Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Imunologia

5. Diferenciao Clulas B

Resumo da aula terica: 26 de Fevereiro de 2008

Diferenciao Clulas B

Desenvolvimento linfcitos B, baseia-se nos processos de diferenciao celular que partilham

um esquema base, ou seja, tem de haver alteraes de expresso genica de uma cel, o seu perfil
expresso gentica muda, havendo protenas que vo comear a ser expressas enquanto que outras
deixam de o ser. Estas alteraes moleculares repercutem-se num novo fenotipo.

No sistema imunitrio conseguimos seguir os estdios de maturao porque existem

marcadores de superfcie identificados das cel B e T, e havendo anticorpos especficos para cada
marcador, para marcar cada estdio de diferenciao.

Processos genricos de diferenciao

Os nveis de regulao de diferenciao so

vrios: se h uma clula que vai diferenciar-se, ela
recebe informao do exterior atravs de receptores
(receptores que s so funcionais caso haja uma
transduo de sinal) e por cascatas de sinalizao de
cinases, permite que a nvel nuclear exista uma
repercusso nos factores de transcrio activando ou
reprimindo a transcrio. Alterando os mRNA e as
protenas que constituem a cel.

Clulas B

Derivam cel hematopoieticas estaminais, que

se diferenciam na medula ssea atravs de uma
serie de processos. As cel B fazem anticorpos.
Desenvolvimento cel B

Para ser cl b tem de expressar uma

molcula que o marcador de cel B. Uma cel B
s o porque expressa um receptor cel B (Bcr),
qualquer cel que n tenha o receptor superfcie
de cl B, nunca pode ser uma cel B, mas poder
ser o seu progenitor se seguir uma
diferenciao para cel B, de modo a
futuramente expressar o receptor.
O receptor especfico desta linhagem de cel
imunitrias, n havendo mais nenhuma cel no
organismo com capacidade para o expressar.

Configurao Bcr
um receptor de superfcie, com duas cadeias:

Duas cadeias pesadas

Duas cadeias leves

As cadeias leves e as pesadas so exactamente iguais

entre si, o que caracteriza o facto do receptor ter apenas uma
especificidade. Ou seja, vai reconhecer em termos
preferenciais um antigenio, tendo dois locais de ligao ao
antigenio. Ento o mesmo receptor reconhece o mesmo
antigenio pelos dois braos que o constituem, propriedade
que dada, pelo facto das duas cadeias pesadas e leves
serem iguais entre si e especificas para o mesmo antigenio.
Considera-se o Bcr um heterodimero, contudo tecnicamente ele um dimero, pois constitudo por
4 cadeias, iguais duas a duas, ou seja constitudo apenas por dois tipos de cadeias diferentes.

O receptor deixa de o ser, quando as cel B forem activadas, transformando-se em plasmocitos

(cel produtora de anticorpos).

Imunoglobulina - termo geral que engloba tanto o receptor B como o anticorpo, no entanto
mais associada ao termo anticorpo.
Fase inicial da vida da cel B

Cl B produzida na medula
ssea, mas tem de deix-la para exercer
a sua funo por todo o organismo (em
especial migra para os rgos linfoides
secundrios como o bao ou ndulos
linfticos). Nesta fase mais posterior
pode entrar em circulao onde pode ser
activada, tornando-se num plasmcito,
produtor de anticorpos.

Desenvolvimento cl B na medula ssea

Divide-se o processo em
fases distintas: que baseando-se
nos estdios de rearranjos do Bcr.
O objectivo de uma cel precursora
de cel B ter o receptor BCR. Para
ter o Bcr a cel vai ter de rearranjar
os locus genicos (um locus para
cada cadeia) que codificam esse
receptor. H um locus para a cadeia
pesada e outro para a cadeia leve.
S com as duas cadeias
rearranjadas, transcritas e
traduzidas que obtm-se um Bcr.

Os locus rearranjados da cadeia pesada e da cadeia leve esto em cromossomas diferentes

que codificam protenas diferentes que numa fase posterior vo ter de emparelhar, heterodimerizar,
e formar o receptor. Mas, ambos os locus tm de sofrer rearranjos para formar genes funcionais,
dando origem s protenas do BCR.

Os genes nas cel somticas esto partidos em pedaos que esto interdispersos em quilopares
de bases, por isso no possvel formar RNAm e protenas funcionais sem haver primeiro o
rearranjo. Os rearranjos vo juntar os pedaos de genes que no fazem sentido despedaados, para
formar um gene funcional da cadeia pesada ou leve.

