Inmunologia Guia 2017

Facultad de Medicina Humana UCSM Inmunologa Bsica
PRACTICA N 1
SUERO Y PLASMA SANGUNEO
INTRODUCCIN
El uso de la sangre como un recurso teraputico se remonta a los primeros albores de la

civilizacin, desde cuando era manejado, mas como componente mtico y mgico, que
como un real elemento cientfico y teraputico.
Hoy en da el uso clnico de la sangre y sus derivados ha cambiado de forma significativa ,

ya que con la aparicin de algunas enfermedades serotransmisibles (hepatitis b, c, e ,
HIV, malaria , chagas)de enfermedades por sensibilizacin ( anemias hemolticas ,
reaccin injerto contra el huesped, etc) el uso de este recurso requiere de un profundo
conocimiento y de una responsabilidad profesional, que hace necesario que todas las
personas involucradas en el rea de la salud tengamos un claro conocimiento de todas
las propiedades y de todo los riesgos potenciales de esta prctica .
La sangre es un tejido muy sui generis, ya que se encuentra en fase lquida y posee
enorme actividad metablica e inmunolgica. Es una suspensin heterognea de varios
elementos formes (leucocitos, eritrocitos, plaquetas) en un medio acuoso rico en mltiples
protenas , enzimas. electrolitos , lpidos, etc.(albmina, globulinas, factores de
coagulacin). Las anteriores caractersticas le imprimen un carcter dinmico a este
elemento y por lo tanto hay que tener en mente esto cuando hagamos uso de el.
El plasma es el medio acuoso de la sangre, desde un punto de vista tcnico, el plasma

puede obtenerse en varias formas, dependiendo de las necesidades, del mtodo utilizado,
de la disposicin tecnolgica o de la necesidad de su ulterior fraccionamiento. El medio
ms corriente para la obtencin es la centrifugacin de una sangre que ha sido extrada
con el uso de anticoagulantes (citrato-dextrosa o ACD, citrato-fosfatodextrosa o CPD,
Citrato-fosfato-dextrosa-adenina o CPDA-1 ,heparina, EDTA)
El suero viene a ser el lquido sobrenadante cuando la sangre coagulada es llevada a

centrifugacin.
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Ambos, el suero y el plasma se deben conversar en condiciones de esterilidad.
OBJETIVOS
- Aislar suero y plasma sanguneo.

- Estudiar las caractersticas del suero y plasma.
MATERIAL
- Equipo para la extraccin de sangre

- Centrifuga
- Tubos de centrifugacin estril
- Jeringa estril y seca
- Pipetas pasteur
- Chupetes
- Una pinza
- Frasco estril de 10ml con tapa hermtica a prueba de aire
- Un mechero bunsen
PROCEDIMIENTO
Obtencin de suero
1. Extraiga 10 ml de sangre de sangre de una vena del brazo

2. Saque la aguja de la jeringa. Deposite la sangre en el tubo para centrifugacin,
tape este inmediatamente.
3. Deje que la sangre se coagule a la temperatura ambiente.
4. Despus de un lapso de 30 minutos a 2 horas, pero no ms, centrifugue la sangre
a la alta velocidad durante 10 minutos. Si no dispone de una centrifuga, la sangre
se puede dejar varias horas en el frigorfico, el coagulo se separar del suero.
5. Destape el tubo. Aspire el suero con una pipeta Pasteur.
6. Deposite el suero en el frasco estril de 10 ml. Coloque inmediatamente la tapa
rosca en el frasco. Si las muestras son pequeas , se puede utilizar tubos
eppendorf.
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Para efectuar algunos ensayos serolgicos, se puede aadir un antisptico

preservativo a la muestra (por ejemplo el timerosal). Cumpla las instrucciones del
laboratorio de referencia.
La mayor parte de los sueros que se emplean en ensayos serolgicos se puede
conservar en el compartimiento congelador del frigorfico a -2C o temperaturas
inferiores, por lo menos un mes.
Obtencin de plasma
Recuerde que la sangre debe ser extrada con anticoagulante.
Describa lo explicado por el profesor
RESULTADOS
Rotule correctamente los tubos correspondientes al suero y plasma sanguneo obtenido

en la prctica. Describa las caractersticas de la sangre, suero y plasma obtenidos.
CUESTIONARIO
1. Cual es la diferencia entre el suero y el plasma.

2. Comente sobre el volumen normal de sangre que debe tener una mujer adulto y un
varn adulto.
3. Describa las caractersticas de los factores presentes en el plasma.
4. Porque se utiliza suero de bovino fetal en los medios de cultivo de clulas
animales a una concentracin de10-15%.
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RECUENTO LEUCOCITARIO Y HEMOGRAMA
INTRODUCCIN
Los glbulos blancos tambin denominados leucocitos, son los encargados de la defensa
del organismo frente a infecciones. Los leucocitos (mononucleados o polinucleados), a
diferencia de los eritrocitos, no contienen pigmentos y son verdaderas clulas con ncleo,
mitocondria y organoides, cabe recalcar que solo un pequeo porcentaje de leucocitos se
encuentra circulando en el torrente sanguneo, la mayor cantidad se encuentra en la
medula sea, tejidos y rganos, donde cumplen funciones especiales.
El recuento leucocitario es una prueba que nos permite determinar el nmero de glbulos
blancos por milmetro cbico de sangre. Se encuentran normalmente entre 5000 y 9000
leucocitos por mm3 de sangre. Estas cifras varan con la edad y con el momento que se
toma la muestra.
Valores elevados: El aumento del nmero de leucocitos circulantes se llama leucocitosis,

se observa en el curso de algunas infecciones bacterianas pigenas.
Valores reducidos: La disminucin del nmero total de leucocitos circulantes se

denomina leucopenia. Se observa en algunas infecciones como la tifoidea y el paludismo.
RECUENTO DE LEUCOCITOS
La concentracin de leucocitos es el nmero de ellos que se encuentran en un litro de

sangre, se expresa como el nmero de leucocitos por milmetro cbico. El recuento
celular tiene como objetivo determinar el nmero, de cada una de las clulas que estn
comprendidas en una unidad de volumen de medio en el que estn suspendidas.
La cmara de neubauer es la ms usada para realizar el recuento celular de forma
manual. Consiste en una placa gruesa de cristal, cuya porcin central est dividida en 3
ejes perpendiculares al eje longitudinal de la cmara. Los dos ejes laterales se hallan ms
elevados con respecto al eje central. La banda central esta subdividida en 2 semi bandas
idnticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la cmara y en cada una
hay grabada una cuadricula que facilitar el recuento celular.
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HEMOGRAMA
Hemograma, es el recuento diferencial o porcentual de los leucocitos, que indican el

nmero de cada tipo celular por mm3 y se realiza examinando un frotis de sangre
coloreado. Se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que se ha encontrado de cada
tipo de ellos. La proporcin de cada tipo de leucocitos se expresa como una fraccin
decimal.
ALGUNOS DATOS GENERALES
No todos los leucocitos (glbulos blancos) que circulan en la sangre son

idnticos.
Hay cinco tipos principales que se diferencian por el tamao, la forma del
ncleo y el color de los grnulos del citoplasma.
La proporcin o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el

diagnstico. Esta proporcin o porcentaje se denomina: Frmula leucocitaria.
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Para trabajar esta frmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que
se ha encontrado de cada tipo de ellos.
Los valores normales de los distintos leucocitos en su proporcin relativa

