveles de tubulina disminuyeron en un 90%. Sin
embargo, incluso con un PMI de 48 h, los procesos neuronales todava eran evidentes en las muestras de tejido
fijas, como lo demuestra la inmunoreactividad tubulina fuerte y especfica encontrada en muchos, pero no en todos
los casos. Anteriormente se inform que las modificaciones tubulina son frecuentes y mantenidas en las neuronas
y por Western blot en casos con PMI menos de 10 h. En el presente estudio se encontr que la mayora de la prdida
de tubulina se produce despus de un PMI de 12 h. Histricamente, la capacidad de detectar tubulina preparada a
partir del cerebro humano se ha correlacionado con PMI y nuestro estudio proporciona ms pruebas de que para
algunas protenas, con el aumento del tiempo PMI, se produce la suficiente degradacin de protenas para causar
una prdida significativa de protenas detectables durante la preparacin de Homogeneizacin de tejidos,
extraccin de tampn de lisis y electroforesis.
Otros marcadores comnmente utilizados permanecen sin cambios despus de un PMI de 24 h o incluso 48 h. Por
ejemplo, GFAP, una protena marcadora para astrocitos, no se ve afectada por el aumento de PMI. COX-1, una
subunidad del complejo IV hecha en la mitocondria, tambin permanece detectable, que est en apoyo directo de
un estudio que encontr la morfologa de las mitocondrias e incluso la actividad se mantiene con un PMI hasta 24
h en un modelo experimental. Los enredos neurofibrilares que contienen tau fosforilados mantienen su estructura
e integridad proteica tambin. Los niveles variables de tau detectados por PHF1 y AT8 se observaron en un caso
por Western blot; Esto probablemente estaba relacionado con cambios en la patologa de acumulacin a travs de
la muestra en lugar de PMI. Se ha demostrado que un ratn que expresa tau mutante exhibe efectos de PMI en
tincin de tau-5, sin embargo la diferencia de especies o presencia de la mutacin P301L puede explicar esta
discrepancia aparente. Otros han demostrado que existe una prdida significativa de fosforilacin de tau en
cuestin de minutos en ambas muestras de biopsia humana y en ratones, y que esta prdida se exacerba por no
enfriarse inmediatamente en hielo, ya que se produce desfosforilacin sustancial dentro del corto tiempo requerido
para la perfusin. Basndonos en estos estudios, slo podemos asumir que incluso en nuestro PMI ms temprano
de 4 h estamos detectando niveles disminuidos de fosforilacin de tau para empezar, y de hecho nuestros
resultados coinciden con Matsuo et al. que la desfosforilacin disminuye a lo largo del tiempo probablemente
debido a la disminucin de la actividad de las fosfatasas incluyendo PP2A. La morfologa general del tejido se
mantiene de tal manera que las estructuras neuronales y la vasculatura no se interrumpen.

Conclusin

En muchos estudios que usan tejidos de autopsia humana, a menudo se indica PMI como una variable del paciente.
Este estudio confirma que PMI es de hecho un parmetro valioso para informar, y se debe tener cuidado al
examinar ciertas protenas y cidos nucleicos. Es importante destacar que, aunque se encontr que los niveles de
actina o GAPDH permanecieron sin cambios con PMI, no debera ser el nico factor utilizado para controlar la
protena total, ya que en los mismos casos la prdida de tubulina detectable fue significativa despus de 22 h. Sin
embargo, para todas las protenas analizadas aqu, PMI < 22 h no mostraron prcticamente ninguna prdida de
integridad de protenas por Western blot. Por lo tanto, en estudios que utilizan muestras de tejido congelado de
archivo, los niveles de protenas diana tambin deben correlacionarse con PMI para asegurar que cualquier cambio
observado no es un resultado directo de la manipulacin de tejidos. Usando mtodos inmunohistoqumicos, sin
embargo, todas las protenas examinadas en este estudio todava se detectaron en la mayora de los casos y sin
ningn cambio morfolgico sustancial cuando se fijaron, incluso despus de un 48 h PMI. Estos resultados, junto
con informes previos utilizando muestras de biopsia y modelos animales, sugieren que la temperatura del tejido
puede ser ms relevante para los estudios bioqumicos, y puede ser otro factor digno de medir cuando el muestreo
de tejidos debe hacerse de manera proactiva. Los hallazgos reportados en este estudio son crticos para estudios
de investigacin bsica y enfatizan la importancia de tener un nmero suficiente de casos para superar la
variabilidad inherente al usar muestras humanas.