As divises das fases relacionam-se com rearranjos VDJ:

Cadeia pesada (os segmentos so V, D e J)

Cadeia leve mais pequena (s tem segmentos V e J).

Os rearranjos de ambas as cadeias so assncronos.

No inicio d-se o rearranjo da cadeia pesada, posteriormente que a cadeia leve rearranjada.
Problema da cl em diferenciao

Inicialmente no tem rearranjos nenhuns porque uma cel estaminal (n esta comprometida
com a linhagem B, logo no est a rearranjar os locus da cel B)

Quando comea a rearranjar o locus da cadeia pesada a cel passa a estar comprometida com
a linhagem cel B. Aquela cel j est determinada a ser uma cel B e n pode voltar atrs, pois os locus
so muito especficos, e altamente controlados, para que mais nenhuma linhagem possa rearranj-
los. Comeou o rearranjo da cadeia B, temos uma cel B em potncia que designada de pr-B,
um prottipo de cel B, a fase mais primitiva.

A cl passa de pr-B a pr-B quando j completou o rearranjo do DNA e j tem a protena

que corresponde quele rearranjo funcional.

Diferenas pr-B e pr-B

Pr-B - comeou o rearranjo do DNA, mas ainda no tem nenhuma protena derivada dos
rearranjos, porque os rearranjos no esto completos, e por isso no h um gene funcional.
Pr-B - j terminou o rearranjo da cadeia pesada, j havendo o gene, o RNAm e a protena.

Primeiro vai haver um receptor que deriva dos rearranjos no locus da cadeia pesada. Mas ainda
no uma cel B, porque falta a cadeia leve, que ainda no rearranjou. Para haver Bcr tem de haver
rearranjo cadeia leve e pesada, formando assim uma cel B.

Importncia cadeia leve para a cel B

Os receptores ainda no esto funcionais, pois s o so com a cadeia leve.

Configurao dos receptores s com a cadeia pesada

Deixa de haver um receptor em Y, deixa de haver os 2

braos caractersticos do Bcr, temos um homodmero com duas
cadeias paralelas. Mas, esta molcula no funcional, e nem
sequer excretada para a superfcie. Homodimeros de cadeia
pesada no so estveis.

Como estabilizar um receptor que ainda lhe falta a cadeia

leve?

Produz-se um receptor intermdio: pr-Bcr, que

semelhante ao Bcr, havendo uma substituio das cadeias leves,
por duas protenas VpreB e 5, que ocupam o lugar da cadeia
leve, enquanto ela no est presente. Vo estabilizar o receptor e
permitir que ele v para a superfcie.

O pr-Bcr precisa destas protenas que so muito diferentes relativamente cadeia leve:

Origem- para termos uma cadeia leve precisamos dos rearranjos, enquanto que as protenas
que substituem a cadeia leve no derivam de rearranjos, derivam de genes estruturados que
s precisam de ser transcritos e traduzidos. (as nicas protenas que derivam de rearranjos
so protenas do BCR e TCR)

As protenas VpreB e 5 localizadas no cromossoma 22 nos humanos e no cromossoma 16 nos

ratinhos, tm a caracterstica de emparelhar com a cadeia pesada, estabilizando-a para formar um
complexo prematuro (pr-Bcr) com o precursor do Bcr. Tudo isto ocorre na medula ssea. Em
circulao nada emparelha com a cadeia pesada, porque s saem da medula ssea para a circulao,
as cel que tm Bcr funcional, com cadeia pesada e leve. Ou seja, o pr-Bcr um mecanismo que
permite cel passar a fase em que j tem cadeia pesada e ainda no tem a leve.

Importncia de haver uma fase onde s existe a cadeia pesada e a leve ainda no
rearranjou

Forma de poupar energia. Sabendo que

necessrio rearranjos, se a cadeia pesada rearranjada
intil, ou se o rearranjo foi mal feito, no vale a pena
continuar o processo, porque j existe uma protena
abortiva. Mesmo que exista uma cadeia leve perfeita o
receptor no vai conseguir emparelhar com nada. Este
um checkpoint, que minimiza o gasto de energia para
a cel B (sabendo que produzimos milhes por dia).
Cerca de 70% falham o rearranjo, e por isso nem
sequer chegam a terminar o desenvolvimento Bcr, e
sofrem apoptose. S 30% cel B so teis. Este um
mecanismo complexo, mas o nico mecanismo que
nos permite lidar com o problema da diversidade dos
antignios. S possvel ter receptores to
diversificados, com os genes todos partidos aos
pedaos, e sendo rearranjados aleatoriamente; assim,
conseguimos ter anticorpos contra tudo.