(Frmula leucocitaria porcentual) y en cifras absolutas por mm3, son:
Cuando las clulas anotadas a la izquierda del recuadro se encuentran por encima
de los porcentajes considerados normales, se dice que hay una desviacin a la
izquierda (infeccin aguda). En ocasiones puede registrarse un aumento del
porcentaje de las clulas anotadas a la derecha, (linfocitos y monocitos) y se dice
que el hemograma muestra una desviacin a la derecha. El aumento de un
determinado tipo de clulas tiene que repercutir en la disminucin de las otras,
para que la suma total sea 100%
a. Examen de la extensin
l. Examinar la extensin de sangre

coloreada con el objetivo de 40x
para comprobar si los elementos
celulares estn bien distribudos y la
tincin es adecuada.
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2. Verificar que los glbulos blancos

se encuentran uniformemente
distribuidos en la extensin: si est
mal distribuida es posible que los
neutrfilos se hallen agrupados.
3. Verificar que la extensin no sea

demasiado gruesa.
4. Si la lmina coloreada, est en buenas condiciones, colocar una gota de aceite

de inmersin
b. Recuento de leucocitos
l. Iniciar el recuento en la ltima

porcin de la extensin, es
decir, donde se observe que los
eritrocitos comienzan a agruparse y
sobreponerse.
2. Examinar una porcin rectangular de la extensin mediante un movimiento

ordenado, de un campo a otro, como se indica en la figura.
3. Tomar nota del tipo de leucocito que se observe en cada campo.
4. Contar un total de 100 leucocitos.
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PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LEUCOCITOS
1. Con la micropipeta de 1000 l ml traslade 950 l del lquido para dilucin de

leucocitos (turk) a un tubo eppendorf.
2. Aspire 50 l de sangre venosa (anticogulada) o capilar.
3. Si la sangre es venosa asegrese que se mezcle completamente invirtiendo el
frasco que contiene esta sangre y el anticoagulante varias veces durante 1 min.
Inmediatamente antes de aspirarla con la micropipeta.
4. Deposite la sangre en el frasco que contiene el lquido para la dilucin. Enjuague la
pipeta aspirando y expulsando este lquido tres veces. La dilucin de esta sangre
ser de 1: 20.
5. Monte la laminilla de vidrio en la cmara de Neubauer, presionndola
cuidadosamente para colocarla en su sitio
6. Mezcle bien la sangre diluida.
7. Por medio de una pipeta llene la cmara de Neubauer .
8. Deje reposar la cmara para recuento sobre la mesa de trabajo durante 3 minutos
a fin de que las clulas de asienten.
9. Coloque la cmara en la platina del microscopio. Utilice el objetivo x 10, reduzca la
cantidad de luz que entre en el condensador, ajustando el diagrama iris, enfoque
la cuadricula de la cmara y los leucocitos.
PROCEDIMIENTO HEMOGRAMA
1. Hacer un frotis sanguneo.

2. Colorear con la tincin de Wright.
3. Llevar al microscopio.
4. Inicie el recuento en la ltima porcin de la extensin.

5. Examine una porcin rectangular de la extensin mediante un movimiento
ordenado, de un campo al siguiente.
6. Tome nota del tipo le leucocitos que se observe en cada campo. Cuente un total de
100 leucocitos.
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7. Vigile que la extensin no sea demasiado gruesa, si observa que la extensin es

cada vez ms gruesa (los eritrocitos se encuentran muy agrupados), detenga el
movimiento hacia el extremo donde comienza la extensin y retroceda hacia la
ltima porcin.
RESULTADOS ANORMALES
NEUTROFILIA
Es el aumento de la proporcin de neutrfilos (ms de 7 000) en sus formas

inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos).
LEUCOCITOSIS
Es el aumento de la cifra total de los leucocitos con cifras superiores a 10 000 o 12

000. Se presenta en infecciones agudas graves.
DESVIACIN A LA IZQUIERDA
Es el aumento de la proporcin de neutrfilos en sus formas inmaduras

(abastonados, mielocitos, metamielocitos). Se presenta en infecciones agudas
graves.
EOSINOFILIA
Es el aumento de la proporcin de eosinfilos (ms de 400). Ocurre en casos de

parasitosis, asma o alergias.
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LINFOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de linfocitos (ms de 3 000). Ocurre en casos de

infecciones virales (sarampin, etc.) y en ciertas infecciones crnicas(tuberculosis,
etc.).
MONOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de monocitos (ms de 800). Se puede observar en

casos de infecciones bacterianas.
NEUTROPENIA
Es la disminucin del nmero de neutrfilos. Puede ocurrir en enfermedades

infecciosas graves.
VALORES NORMALES DE LEUCOCITOS POR GRUPO DE EDAD
PREDOMINIO DE LINFOCITOS
En lactantes y nios menores de 10 aos.
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PREDOMINIO DE NEUTRFILOS
En adultos, nios mayores de 10 aos y recin nacidos.
EXAMEN DE LOS LEUCOCITOS
a. Se debe diferenciar y tomar nota
Forma y tamao de los leucocitos en comparacin con los glbulos rojos

(R).
Forma y tamao del ncleo en relacin con el rea total de la clula de los
diferentes leucocitos:
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Del citoplasma de los diferentes leucocitos:
Las vacuolas y nuclolos constituyen reas ovales o redondas, que no se

tien o lo hacen dbilmente.
Las vacuolas (V) se encuentran en el citoplasma.
Los nuclolos (N) se encuentran en el ncleo.
EJEMPLO
Los neutrfilos polimorfonucleares (P) tienen un ncleo con varios lbulos y

grnulos en el citoplasma (de all que tambin se les llama granulocitos).
Los linfocitos (L) y los monocitos (M) tienen un ncleo compacto y
citoplasma con grnulos o sin ellos.
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CUESTIONARIO Y ACTIVIDADES
I. Cuestionario
1. Haga una clasificacin de leucocitos

2. Dibuje la estructura de un leucocito y rotule sus partes
3. Grafique los Granulocitos y Agranulocitos y explique brevemente sus
caractersticas
4. Comente sobre una patologa causada por aumento de leucocitos
5. Comente sobre una patologa causada por disminucin de leucocitos
6. Realice la caracterizacin de cada una de las clulas observadas.
7. Elabore una tabla de los valores normales de un hemograma por grupos de edad.
8. Defina los siguientes trminos.
NEUTROFILIA:
EOSINOFILIA:
LINFOCITOSIS:
MONOCITOSIS:
NEUTROPENIA:
II. Actividades: Con Ayuda de la frmula leucocitaria, halle el numero de leucocitos

contado en la cmara de Neu Bauer.
Clculo del nmero de leucocitos en un mm3 de sangre
Usar la siguiente frmula:
Leucocitos / mm 3 = leucocitos contados x 10 x 20
4
Leucocitos / mm 3 = leucocitos contados x 50
Notificar el resultado como el nmero de leucocitos que hay en 1 mm3 de
sangre sin diluir.
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Ejemplo:
En los cuatro cuadros se cuentan 188 clulas.
Leucocitos por mm3 = 188 x 50
Resultado que se notifica: 9 400 leucocitos/mm3 de sangre.
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Prctica N 2
OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS
LINFOIDES
I. INTRODUCCIN
Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los

leucocitos. Estas clulas se originan en la mdula sea, y muchas tambin se desarrollan
y maduran ah. Despus migran para proteger los tejidos perifricos, algunas de ellas
residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguneo y en un sistema de
vasos especializado llamado sistema linftico, que drena lquido extracelular y clulas
libres desde los tejidos, los transporta por el cuerpo como linfa, y finalmente se vaca de
regreso hacia el sistema vascular sanguneo.
Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran tambin en grandes

nmeros en tejidos linfoides u rganos linfoides, que son agregados organizados de
linfocitos en una red de clulas no linfoides. Los rganos linfoides pueden dividirse a
grandes rasgos en rganos linfoides centrales o primarios, donde se generan los
linfocitos, y rganos linfoides perifricos o secundarios, donde se mantienen los linfocitos
vrgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas.
Los rganos linfoides centrales son la mdula sea y el timo, un rgano que se encuentra
en la parte alta del trax. Los rganos linfoides perifricos comprenden los ganglios
linfticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vas nasales y
respiratorias, las vas urogenitales, y otras mucosas. Los ganglios linfticos estn
interconectados por medio de un sistema de vasos linfticos, que drenan lquido
extracelular desde los tejidos, a travs de los ganglios linfticos, y de regreso hacia la
sangre.
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II. MATERIALES Y REACTIVOS
- Medio RPMI 1640

