UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA Y MICROBIOLOGIA

PRCTICA DE LABORATORIO N 05

RECUENTO TOTAL DE AEROBIOS

PRESENTADO POR:
VICTOR VENEGAS CUAILA 2012-36129

CURSO
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

DOCENTE
DR. CESAR JULIO CACEDA QUIROZ

TACNA PER
2017
 PROTOCOLO PRCTICO:

ENUMERACIN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS:

MTODO RECUENTO ESTANDAR EN PLACA POR SIEMBRA EN TODO EL
MEDIO

(ICMSF, 2000)

1. INTRODUCCION:
El anlisis de los alimentos nos ayuda a determinar la existencia, tipo y
nmero de microorganismos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados
habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganismos que
existe en un determinado alimento. Ms que recuentos, estas tcnicas
proveen medios para estimar contenidos microbianos. Son cuatro los
mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de
microorganismos:
Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas
viables,
Mtodo del nmero ms probable (NMP) de grmenes como clculo
estadstico del nmero de clulas viables,
Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de
clulas viables con capacidad reductora,
Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como
para las no viables.

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del

nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un
alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los
siguientes factores:

Mtodo de muestreo utilizado

Distribucin de los microorganismos en la muestra
Naturaleza de la microflora del alimento
Naturaleza del alimento
Antecedentes del alimento
 Adecuacin nutricional del medio de cultivo
Temperatura y medio de incubacin
Ph, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio
Tipo de diluyente utilizado
Nmero relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de

colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una
cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales
determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos
totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos
capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una
amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la
composicin del medio y el tiempo de incubacin.

Tabla 1: Agrupacin de microorganismo dependiendo a su temperatura

de crecimiento.

Fuente: Mtodos de Anlisis Microbiolgicos, Normas Iso, 2006

2. FUNDAMENTO:

2.1. Existen dos mtodos clsicos para el recuento de aerobios mesfilos:

2.1.1. Recuento estndar en placa:
Este mtodo sigue el recomendado para productos lcteos
(Hausler, 1972) y para los alimentos congelados, refrigerados,
precocinados o preparados (AOAC, 1975).
2.1.2. Recuento en placa por extensin en superficie:
Este mtodo es muy utilizado, particularmente en Europa (Barraud
y col., 1967). No se recomienda para muestras en las que es
probable que el nmero de grmenes sea inferior a 3.000/g.

En la conformacin del grupo encontrarnos un grupo heterogneo,

teniendo en comn el carcter aerobio y proliferacin entre 20 y
37C. Encontramos a Bacilos, cocos, formas intermedias, Gram
positivos y Gram negativos.
Significado de su presencia

Indicador de presencia de grmenes patgenos

Indicador del valor comercial de un alimento
Indicador de las condiciones higinicas en que se ha sido
manejado un producto
Como un indicador de la idoneidad de un ingrediente crudo
que se va a incorporar a un alimento
Para verificar la eficiencia de un proceso germicida o de
preservacin
Para predecir la vida de anaquel de un alimento.

Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la

ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora
bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son
recomendables recuentos elevados.
Especificaciones microbiolgicas de Mesfilos aerobios en UFC/g o UFC/ml
establecidas para diversos alimentos.

*NOM-093-SSA1-1994 ; ** Lmites microbiolgicos de la ICMSF (International Commission on

Microbiological Specifications for Foods). ***NOM-031-SSA1-1993; ****NOM-091-SSA1-1994;
*****NOM-243-SSA1-2010

3. OBJETIVO:
Determinar el recuento total de aerobios por el mtodo de recuento estndar
en placa segn ICMSF, presentes en una muestra de chicha de maz.

4. PREPARACIN Y HOMOGENIZADO DE LA MUESTRA (ICMSF, 2000)

4.1. MATERIAL Y APARATOS:

o Homogeneizador de una o dos velocidades, con control por
retrostato.
o Vasos o recipientes de vidrio o de metal, adecuados para el
homogeneizador, de 1 litro de capacidad, con tapa resistente a las
temperaturas de esterilizacin en autoclave. Debe utilizarse un
recipiente estril (esterilizado en autoclave a 121 C durante 15
min.) para cada muestra de alimento a analizar.
o Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g y de una sensibilidad
de 0.1 g.
 o Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos, tenedores,
pinzas, tijeras, cucharas, esptulas o depresores linguales, todo
ello previamente esterilizado en autoclave por aire caliente.
o Pipetas de 1, 10 y 11 ml (de caractersticas idnticas utilizadas para
diluciones de leche; Hausler, 1972).
o Frigorfico, a 2-5 C.
o Agua de peptona para diluciones. Para cada muestra deben
esterilizarse en autoclave, 450 ml en matraces o frascos y 90 o 99
ml en frascos para dilucin de leche (Hausler, 1972) o en
recipientes similares (blancos de dilucin)