Quando os rearranjos com as RAG correm mal,

temos de eliminar as cel que no so teis. H um espao limitado na nossa circulao que pode ser
preenchido com cel B. O objectivo que todas as cel B em circulao possam interagir com
antignios.

A melhor forma de controlar a formao de Bcr funcionais, saber se a cel tem cadeia pesada
til, caso contrrio morre. o pr-Bcr que permite a passagem de cel pr-B para cel B.

A cadeia leve vai permitir a cel, a formar o Bcr e sair da medula ssea para a periferia.
Fentipo durante o desenvolvimento da cl B

Enquanto a cel B esta a passar por todos estes

estdios, o seu fentipo celular extremamente
dinmico. As protenas que a cel expressa superfcie
e intracelularmente vo variando. Expresso de um
dado receptor, tem a ver com a funcionalidade da cel
na fase em que se encontra.

Exemplo:

Receptor da IL-7 - importante tanto para o

desenvolvimento cel B como T, expresso nas fases
mais prematuras de diferenciao. As cel pr e pr-B
so altamente dependentes da expresso de IL-7. Caso no haja expresso de IL-7 na medula ssea,
as cel atrofiam e no se desenvolvem. Depois de terem passado o checkpoint, a dependncia de IL-7
desaparece deixando de estar superfcie, porque existe um novo receptor que tem o papel de
motor da diferenciao que lhe toma o lugar, que o pr-Bcr.

C-kit - um receptor de cel estaminais, as cel que esto mais prximas das cel estaminais, as cel-me
da cel B, ainda esto dependentes deste factor solvel, que o factor de cel estaminais. Quando as
cel comeam a maturar deixam de ser dependentes do C-kit, e o receptor desaparece. E outros
receptores passam a ser expressos. Ilustrando o quo dinmico o processo de diferenciao de cel
B.

Resumindo

Para termos uma cel pr-B precisamos de ter

uma cel que j esteja a expressar RAG, sem RAG no
h rearranjos nem do BCR, nem do TCR. O facto da
cel pr-B ter RAG, faz com que comece a fazer os
rearranjos VDJ da cadeia pesada. Se os rearranjos
forem mal sucedidos a cel morre. Se forem feitos
com sucesso a cel progride, passa a ter duas cadeias
pesadas, emparelhadas com as duas protenas no
rearranjadas acessrias, formando o pr-Bcr.

1 checkpoint, s as cel com o pr-Bcr que

podero progredir e proliferar para a fase seguinte,
onde vai ocorrer o rearranjo da cadeia leve. A cadeia leve vai tomar o lugar das protenas acessrias,
que estavam no pr-Bcr e formando o receptor final que d origem cel B madura.

Se o rearranjo da cadeia leve for abortivo aquela cel tambm morre. Porque o pr-Bcr, no
consegue dar total funcionalidade cel B, no permite que a cel saia da medula ssea. Este um
novo checkpoint, onde se verifica na medula ssea, qual a cel que consegue colocar sua superfcie
um Bcr funcional. S as cel que recebem sinais especficos atravs do receptor Bcr maduro, que
conseguem sair da medula ssea e so funcionais na periferia.
Quando todo este processo tem deficincias surgem doenas

Agammaglobulinmia- ausncia de
anticorpos na circulao, faz com que
o doente no esteja protegido contra
principalmente os organismos
extracelulares, que desencadeiam
uma resposta humoral forte com
anticorpos especficos. Nesta doena
vai ocorrer uma mutao num dos
genes, bloqueando o sinal gerado no
checkpoint onde temos pr-Bcr, o
pr-Bcr no consegue sinalizar para
dentro da cel, porque a tirosina
cinase da cel B(BTK) no esta funcional. A BTK fundamental na transduo de sinal por
cascatas de fosforilao da cel B. E mesmo que o receptor esteja presente no vai sinalizar,
havendo um bloqueio no processo de diferenciao da cel B, no havendo desenvolvimento
de cel B maduras, logo no h cel em circulao que produzem anticorpos. O indicador
fisiolgico desta patologia, a ausncia de anticorpos de todas as classes no sangue. Todas as
cel B esto bloqueadas em pr-B.

Agammaglobulinmia uma doena ligada ao cromossoma X, porque o gene BTK se encontra

cromossoma X, logo as mulheres so portadoras e os homens doentes. As mulheres
raramente so doentes, porque para isso o pai tinha de ser doente, e se o pai no tem
anticorpos no tem uma vida muito longa, e desaconselhada a procriao.