- Etanol al 70%
- Tijeras y frceps
- Placas petri
- Jeringas (3ml)
- Agujas 22G1
- Tubos Falcon de 15ml
- Homogeneizador de tejidos de vidrio
- Suspensin celular.
- Hemocimetro
- Pipetas
- Pipetas pasteur
- Tubos eppendorf
- Solucin de Turk
- Azul de trypan, 0.4%(w/v) en agua
- PBS
- Tubo plstico de 5ml
III. PROCEDIMIENTO
A) OBTENCION DE CELULAS
MDULA SEA
1. Matar la rata por dislocacin cervical o inhalacin de CO2. Colocar la rata sobre
una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con etanol para
reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer un corte transversal largo a travs de la piel en la parte media del rea
abdominal. Retirar la piel de las patas traseras.
3. Separar las piernas del cuerpo al nivel de la articulacin de la cadera. Retirar la
grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio.
4. Retirar el tejido muscular del fmur y la tibia. Separar el fmur y la tibia y cortar las
epfisis en ambos extremos.
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5. Inyectar por los extremos del hueso 3ml de medio o PBS, con una jeringa para
expulsar la medula sea
6. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
7. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.
TIMO
una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen la rata con
etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Usando la tijera, hacer una incisin desde la regin xifoidea hasta la regin
submandibular y retirar la piel lateralmente.
3. Hacer una incisin en el trax y separar los bordes de la incisin.
4. Usando el frceps, cuidadosamente agarrar los lbulos tmicos y levntelos.
5. Poner el timo en una placa petri con medio.
6. Cortar el timo en pequeos trozos y haga una suspensin.
7. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el
embolo de una jeringa de 5 ml
BAZO
una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen la rata con
etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer una incisin a travs de la piel en la regin inguinal. Con los dedos sobre
ambos lados del corte, tire entre la cabeza y la cola hasta que la pared peritoneal
este lo suficientemente expuesta. Empapar la cavidad peritoneal con etanol.
3. Cortar el peritoneo, levante el bazo con los frceps, y separe este de los tejidos
adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio.
4. Cortar el bazo en pequeos trozos y haga una suspensin.
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5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el

embolo de una jeringa de 5 ml.
B) CONTEO CELULAR
1. Diluir las clulas en la solucin de Turk.
2. Mezclar completamente y aadir 1 gota en la cmara de Neubauer usando la
pipeta Pasteur o micropipeta
3. Contar las clulas de los cuadrantes de los extremos (1,3,7 y 9). Incluya en este
recuento las clulas que se observan sobre las lneas de dos lados de cada
cuadrado revisado.
4. Conteo de clulas/ml=Numero de clulas (promedio correspondiente a un rea de
1mm2) x factor de dilucin x104.
C) DETERMINACIN DE LA VIABILIDAD CELULAR (Exclusin por azul de Trypan)

1. Mezclar 0.05 ml de la solucin de azul de trypan, y 0.05 ml de la suspensin
celular. Dejar incubar 5 minutos.
2. Transferir una pequea cantidad de la suspensin a la cmara de Neubauer y
contar las clulas. Las clulas no viables estarn teidas de azul.
Clulas viables (%)= Nmero total de clulas viables / ml X 100

Nmero total de clulas / ml
COMENTARIO
- El azul de trypan tiene mayor afinidad por las protenas del suero que por las
protenas celulares. Si el extendido es muy oscuro, resuspender las clulas en
PBS antes de realizar el conteo.
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- No incubar las clulas con azul de trypan por ms de 15 minutos de lo contrario las
clulas viables empezaran a captar el colorante.
ELIMINACIN DE ERITROCITOS DE LA SUSPENSIN CELULAR EMPLEANDO EL

MTODO DEL CLORURO DE AMONIO
MATERIALES Y REACTIVOS
- Suspensin celular
- Tubo falcon de 15 ml
- PBS
- Buffer Lisis de eritrocitos (NH4Cl 0,15M, KHCO3 y EDTA 0,1mM)
PROCEDIMIENTO
1. Mezclar la suspensin celular con el de buffer Lisis de Eritrocitos en una proporcin

(1/4)
2. Mezclar el tubo por inversin 5-6 veces
3. Incubar las muestras sobre hielo, durante 5min (mezclar el tubo 2-3 veces durante la
incubacin).
4. Centrifugar a 4000rpm durante 2 min.
5. Descartar el sobrenadante (cuidando de no eliminar el pellet que contiene los
leucocitos).
6. Lavar el pellet con 1mL de suero fisiolgico y volver centrifugar
Nota: Si el pellet sigue contaminado con eritrocitos repetir la lisis.
IV. RESULTADOS
1. Esquematice el procedimiento de aislamiento de clulas inmunolgicas a partir de la

2. medula sea, timo y bazo
3. Haga un esquema de los rganos linfoides utilizados en la practica
4. Haga los clculos para determinar el nmero de celulas por ml
5. Determine el porcentaje de viabilidad celular
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V. CUESTIONARIO
1. Indique cuales son los rganos linfoides primarios y secundarios

2. Mencione cual es la funcin de los rganos linfoides en la respuesta inmunitaria
3. Cual es la estructura del timo y que importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
4. Comente la relacin estructura-funcin del bazo en la respuesta inmunolgica
5. Explique el fundamento del Mtodo de exclusin del Azul de Trypan
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PRACTICA N 3
EL MACRFAGO COMO SISTEMA INMUNOLGICO: EVALUACION DE LA

PRODUCCION DE OXIDO NITRICO
I. INTRODUCCIN
Dentro de la Medicina y dems ciencias biomdicas, una clula es considerada como un

sistema biolgico que permite al investigador hacer estudios sobre respuesta de una clula
frente a un determinado compuesto, tambin es utilizado para poder expresar genes
forneos, es decir utilizarlos como verdaderas fabricas biolgicas en beneficio del hombre.
Una de las clulas de mamferos ms utilizadas como sistema biolgico para hacer
investigacin en el campo de la Inmunologa, son los macrfagos.
Los macrfagos son glbulos blancos de la sangre que son especializados en la digestin
de partculas y son distribuidos indistintamente en la sangre y tejidos y participan en la
defensa, tanto en la respuesta inmune adaptativa, como en la respuesta inmune innata, a
travs de la ingestin de patgenos, estas clulas tambin participan en el importante rol de
limpieza de clulas daadas o muertas.
II. OBJETIVOS.
- Obtener macrfagos activados a travs de la infeccin de ratas con lisado de

bacterias.
- Extraer, Aislar y Cultivar macrfagos.
- Cuantificar la produccin de Oxido Nitrico (NO)
III. MATERIALES Y REACTIVOS.
- Ratas adultas.
- Cultivo de bacterias (E.coli).
- Jeringas hipodrmicas
- Pipetas pasteur
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- Pipetas de 1,2 y 5 ml
- NaCI 0.9 % y NaCI 1.8 %.
- Sulfanilamida
- Naftilendiamina
- Medio de Cultivo RPMI 1640
IV. PROCEDIMIENTO
A) Preparacin de lisado de bacterias:
1. Con la ayuda de una asa de col cosechar las bacterias crecidas en una placa de
agar nutritivo y resuspenderlas en un tubo de ensayo que contiene 1ml de NaCI al
0.9%.
2. Calentar la suspensin de clulas bacterianas hasta ebullicin, durante tres veces,
agitando cuidadosamente el tubo para evitar que el contenido se proyecte.
B) Infeccin de ratas con lisado de bacterias.
1. Proceder a inyectar intraperitonialmente los ratones con 1.0 ml de lisado bacteriano,

utilizando una aguja hipodrmica apropiada.
2. Al retirar la aguja, de la piel de la rata, hacerle masajes suaves en el vientre durante
unos veinte segundos.
3. Dejar en incubacin al ratn durante tres a cuatro das, cuidando que no le falte la
alimentacin.
C) Extraccin y aislamiento de macrfagos.
1. Transcurrido los das de incubacin, en donde los macrfagos migraran desde la

sangre hacia el lquido citico en donde se encuentra restos de lisado bacteriano,
inyectar 2 ml de NaCI al 0.9 % o PBS, por va intraperitonial.
2. Hacer masajes en el vientre del ratn durante 1 min.
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3. Abrir el abdomen del ratn como indica el esquema y con ayuda de una pipeta, retirar
cuidadosamente todo el lquido ctrico y colocarlo en un tubo de ensayo.
4. Para concentrar los macrfagos, centrifugar la suspensin celular a 2000 r.p.m.,
durante cuatro minutos.
5. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de NaCI a 0.9 %.
6. Realizar el recuento celular con objetivos de mediano aumento.
Nota: Si la suspensin celular se encuentra contaminada con glbulos rojos, lo que

se manifiesta con la presencia de una coloracin rojiza, se recomienda eliminarlos
mediante un choque osmtico: resuspender el pellet en 2ml de agua destilada, y
mezclar durante veinte segundos e inmediatamente aadir 2ml de NaCI a 1.8 % y
proceder con el lavado normal.
D) Cultivo de macrfagos
En una placa de cultivo celular de 24 pozos que contiene 0,5 ml de medio de cultivo
para macrfagos (medio RPMI 1640) sembrar 1x106 clulas e incubar a 37C en un
atmosfera de O2 y 5% CO2 durante 30 a 40 minutos
E) Cuantificacin de xido Ntrico (NO)