4.2. MEDIOS
o Agar recuento en placa

4.3. TCNICA:
o Una vez tomada la muestra debe iniciarse el anlisis tan pronto
como sea posible. La muestra debe refrigerarse a 0-5 C si no
puede ser estudiada inmediatamente despus de su llegada al
laboratorio. Si la muestra esta congelada, descongelarla en su
envase original (o en el recipiente en el que llego al laboratorio)
durante un tiempo mximo de 18 horas en un frigorfico a 2-5 C.
si la muestra congelada puede ser fcilmente triturada (como
sucede con los helados), no es necesario descongelarla.
o Tarar el vaso del homogeneizador estril y vaco y pesar en el 50
+/- 0.1 g representativos de la muestra de alimento (ICMSF, 1974).
Si el contenido del envase no es homogneo (como sucede, por
ejemplo, en un plato precocinado congelado), deber tomarse una
muestra de 50 g a partir de un macerado de todos los componentes
o se analizaran separadamente cada uno de ellos, segn la
finalidad del examen
o Aadir al vaso del homogeneizador 450 ml de agua de peptona
para diluciones. De este modo se obtiene una dilucin de 10 -1.
o Homogenizar el alimento y hacer las diluciones inmediatamente.
Comenzar la homogenizacin con un numero bajo de revoluciones
 y en pocos segundos pasar a muchas revoluciones; o aumentar
gradualmente en pocos segundos, hasta alcanzar las revoluciones
mximas. Controlar cuidadosamente el tiempo de homogenizacin,
de modo que no supere los 2 minutos a muchas revoluciones.
Esperar 2 a 3 minutos hasta que desaparezca la espuma formada.
Hay que tener en cuenta que desde el momento en que se mezclan
la muestra y el diluyente deben evitarse cualquier retraso
innecesario.
o Medir 1 ml de la dilucin 10-1 del homogenizado, evitando la
formacin de espuma, y pasarlo a uno de los blancos de dilucin
conteniendo 99 ml de diluyente, o 10 ml a uno con 90 ml. Agitar
esta dilucin y las subsiguientes enrgicamente 25 veces en un
marco de 30 cm. Repetir esta dilucin utilizando las diluciones
progresivamente ms elevadas para reparar las diluciones 10-2, 10-
3,10-4 y10-5 o las necesarias segn indique la experiencia para el
alimentos que se va a analizar.

5. ENUMERACIN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS:

MTODO RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN TODO EL MEDIO
(ICMSF, 2000).

5.1. MATERIAL Y APARATOS:

Placas Petri de vidrio (100x15 mm) o de plstico (90 x 15 mm).
Pipetas bacteriolgicas de 1, 5 y 10 ml (de idnticas caractersticas
a las exigidas para diluciones de muestras de leche; Hausler,
1972).
Bao de agua o estufa de aire para templar o mantener el medio
fundido 44-46 C.
Estufa de incubacin, 29-31 C.
Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de campo
oscuro o equivalente)
Dispositivo de registro automtico del nmero de colonias
contadas.
 Agar para recuento en placa.

5.2. TCNICA:
Preparar la muestra de alimentos por uno de los procedimientos
de preparacin y homogenizacin de alimentos.
Pipetear por duplicado, en placas Petri, alcuotas de 1 ml de las
diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5 y una alcuota de 0,1 ml de la
dilucin 10-5, lo que supone la siembra por placa de 10 -1 a 10-6 g
de alimento. Se aconseja esta serie de diluciones en aquellos
casos en el que se desconoce el nmero aproximado de grmenes
presentes en el alimento, pero el rango de diluciones preparadas
y sembradas puede modificarse en funcin de la cifra de
microorganismos esperada. De todos modos, siempre deben
sembrarse tres diluciones distintas.
Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor o agua
hirviendo y procurando que este tratamiento trmico no se
excesivamente prolongado. Templar el medio a 44-46 C y
controlar cuidadosamente su temperatura para que al mezclarlo
con la solucin del alimento no sean inactivados los grmenes.
Verter inmediatamente en las placas de Petri 10-15 ml del medio
fundido y templado. El periodo de tiempo transcurrido entre la
realizacin y el vertido del medio no debe superar los 20 minutos
y es preferible que sea inferior a 10 minutos.
Acto seguido mezclar el inoculo con el medio fundido, inclinando y
girando las placas.
Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias placas
conteniendo medio y el diluyente sin inocular. Transcurrido el
tiempo de incubacin, el nmero de colonias presentes no debe
modificar el recuento en ms de una unidad en la segunda cifra
significativa.
Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-
31 C durante 48 +/- 3horas.
Calcular el recuento estndar en placa.
 ESQUEMA DEL PROTOCOLO

Muestra AP
25 ml 225 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1

Cap.500 ml
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

10-2 10-3 10-4 10-5

Agregar 1 ml de cada D + M en cada placa y

posteriormente agregar PCA

Agar PCA + 1%
TTC
10-2 10-3 10-4 10-5

50 ml

15 ml x placa
Bibliografa:

1. Cano, S. (2006). Mtodos de Anlisis Microbiolgicos, Normas Iso,

Consultora Analiza Calidad
2. ICMSF. (2000). Microorganismos de los Alimentos 1. Su significado y
mtodos de enumeracin. Zaragoza (Espaa): ACRIBIA S.A.