Tratamento: transplante de medula ssea (como no sindroma de omen onde no temos

RAG), temos uma medula com BTK, possibilitando as cl pr-B completarem o seu
desenvolvimento. O transplante muito complexo pela histocompatibilidade.
Imunossupresso e cl T reguladoras tm de ser controladas para haver maior tolerncia
transplantao.

Na periferia

Fora da medula ssea, vo haver mutaes no DNA que vo alterar o genoma. Isto acontece
quando as cel esto prontas para serem activadas, ou seja, prontas a interagir com o seu antignio, e
receber sinais especficos para proliferar, fazendo anticorpo para que o patogenio da qual aquele
antigenio especfico seja eliminado.

Existem dois processos para alterao DNA periferia:

Hipermutao somtica
Mudana de classe
 Dois processos que ocorrem em cel B funcionais que j saram da medula ssea, vo para a
periferia e vo mudar o tipo de receptor que tm na sua superfcie.

Os receptores de clulas B no so formados na medula de uma forma estanque, s terminado

o processo depois de sarem da medula ssea. Isto s acontece em cel B, no caso das cel T estes
processos que ocorrem periferia no vo existir.

A cel T sai do timo j com o seu receptor final e no pode alterar mais o seu receptor. A cel T
quando deixa o timo j sabe o que vai reconhecer e com que afinidade vai reconhecer.

A cel B sai da medula com um receptor funcional, mas pode mud-los, normalmente no muda
no sentido de ir reconhecer algo totalmente diferente, mas muda a interaco especfica que tem
com aquele antignio. Tem a capacidade nica de tornar-se uma cel B melhor, produzindo um
anticorpo com maior afinidade para determinado antignio.

Resumindo

A cel T sai do timo j com o receptor com determinada afinidade para o antignio
especfico, e j no pode ser moldada. Enquanto que, a cel B vai ter a capacidade de mudar o seu
receptor, a sequencia do seu receptor.

Hipermutao somtica - processo de mudana de

afinidade do receptor das cel B para o antigenio. Est
intimamente relacionada com a maturao da
afinidade - quer dizer que a afinidade anticorpo-
antigenio vai poder mudar, tornar-se melhor, reagir
com mais afinidade com o antignio, para que haja
um reconhecimento melhor, mais eficaz. Isto devido
ao processo de hipermutao somtica.

A hipermutao somtica, consiste em mutaes de nucletidos isolados, na sequncia do

receptor das cel B, estas mutaes acumulam-se todas na regio varivel do anticorpo, a regio do
anticorpo que interage com o antignio (braos do Y), porque a parte constante serve para a funo
efectora das clulas. A parte varivel que faz com que os anticorpos sejam todos diferentes e por
isso reconheam antignios diferentes. No processo de hipermutao somtica h uma acumulao
de mutaes na regio varivel.

As mutaes acumulam-se ao longo da

sequncia, mas h zonas particulares onde no h
mutaes. Essas zonas com uma faixa azul, cdr1,
cdr2, cdr3, so as zonas dentro da regio varivel as
mais expostas, onde h o contacto directo entre o
antigenio e o anticorpo. na zona mais exposta
onde se acumulam as mutaes.
 As zonas que esto menos expostas tm mutaes mais pontuais, no se acumulam tanto.
Processo selecciona molculas que acumulam mutaes nas zonas crticas para a interaco com o
antignio.

Como que as mutaes surgem?

O processo da hipermutao somtica no pode ocorrer completamente ao acaso. Vo haver

processos celulares que vo promover este processo, h uma enzima AID que vai ser responsvel em
particular, por fazer as mutaes e acumul-las. Este processo vai poder ser rentabilizado, pois temos
uma enzima que vai promover reaces de formao de mutao, ou seja, de mudana de sequncia,
mudando a sequncia do anticorpo. Este processo dinmico. Cel B que saiu da medula ssea com
um receptor superfcie, vo ocorrer mutaes ao nvel do DNA. Assim a AID, vai ao nvel do DNA
promover reaces de mutao, mudando as bases dos nucletidos, fazendo com que a sequncia
mude.

Um nucletido diferente, pode levar na maior parte das vezes a uma alterao do aa (no
uma mutao silenciosa), tendo uma repercusso na sequncia da protena, estabelecendo-se uma
nova sequncia para aquela molcula de anticorpo.