1. Terminado el tiempo d cultivo transferir los macrfagos de la placa de cultivo a un
tubo eppendorf
2. Centrifugar la suspensin celular a 2000 r.p.m., durante cuatro minutos.
3. Transferir 500ul del sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf
4. Agregar 500ul del reactivo de Grees
5. Incubar en oscuridad durante 10 min
6. Leer en el espectrofotmetro a 550nm
7. Multiplicar la Absorbancia de la muestra por el factor de calibracin obtenido a partir
de una curva de calibracin con nitrito de sodio
V. RESULTADOS
1. Esquematizar el proceso de obtencin de los macrfagos murinos

2. Determinar el nmero de clulas por ml de suspensin
3. Volumen de suspensin que contiene 1000 000 de clulas
4. Reportar el porcentaje de viabilidad celular
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VI. CUESTIONARIO.
1. Qu es un sistema biolgico?
2. Describa una aplicacin que dara al sistema macrfago para hacer investigacin en
Inmunologa.
3. Indique 4 caractersticas de un macrfago activado
4. Describa la respuesta inmunolgica al inyectar LPS (lipopolisacaridos)
5. Cul es el mecanismo por el cual el macrfago produce NO?
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PRACTICA N 4
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTROFILOS HUMANOS
I. INTRODUCCIN
La densidad de una clula es la principal caracterstica fsica que es usada para la

purificacin y separacin de poblaciones celulares por medio de centrifugacin isopicnica.
La densidad refleja la composicin qumica promedio de una clula mas que su tamao o
alguna caracterstica de su superficie. Los principales componentes celulares difieren
sustancialmente en sus densidades. Sin embargo, ya que muchas clulas tienen similares
proporciones de estos componentes, el rango de densidad de las clulas es relativamente
estrecho. La separacin es conseguida simplemente por centrifugacin de una clula con
la suficiente fuerza centrfuga y por un periodo de tiempo suficiente para que alcance su
densidad isopicnica en la gradiente, que se define como la localizacin en la gradiente
donde la densidad de la clula es la misma que la densidad de la gradiente.
Este mtodo es simple y rpido y toma ventajas de las diferencias de densidad entre las
clulas mononucleares, polimorfonucleares y otras clulas encontrados en la sangre.
Primero las clulas son sedimentadas en dextrano y luego hay una separacin diferencial
en una gradiente de densidad discontinua de ficollhypaque. En el dextrano los eritrocitos
forman roulex y de este modo sedimentan ms rpidamente que los granulocitos En el
ficollhypaque las clulas mononucleares y plaquetas son colectadas en la parte superior
de la capa de, debido a que estas clulas tiene una baja densidad. En contraste los
granulocitos (neutrfilos) tienen una densidad mayor que el ficollhypaque y son
colectados en la parte inferior de la capa ficollhypaque las plaquetas son separadas de
las clulas mononucleares por subsecuentes pasos de lavados y centrifugacin.
II. OBJETIVOS
- Aislar linfocitos y neutrfilos humanos utilizando dextrano y una gradiente de densidad

con ficollhypaque
- Cultivar linfocitos y neutrfilos humanos en medio de cultivo RPMI 1640
26
Figura 1.- Centrifugacin En Gradiente De Densidad De Ficoll Hypaque
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Materiales
- Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)

- Centrfuga
- Micropipetas
- Tubos eppendofts
- Hemocitometro
Reactivos
- Ficoll hypaque
- dextrano
- medio de cultivo RPMI 1640
27
- PBS
- Sangre con anticoagulante ( EDTA )
- Azul de trypan
- NaCl 1,8 %
IV. PROCEDIMIENTO
A. Obtencin de la Sangre
1. Colectar 20ml de sangre en tubos de vidrio con anticoagulante (EDTA)
2. Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.
B. Sedimentacin en dextrano
1. Aadir 2.5 ml de dextrano al 10% por cada 20ml de sangre

2. Mezclar suavemente por inversin 10 veces
3. Dejar sedimentar durante ~40 minutos en posicin vertical
4. Recuperar la capa superior (sobrenadante) y colocarla sobre el ficollhypaque, La
relacin Ficoll sobrenadante debe ser 1:2.
C. Preparacin de la gradiente de densidad con ficoll hypaque
1. Colocar 5 ml de ficollhypaque en un tubo de falcon

2. Colocar lentamente 10 ml del sobrenadante obtenido en la etapa anterior, sobre
el ficollhypaque evitando la mezcla de ambas soluciones
D. Separacin de las clulas
1. Centrifugar a 2000 rpm durante 20 min ( 200 C )

2. Retirar los tubos de la centrfuga lentamente evitando mezclar las fases
3. Colectar la interfase de leucocitos mononucleares ubicada entre la capa de ficoll
hypaque y la capa de plasma y transferirla a un nuevo tubo falcon
4. Luego colectar el pecipitado, conteniendo los neutrfilos, ubicado por debajo de
la capa de ficollhypaque y transferirlo a un nuevo tubo falcon
3. Agregar 10ml de PBS
28
4. Centrifugar a 2000 rpm durante 4 min Si el pellet esta contaminado realizar um

shock osmtico
5. Eliminar el sobrenadante y Resuspender el precipitado celular en 1-2 ml de
medio de cultivo completo (RPMI 1640 ) con suero humano AB+ AL 10 %,
penicilina 100 u / ml, estreptonicina 100 g / ml
6. Contar las clulas y determinar la viabilidad celular por el mtodo de azul de
trypan.
Shock osmtico: Agregar um volumem de agua destilada a las clulas
mezclar por pipeteo , no mas de 28segundos y luego agregar un volumem
igual de NaCl 1,8 %,
E. Cultivo primario de linfocitos y neutrfilos
1. Colocar 3 x 106 clulas ( 1 x106 clulas 1 cm2 ) en placas de cultivo de 60 mm.

de dimetro con 4 ml de medio de cultivo completo
2. Incubar las clulas a 370 C con 5 % de CO2 95 % de humedad.
V. RESULTADOS
1. Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo de linfocitos y neutrofilos

humanos
2. Determinar la viabilidad y el nmero de linfocitos y neutrofilos humanos obtenidos
por mililitro
VI. CUESTIONARIO
1. Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrofilos humanos con

ficollhypaque.
2. Qu caractersticas fsicas de las clulas de la sangre permiten la distribucin
de las clulas de la sangre en distintos capas?.
3. Qu es una gradiente de densidad?
4. indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre
5. Qu es una centrifugacion isopicnica?
29
6. Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la separacion de

linfocitos?
7. Indique cual es la composicin del medio de Cultivo RPMI-1640 en indique la
importancia de sus componetes
8. Porque se utiliza CO2 en el cultivo de Clulas animales o humanas cual es su
funcion? Que buffer se puede emplear en vez del CO2?
30
PRACTICA N 5
ENSAYO COLORIMETRICO DEL TETRAZOLIUM NITROBLUE (NBT): EVALUACION

DE LA PRODUCCION DE ANION SUPEROXIDO (O2-)
I. INTRODUCCIN
Los neutrfilos juegan un rol clave en proteger al cuerpo, utilizando una amplia variedad
de mecanismos microbiocidas dependientes e independientes de oxigeno para eliminar
los agentes infecciosos. Los mecanismos dependientes de oxigeno implican la produccin
de especies reactivas de oxigeno (ROS), atravez de lo que se conoce como la explosin
respiratoria oxidativa, que implica un elevado consumo de oxigeno por estas clulas, y
que son escenciales para la proteccin contra los patgenos invasores. Mientras que los
mecanismos independientes de oxigeno incluyen muchas otras funciones del neutrfilo,
tales como quimiotaxais , fagocitosis, desgranulacion y liberacin de enzimas lticas y
pptidos bactericidas
El sistema responsable de esta explosin respiratoria oxidativa es la NADPH oxidasa, que

es un sistema de transferencia electrnica multicomponente, que cataliza la reduccin del
O2 molecular Los electrones son transferidos desde el citosol y entregados al oxigeno
presente en un compartitmiento intracelular (fagosoma) o extracelular El producto primario
de la NADPH oxidasa es el O2- y su metabolito inicial el H2O2,adems estos ROS son
metabolizados en otros metabolitos reactivos de oxigeno, que son fuertes microbiocidas.
La importancia de la produccin de ROS por los neutrfilos es ejemplificada por la

enfermedad granulomatosa crnica (CGD), caracterizada por recurrentes infecciones
bacterianas y fngicas a lo largo de la vida y la formacin de granulomas tisulares.
El ensayo del NBT se basa en la acumulacin del precipitado formazan azul oscuro El
NBT, permeable a la membrana es reducido al formazan por el O2- el cual es generado
luego de la activacin de los neutrfilos Este ensayo es colorimetrico, sensible y
cuantitativo y puede detectar pequeas cantidades de O2-
31
II. OBJETIVOS
Evaluar la produccin de anion superoxido (O2-) por neutrfilos activados
Materiales
- Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)

- Centrfuga
- Micropipetas
- Tubos eppendofts
- Hemocitometro
- Espectrofotometro
Reactivos
- Ficoll hypaque
- dextrano
- medio de cultivo RPMI 1640
- PBS
- Sangre con anticoagulante ( EDTA )
- Azul de trypan
- NaCl 1,8 %
- NBT
- Dimetilformamida
- KOH 2M
- DMSO
- EDTA
IV. PROCEDIMIENTO
1. Aislar neutrfilos humanos apartir de sangre entera
32
2. Sembrar 1x 105 neutrofilos por pozo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos
en 500 ul de medio DMEM
3. Adicionar 100ul de solucin de NBT a cada pozo
4. Adicionar 1ul de PMA (200ng/ml) o buffer (control no estimulado) a los pozos e
incubar por 30 min a 37 oC
5. Lavar las clulas dos veces con PBS (37oC )
6. Fijar las clulas con metanol y dejar secar las placas al aire
7. Agregar 120ul de KOH 2M por pozo
8. Agregar 140ul de DMSO por pozo y disolver el formazan precipitado por pipeteo
9. Transferir la solucin de NBT disuelta a una cuveta de espectrofotmetro y medir
la absorbancia a 620nm
10. Comparar la absorbancia entre lo neutrfilos estimulados y los no estimulados
para cuantificar la produccin de O2- en cada muestra
V. RESULTADOS
1. Esquematice el ensayo del NBT
2. Hacer los clculos para determinar la cantidad de O2- producida
VI. CUESTIONARIO
1. Indique el fundamento del ensayo del NBT

2. Qu es la explosin respiratoria?
3. Indique los tipos de ROS producidos por los neutrfilos
4. Qu importancia diagnostica tiene la determinacin de O2-?
5. Indique la reaccin catalizada por la NADPH oxidasa
33
PRACTICA N 6
MODELO DE INFLAMACION IN VIVO: EDEMA PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR

CARRAGENINA
I. INTRODUCCIN
El proceso inflamatorio es complejo e involucra una serie de fenmenos que pueden ser
desencadenados por varios estmulos, entre los que se incluyen factores endgenos
(necrosis tisular o rotura sea) o factores exgenos como lesiones por agentes mecnicos
(corte), fsicos (quemaduras, radiaciones, fro, calor), qumicos (corrosivos, venenos,
toxinas), biolgicos (bacterias, virus, parsitos, hongos) e inmunolgicos (reacciones de
hipersensibilidad)
El mismo tiene lugar en el tejido conjuntivo vascularizado e implica cambios vasculares,

eventos celulares, y la produccin de mediadores qumicos de la inflamacin. Todos estos
componentes del sistema, estn estrechamente vinculados. En el proceso inflamatorio
despus de una breve contraccin de las arteriolas se produce vasodilatacin que es la
causa del aumento de flujo sanguneo que a su vez es causa de rubor y calor, y un
incremento de la permeabilidad vascular. Como consecuencia de estos eventos
vasculares se torna lenta la circulacin que hace que los leucocitos se dirijan hacia la
periferia, proceso conocido como marginacin.
Estos leucocitos se sitan sobre el endotelio vascular, lo que se conoce como rodamiento,
se produce la adhesin leucocitaria y posteriormente, la trasmigracin que es el proceso
mediante el cual los leucocitos (fundamentalmente neutrfilos en la inflamacin aguda)
abandonan la circulacin mediante diapdesis.
Una vez fuera del sistema vascular se produce el fenmeno de quimiotaxis, migrando los
leucocitos hacia la zona de lesin. Los factores quimiotcticos pueden ser exgenos o
endgenos. Entre los exgenos estn los productos bacterianos como los pptidos; entre
34
los endgenos estn los componentes del complemento, productos de lipoxigenasa y las
citoquinas.
En la zona de lesin, diversos factores favorecen la activacin leucocitaria como las

sustancias quimiotcticas en concentraciones elevadas, la fagocitosis y complejos
antgeno-anticuerpo. La activacin leucocitaria se caracteriza por la produccin de
metabolitos del cido araquidnico (AA) debido al incremento de la actividad de
fosfolipasa A2 (FLA2) por diacilglicerol (DAG) y calcio, generacin de especies reactivas
del oxgeno (ERO) y liberacin del contenido lisosomal a causa de la lisis celular, lo cual
conduce al dao celular y tisular.
Fig. 2 Pletismometro, para evaluar inflamacin in vivo.
EDEMA PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR CARRAGENINA
Los modelos in vivo para la investigacin de la actividad antiinflamatoria tienen como base
para el ensayo los sntomas de la inflamacin, siendo el ms frecuentemente utilizado el
edema. En estos modelos, la mayora de veces solamente nos permite llegar a determinar
la actividad ms no el mecanismo implicado en el proceso antiinflamatorio que presenta el
compuesto a investigar, pero son de gran importancia ya que nos permiten hacer un
35
evaluacin de esta actividad y puede ser el punto de partida para la investigacin de

nuevos compuestos capaces de interferir en el proceso inflamatorio.
El mtodo de edema plantar inducido por carragenina consiste en la administracin

subcutnea de una solucin de carragenina a nivel de la aponeurosis plantar de la rata,
provocando una reaccin de carcter inflamatorio mediada por la liberacin de diversos
autacoides (histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas) adems diversos factores
del complemento que estn implicados en la amplificacin de la respuesta. El producto a
ensayar se puede administrar va intraperitoneal, oral, etc.
Una hora despus de la administracin de la sustancia problema, la histamina y la

serotonina tienen un papel principal como mediadores. De una hora y media a dos y
media horas despus de la inyeccin de carragenina, intervienen las cininas como
mediadores. La ltima fase esta mediada por prostaglandinas (PGE1 y PGE2, PGF2).
La respuesta vascular mxima ocurre aproximadamente a las 4 horas de la administracin

de carragenina y coincide con la fase mediada por las prostaglandinas. La extravasacin
de protenas ocurre durante toda la respuesta al agente edematgeno. La migracin
celular, fundamentalmente leucocitos polimorfonucleares, comienza a las 2 horas de
haberse inyectado el agente.
Se prefiere la carragenina ante otros irritantes porque el edema producido esta menos
modificado por factores ajenos a los propiamente caractersticos de la inflamacin y
adems, porque la actividad antiinflamatoria de este ensayo guarda una buena
correlacin con la actividad anti-inflamatoria en clnica.
36
Fig. 3 Fases de la Inflamacin
II. OBJETIVOS
- Inducir inflamacin in vivo en ratas