Isto acontece na periferia, nomeadamente nos ndulos linfticos ou no bao, onde as cel B se
encontram e acumulam, estando espera de serem activadas pelo seu respectivo antignio. H cel B
que saram da medula ssea com determinado receptor e que no mudaram o seu receptor, mas h
outras que mutaram o receptor, tendo alterado a sua sequncia. O que acontece : ou a mutao
levou a que se obtivesse uma sequncia melhor para reconhecer o antignio, ou a sequncia
desfavoreceu a interaco com o antignio. Se desfavoreceu a ligao receptor-antignio, a cel B que
foi mutada interage pior com o antignio que a cel B que j l se encontrava que veio da medula
ssea e permaneceu intacta. O que faz com que essa cel B que sofreu a mutao tenha uma
desvantagem competitiva, e a cel B s vai proliferar se interagir com o antignio de forma eficaz e se
receber o sinal de activao. Qualquer cel B que tenha uma afinidade pior para o anitgnio, responde
menos ao antignio e por isso fica menos activa.

Caso contrrio, se as mutaes que o receptor sofreu nas regies variveis, fazem com que se
estabeleam pontes de hidrognio com o antignio de uma forma mais eficaz, o receptor de cel B d
uma sinal mais forte cel. Ela replica-se mais, tendo assim uma vantagem competitiva. Em termos
dinmicos o que vai acontecer que as cel B que se vo acumular e produzir anticorpos so aquelas
que vo ter os receptores que so mais afins para o antignio. As cel B seleccionadas, por maior
interaco com o antignio, tornam-se a populao dominante dentro daquele rgo linfoide.

Este processo d-nos ento a possibilidade de produzir anticorpos mais fortes, mais afins
possveis para o antignio em circulao.

Estamos condenados a respeitar a aleatoriedade de processos que ocorrem na medula ssea,

mas podemos ainda mudar e optimizar este processo na periferia, no local onde vamos receber os
antigenios.
 Queremos anticorpos contra todos antignios, mas se a dada altura houver em circulao um
vrus, o que queremos muitos anticorpos para aquele determinado antignio. Da a importncia
deste processo, porque ele dependente do antignio. O processo s ocorre quando este receptor
mutado interagir com o antignio.

Resumindo

A cel B sai da medula ssea com um dado receptor de cel B, chegou ao ndulo linftico ou ao
bao. Quando l chegar um dado antignio especfico para aquela cel interage com ela. A cel recebe
um sinal. Esse sinal, aumenta os nveis da enzima AID que permite mudar o receptor que deu origem
ao sinal.

Assim, a interaco com o antignio vai permitir transmitir um sinal que leva expresso da
enzima AID, que vai at ao DNA e muda a sequncia que d origem regio varivel do receptor cel
B. Mediante as mutaes, os que interagem melhor com o antignio sobrevivem, os piores morrem.
O que permite que se produzam anticorpos cada vez mais especficos, cada vez mais afins.

O processo de mutao de afinidade, significa que o que se est a mudar a afinidade, e no

a especificidade. Sendo as cel mais especificas para determinado antignio as que recebem mais
sinal.

Mudana de Classe

A funo efectora dos anticorpos, dada pela poro

constante do Bcr. No tem a ver com a regio varivel.
Durante a diferenciao das cel vai haver um processo, que
vai permitir a ocorrncia da mudana de classe. Ou seja, que
os anticorpos mudem.

Na medula ssea os anticorpos so produzidos nas

duas classes IgD e IgM.

Vai haver possibilidade de mudar o esqueleto da molcula de anticorpo, para formar

anticorpos de outras classes Igg, IgA e IgE.

IgE - alergias

IgA - mucosas (intestino por exemplo)

IgG - infeces

Este processo permite-nos mudar a classe do anticorpo, passar de um IgD ou IgM para outro
Ig.
Quanto s cel de memria, vamos ter cel que mudaram o seu Bcr, e cel que no mudaram o seu Bcr. Se
aquelas que mudaram o Bcr so mais afins, ento teremos cel de memria mutadas mais afins e cel de
memria sem mutao menos afins. O importante a sua capacidade de reagir muito depressa. Vamos ter cel
de memria com diversos tipos de receptores.

Fazemos cel de memria de todas as cel eficazes a lidar com determinado antignio.

A cel B nunca sai da medula ssea sem os rearranjos VDJ feitos. S sai da medula ssea quando tiver o seu
receptor formado.

Este processo de hipermutao somtico vai ocorrer a nvel de DNA, com a diferena que este DNA j tinha
sido rearranjado nos arranjos VDJ.

A nica diferena que quando a cel B quando vai para a periferia contactar com o antignio pode mudar a
afinidade do receptor. Mas estas mutaes so pontuais e j n tm a participao das RAGs, porque os
rearranjos j acabaram.

A cel B s activa a sua formao de anticorpos quando h antignio no organismo. Tornando-se um plasmocito
(cel b a produzir anticorpos). A maioria das cel B est inactivada.