- Determinar el porcentaje de inflamacin inducida
3.1 REACTIVOS
- Carragenina
- Suero fisiologico
- NaCl 0.1%
- Triton X100
- EDTA 5mM
37
3.2 MATERIALES
- Pletismometro
- Micropipetas
- Jeringas 1ml
- Tubos Eppendorf
- Bao maria
IV. PROCEDIMIENTO
A. Preparacin de la solucin de carragenina 2%
1. Pesar 20mg de carragenina y agregar 1ml de suero fisiolgico

2. Disolver la carragenina calentando la solucin a 80 oC
B. Induccin de inflamacin
1. Inyectar en la aponeurosis plantar de la pata trasera derecha de la rata 100ul

de la solucin de carragenina al 2%, dejar la pata izquierda sin inyectar
2. Esperar 1 hora y realizar la medicin del volumen de ambas patas utilizando el
pletismometro.
C. Medicin de la Inflamacin
1. Calibrar el pletismometro con una solucin de NaCl 0.1% y Triton X100,

llevando a 0 ml (cero) el instrumento para luego colocar una pesa de 3ml en el
reservorio de medida y apretar el botn de calibrado, la pantalla deber
mostrar el valor de 3ml, lo cual indica que el instrumento ya esta calibrado Al
retirar la pesa la pantalla deber mostrar 0 ml
38
2. Introducir primero la pata no inyectada (izquierda) en el reservorio de medida y

anotar la lectura que aparece en la pantalla
3. Luego introducir la pata inyectada (derecha) en el reservorio de medida y
anotar la lectura que aparece en la pantalla.
C. Calculo del porcentaje de Inflamacin
1. Con las lecturas del pletismometro correspondientes a cada pata trasera

aplicar la siguiente frmula para determinar el porcentaje de inflamacin
%inflamacin= Vt (pata derecha) Vnt (pata izquierda) X 100
V. RESULTADOS
Esquematice los pasos para la induccin de inflamacin in vivo
Haga los clculos para determinar el porcentaje de inflamacin hasta las dos horas
VI. CUESTIONARIO
1. Defina inflamacin aguda y crnica

2. Mencione los principales eventos que ocurren en un proceso inflamatorio
3. Describa el modelo de edema plantar por carragenina en la pata de la rata y
que ventajas tiene frente a otros modelos
4. Mencione y comente otros modelos para evaluar actividad inflamatoria in vivo
5. Esquematice el diseo experimental para evaluar la actividad antiinflamatoria
de un flavonoide obtenido a partir del llantn
39
INMUNOAGLUTINACION N 7
DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDEO (FR)
OBJETIVO
Conocer el fundamento de la tcnica de Inmunoaglutinacion y sus

aplicaciones en el diagnstico mdico.
Determinar el Factor Reumatoideo en suero, utilizando la tcnica de
Inmunoaglutinacin.
1. INTRODUCCION
La artritis reumatoidea es un sndrome crnico de etiologa desconocida,

caracterizado por una inflamacin inespecfica y generalmente simtrica de las
articulaciones, que a veces evoluciona hacia la destruccin de las estructuras
articulares y periarticulares.
En la articulacin enferma se observa un engrosamiento de la membrana sinovial

con formacin de pliegues y proliferacin de linfocitos. Estas clulas, que forman
folculos linfoides, son las responsables de la sntesis de factores reumatoideos
(FR) y otras inmunoglobulinas.
Los FR son generalmente de tipo IgM anti-IgG, es decir que reaccionan con las
fracciones Fc de las IgG. Tambin se han encontrado FR de tipo IgG, aunque en
menor proporcin de casos.
Los FR de tipo IgM estn presentes en el 85-90% de los adultos con artritis
reumatoidea aunque no es especfico de la enfermedad puesto que tambin se
han encontrado en individuos sanos (en un 3 a 5% de los casos).
40
Por tal motivo, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad distinta de la

artritis reumatoidea, frente a una reaccin de aglutinacin positiva es aconsejable
realizar la precipitacin de las globulinas con sulfato de amonio. De tal forma, se
asegura la precipitacin completa de los FR y se mantiene en solucin cualquier
aglutinina responsable de una falsa reaccin positiva, como as tambin algn
posible inhibidor.
2. FUNDAMENTO DEL METODO
La prueba rpida de latex esta basada en una reaccin inmunolgica entre el

Factor Reumatoideo (FR) presente en el suero problema y la correspondiente IgG
humana ligada a partculas de poliestireno. Cuando se mezcla el suero problema
conteniendo el Factor reumatoideo con el reactivo RF latex, se puede visualizar
una aglutinacin.
UTILIDAD DIAGNOSTICA: En la mayora de los sueros de pacientes con

poliartritis crnica evolutiva se detecta la presencia de macroglobulinas, factores
reumatoides, capaces de aglutinar partculas inertes sensibilizadas con gamma-
globulina humana. La prueba de aglutinacin del Latex FR Directo permite
diferenciar esta enfermedad de aquella otra denominada como reumatismo
articular o fiebre reumtica en la que no se hallan dichos factores.
Una nica prueba de laboratorio no permite establecer un diagnstico. Los
resultados se han de evaluar en el contexto de todos los datos clnicos y de
laboratorios obtenidos
3. REACTIVOS Y MATERIALES
3.1. REACTIVOS
LATEX RF : Suspensin de partculas de latex sensibilizadas con IgG

humano en buffer salino de glicina.
41
BUFFER SALINO: Solucin salina fisiolgica (NaClO, 9%). Listo para usar.
CONTROL POSITIVO: Suero Humano prediluido y estabilizado
conteniendo RF que aglutina con el reactivo latex.
CONTROL NEGATIVO: Suero Humano prediluido y estabilizado, no
reactivo en el test de aglutinacin.
Solucion fisiolgica.
3.2. MATERIALES
Muestra de Sangre
Tubos Vacutainer Seco (Tapa roja)
Algodn
Etanol al 70%
Ligadura
Jeringas de 3 cc
Descartador de punzocortantes
Timer
Fuente de luz
Micropipetas Automticas de 20ul, 200ul a 1000ul.
Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul
01 placa de fondo oscuro con 3 o 6 reas de reaccin.
Varillas mezcladoras
4. METODOLOGIA
4.1. Recoleccin de la Muestra

Extraer la muestra de sangre por Venopuncin del antebrazo, tomndose
todas las medidas de Bioseguridad en la obtencin de la muestra.
Recolectar 3ml de Sangre con la ayuda de una jeringa.
Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja), centrifugar y separar
la sangre del suero.
42
5. DESARROLLO
5.1. Mtodo Cualitativo en Placa
1. Dejar que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente.

2. Poner 20ul del suero en las reas marcadas en la lmina.
3. Colocar 20ul del suero control positivo (+) y negativo (-) en las reas
marcadas de la lamina.
4. Mezclar el reactivo de latex FR hasta obtener una suspensin homognea y
aadir 20ul de reactivo de latex a cada uno de los sueros controles y
muestras.
5. Mezclar con aplicadores diferentes por cada rea.
6. Mover en un ngulo de 45 la laminilla por 3 minutos.
7. Observar inmediatamente la aglutinacin utilizando una fuente de luz directa,
comparar las reacciones del suero y de los controles.
Interpretacin:
La aglutinacin de las partculas de latex indica una reaccin positiva (+).

Si es asi, realizar la prueba Semicuantitativa.
La No aglutinacin o una ligera aparicin de granulosidad que no exceda
a la observada en el control negativo (-), indica un resultado (-).
5.2. Mtodo Semicuantitativo o Titulacin
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas, en 6

tubos de ensayo.
1. Colocar 100ul de solucin Fisiologica en cada uno de los tubos.
2. Agregar 100ul de suero al tubo N 1 y homogenizar cuidadosamente.
Transferir 100ul de esta dilucin al tubo N 2 y homogenizar, continuando de
esta forma las diluciones hasta el ultimo tubo.
Las diluciones asi obtenidas equivalen a : 1: 2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64.
43
3. Transferir 20ul de cada tubo y proceder de acuerdo a la prueba Cualitativa.
Interpretacin de los Resultados
Negativo: Suspensin homognea (sin aglutinacin)

Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos
Titulo: Es la inversa de la mxima dilucin a la que se produce
aglutinacin visble macroscpicamente.
La concentracin del Factor Reumatoideo en la muestra puede ser
calculada con la siguiente formula:
FR (IU/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reaccin (8 IU/ml)
Nota: La sensibilidad del reactivo es de 8 IU/ml.
6. CUESTIONARIO
1. Define que es Factor Reumatoideo.

2. Por qu no es aconsejable trabajar con sueros con alto contenido de lpidos,
o que el plasma tenga fibrina?
3. Por qu la artritis reumatoide se considera una enfermedad autoinmune?
4. Calcular la Titulacin de una muestra positiva para FR, teniendo positividad en
la dilucin 1:8
44
PRACTICA N 8
INMUNOPRECIPITACION
IDENTIFICACION SEROLOGICA DE SIFILIS, EMPLEANDO LA TECNICA RAPIDA DE
REAGENTES DE SIFILIS (RPR)
1. OBJETIVOS
Conocer el fundamento de la Inmunoprecipitacion como prueba serolgica.

Conocer la respuesta inmunolgica de nuestro organismo, frente a la Sfilis.
2. INTRODUCCION
La sfilis es una enfermedad venrea causada por el Treponema pallidum, que

invade las mucosas intactas o la piel en reas de abrasiones. El contacto sexual
es la forma ms comn de transmisin. La deteccin y tratamiento de la
enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar
complicaciones graves como sfilis cardiovascular, neurosfilis y sfilis congnita. El
diagnstico de esta enfermedad sufre la carencia de un mtodo para cultivar el
microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios
de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidrmicas. Sin embargo,
desde el comienzo de la infeccin aparecen en el suero del individuo infectado
ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antgenos de
cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clnicos son por
lo tanto los procedimientos ms rpidos y tiles disponibles para diagnstico de
sfilis.
FUNDAMENTOS DEL METODO
En la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), las "reaginas" presentes en

el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por accin
de las mismas con antgeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre
45
partculas de carbn. La reaccin produce una aglutinacin visible

macroscpicamente, favorecida por las partculas de carbn. Las reacciones
inespecficas se evitan con el empleo de antgeno altamente purificado y el
agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra.
3.1. REACTIVOS
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: suspensin de antgeno de cardiolipina 0,003%, lecitina 0,02%

y colesterol 0,09%, adsorbido sobre partculas de carbn 0,02%
especialmente tratado en buffer fosfatos 0,01 mol/l con cloruro de colina
0,72 mol/l, EDTA 12,5 mmol/l y conservantes apropiados. Control Positivo:
dilucin de suero reactivo. Control Negativo: dilucin de suero no reactivo.
REACTIVOS NO PROVISTOS Si se desea realizar la tcnica semicuantitativa

se requiere adicionalmente solucin fisiolgica (ClNa 9 g/l).
B. Reactivos
Antigeno RPR Carbon, que contiene:
Cardiolipina 0.003%
Lecitina 0.022%
Colesterol 0.09%
Cloruro de Colina 10.0%
Carbon 0.02%
EDTA 0.0125M
Na2HPO4 0.01M
KH2PO4 0.01M
Control Positivo (Suero de origen humano, reactivo frente al
antigenoRPR Carbon)
Control Negativo (Mezcla de sueros de origen animal, no reactivos.
46
3.2. MATERIALES
Muestra de Sangre
Algodn
Etanol al 70%
Ligadura
Jeringas de 3 cc
Timer
Fuente de luz
01 placa de fondo oscuro con 3 o 6 reas de reaccin.
Varillas mezcladoras
Tarjetas de reaccin
Gotero metlico para dispensar el Reactivo
Goteros plsticos descartables para dispensar y distribuir las muestras
4. METODOLOGIA
4.1 Recoleccin de la Muestra

Extraer la muestra de sangre por Venopuncin del antebrazo, tomndose
todas las medidas de Bioseguridad en la obtencin de la muestra.
Recolectar 3ml de Sangre con la ayuda de una jeringa.
Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja), centrifugar y separar
la sangre del suero.
47
4.2 PRUEBA CUALITATIVA

Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar
el ensayo. En cada uno de los crculos de la tarjeta de reaccin colocar
con un gotero plstico provisto:
Muestra o Controles 1 gota (50 ul) Con el extremo cerrado del gotero
distribuir la muestra uniformemente en todo el crculo. Con el gotero
metlico provisto, en posicin vertical, agregar en el centro del crculo:
Reactivo A 1 gota (17 ul) SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la
tarjeta de reaccin en forma manual o con agitador rotativo a 100 rpm
durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinacin al
cabo de este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a
falsos resultados.
4.3 PRUEBA SEMICUANTITATIVA Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8,

hasta 1:64 empleando solucin fisiolgica y proceder de la misma manera que
en la tcnica cualitativa. El ttulo estar dado por la inversa de la ltima dilucin
que se observe reactiva.
5. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
REACTIVO (POSITIVO): Presencia de aglutinacin visible en forma de grumos

negros sobre el fondo claro que indica presencia de "reaginas" en la muestra.
NO REACTIVO (NEGATIVO): Aspecto gris homogneo que indica ausencia
de "reaginas" en la muestra.
6. LIMITACIONES DE LA TECNICA
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.

Evitar el contacto de los dedos con los crculos de la tarjeta de
reaccin, dado que el depsito de grasa en los mismos puede
ocasionar una mala distribucin de la muestra, produciendo resultados
errneos.
48
Si la muestra no puede ser distribuida uniformemente en toda la

superficie de prueba, se recomienda utilizar otro crculo de la tarjeta.
Una vez utilizado el gotero metlico para dispensar el Reactivo A,
descartar el remanente y enjuagarlo con agua destilada.
El Reactivo A debe dispensarse manteniendo el gotero en posicin
vertical respecto de la tarjeta de reaccin a fin de asegurar que el
volumen de la gota sea el correcto.
A temperaturas elevadas o humedad ambiente baja se recomienda el
uso de una cmara hmeda durante la rotacin, para evitar que las
muestras se sequen.
En individuos con cuadros patolgicos diversos como hepatitis,

influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cncer,
diabetes y enfermedades autoinmunes, pueden obtenerse resultados
falsos positivos. Estos casos se presentan con ttulos bajos y una
historia clnica que no coincide con las caractersticas de sfilis.
Pueden observarse resultados falsamente negativos cuan do se
presenta el fenmeno de prozona. Por este motivo se recomienda
repetir la prueba con muestra diluida al 1:5 con solucin fisiolgica para
verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa aglutinacin,
la muestra es reactiva.
No obstante las ventajas del mtodo, sus resultados, al igual que los de
cualquier mtodo serolgico, slo constituyen un dato auxiliar para el
diagnstico que debe corroborarse con la historia clnica del paciente
7. CUESTIONARIO
7.1 Qu diferencia existe entre las reacciones de RPR y VDRL?

7.2 Qu son las Reaginas?
7.3 Por qu en la prueba de RPR, el suero no debe de tratarse trmicamente?
7.4 Cuntos tipos de pruebas existen para determinar la sfilis?
7.5 A qu se refiere el fenmeno de prozona en la prueba de RPR?
49
PRACTICA N 9
INMUNOCROMATOGRFIA
DETECCIN DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV),

ANTIGENO DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B (HBSAG) Y SIFILIS ANTI -TP.
1. INTRODUCCION
La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms

modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba.
Actualmente se utiliza como prueba rpida de tamizaje para la deteccin de
antgenos o anticuerpos presentes en el suero del paciente.
Las pruebas mas comunes que utilizan la tcnica de Inmunocromatografia

en el laboratorio de anlisis clnicos y son mayormente indicadas por los
mdicos son: diagnstico de embarazo (deteccin de hormona
gonadotropinicacorionica humana hGC), rotavirus, Sangre oculta en Heces,
Chlamydia sp, Leptospira sp., VIH, virus del dengue, virus respiratorios, etc.
2. INMUNOCROMATOGRAFIA
La inmunocromatografa consiste en la migracin de una muestra (suero, plasma,

orina, entre otros) en una membrana de nitrocelulosa la cual contiene anticuerpos
especficos contra el antgeno o analito que se desea detectar.
En el siguiente esquema se resume el fundamento del mtodo:
a. Primero: La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva
impregnada un conjugado formado por un anticuerpo especfico contra uno de los
eptopos del antgeno a detectar y un reactivo de deteccin. Si la muestra contiene
el antgeno a detectar, ste se unir al conjugado formando un complejo y
50
empezarn a migrar a travs de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarn el

conjugado y la muestra sin unirse.
b. Segundo: La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo

especfico contra otro eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los
complejos formados por la unin del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la
lnea se colorear (muestras positivas). Si la muestra no contiene el antgeno, el
segundo anticuerpo no captura nada y la lnea queda trasparente (muestras
negativas).
c. Tercero: La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al
reactivo de deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el
anticuerpo se unir al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de
captura. Esta lnea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se
colorea siempre, con muestras positivas y negativas.
Fig. N1 Estructura lateral del Ensayo.
51
2.1 Ensayo para la Deteccin del Virus de Inmunodeficiencia Humana

(HIV)
El agente etiolgico del sndrome de inmunodeficiencia adquirida

(SIDA) es, un retrovirus designado como Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (HIV). El HIV es transmitido por contacto
sexual y de la madre al feto o nio durante el periodo perinatal.
Existen 2 tipos de HIV que son el HIV 1 y HIV 2. La presencia de
anticuerpos contra HIV es evidencia aceptable de infeccin o
exposicin previa para este virus, pero la prueba de anticuerpos para
HIV tiene limitaciones. Los anticuerpos usualmente aparecen dentro
de las 3 a 6 semanas despus de la exposicin y subsecuente
infeccin contra HIV. Debido a que las personas infectadas no
desarrollan anticuerpos inmediatamente, un resultado negativo no
puede tomarse como infeccin por HIV reciente. Un resultado
negativo no puede descartar la infeccin por HIV reciente, la prueba
debe repetirse despus de 6 meses.
Este anlisis es un Inmunoensayo cromatografico para la deteccin

cualitativa de anticuerpos contra el HIV en suero, plasma o sangre
total, la prueba esta destinada para uso profesional como una ayuda
en la deteccin de anticuerpos contra el HIV, tres protenas
recombinantes seleccionadas especialmente del HIV se utilizan en la
prueba (p24 y gp41 para HIV 1 , gp36 para HIV 2).
2.2 Ensayo para la Deteccion de Antigenos de Superficie para

Hepatitis B (HBsAg)
Es un inmunoensayo cualitativo de membrana para la deteccin del

antgeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) en suero o
plasma humano a una concentracin igual o superior a 1 ng/ml. La
52
membrana est recubierta por anticuerpos anti-HBsAg en la regin de la

banda de la prueba. Durante el ensayo la muestra reacciona con la
partcula recubierta con anticuerpos anti-HBsAg.
La mezcla migra a lo largo de la membrana cromatogrficamente por

accin capilar para reaccionar con los anticuerpos anti-HBsAg de la
membrana generando una lnea de color. La presencia de esta lnea de
color en la regin de la banda del Test indica un resultado positivo,
mientras que su ausencia indica un resultado negativo. La aparicin de una
banda coloreada en la regin de Control sirve como procedimiento de
control. La aparicin de esta lnea se utiliza para verificar que se ha
aadido el volumen de muestra suficiente, que el flujo ha sido apropiado.
2.3 Ensayo para la Deteccion de Sifilis Anti-TP
Treponema Pallidum cassette es una prueba para la deteccin de anticuerpos

IgM e IgG de Treponema Pallidum (TP) mediante la interpretacin visual del
desarrollo de color en la tira interna. Antgenos recombinantes especficos del
TP han sido inmovilizados en la zona de test de la membrana. Cuando se
aplica la muestra (S), esta reacciona con el antgenoTP recombinante
especfico, conjugado con partculas de color y pre-sensibilizado sobre la
almohadilla de muestra de la prueba. La mezcla migra cromatogrficamente
hacia el otro extremo de la membrana y reacciona con los anticuerpos de
Treponema Pallidum (TP) de la superficie. Si la muestra de suero o plasma
contiene TP, aparecer una lnea de color en el rea de prueba, mostrando un
resultado positivo. La ausencia de una lnea de color indica que el suero, o
plasma no contiene TP, mostrando un resultado negativo. Como prueba de
control de procedimiento aparecer siempre una lnea en la regin de control
si la prueba se realiz de forma adecuada.
53
a. REACTIVOS
TEST SD HBsAg (BIOLINE)

TEST SD SYPHILIS 3.0 (BIOLINE)
TEST SD HIV (BIOLINE)
b. MATERIALES
Muestra Problema para HIV (SUERO)

Muestra Problema para Rotavirus y Sangre Oculta en Heces (Heces
Fecales)
Dispositivos de Prueba (Sachetes diferentes para cada prueba)
Guantes de latex
Etanol al 70%
Ligadura
Jeringas de 3 cc
Timer
Papel Toalla.
4. METODOLOGIA
a. Deteccin del Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV).
- Colectar 100ul de la muestra de Suero del paciente.

- Dejar los reactivos a Temperatura Ambiente por 10min.
- Con la ayuda de una micropipeta aadir 20ul de la muestra en
la zona de conjugado, luego aadir 3 gotas del Reactivo de
Deteccin.
54
- Esperar que la muestra corra por espacio de 5min.

- Observar y anotar los resultados.
b. Deteccin de Antgenos de Superficie para Hepatitis B (HBsAg)

Deteccin.
c. Ensayo para la Deteccin de Sfilis Anti-TP

Deteccin.
5. RESULTADOS
En la siguiente tabla codificar las muestras analizadas en la prctica y los

resultados obtenidos segn cada ensayo.
55
CODIGO DE LA DETECCION DE DETECCION DETECCION

MUESTRA HIV HBsAg Sifilis abti-
TP
6. CUESTIONARIO
1. Mencione 3 Ventajas y 3 Desventajas del mtodo utilizado.

2. Proponga 2 Test que sean ms sensibles y especficos para cada una
de las Enfermedades Estudiadas. Indique el porqu de su decisin.
3. Indique 3 limitaciones que tenga la Inmunocromatografia en el
diagnstico clnico.
4. Explique en qu consisten los test de 3ra y 4ta generacin, que
emplean la tcnica de Inmunocromatografia, para realizar deteccin de
algn patgeno.
56
PRACTICA N 10
ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA)
DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEINAS Y PEPTIDOS
CITRULINADOS
1. OBJETIVO
Cuantificar cualitativamente los niveles de anticuerpos contra protenas y

pptidos citrulinados (Anti-CCP).
Comprender el fundamento de la tcnica ELISA () como tcnica de
diagnstico inmunolgico.
2. INTRODUCCION
La artritis reumatoide (AR) es la enfermedad articular ms frecuente, con una

prevalencia mundial estimada en 0,5-1% (Dejaco et al., 2006). La prueba
serolgica de apoyo diagnstico ms tradicional para esta enfermedad ha sido la
determinacin del factor reumatoide, la cual adolece de una baja especificad
diagnstica. A pesar de que el factor reumatoide puede ser encontrado hasta en el
80% de los pacientes que sufren AR, es conocido que otras enfermedades
autoinmunes, y an hasta un 5-30% de personas sanas de edad avanzada,
pueden presentar este marcador serolgico. Algunos otros autoanticuerpos que se
encuentran en los pacientes con AR poseen menor sensibilidad diagnstica, pero
mayor especificidad para detectar esta enfermedad. Entre estos autoanticuerpos
estn el denominado "factor perinuclear" y los anticuerpos anti-keratina. Al estudiar
la especificidad molecular de estos autoanticuerpos, se encontr que reconocen
una protena producida en las etapas avanzadas de la diferenciacin de las clulas
epiteliales durante la keratinizacin, llamada filagrina (Kuhn et al., 2006).
Durante el procesamiento de la filagrina, algunos de sus residuos de arginina son

deiminados por enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs),
57
que los convierten de esta manera en residuos de citrulina (Fig.1). El suero de los
pacientes con AR posee frecuentemente anticuerpos que reconocen regiones
citrulinadas de la filagrina, as como de al menos dos protenas ms que presentan
este tipo de modificacin posttraduccional, como lo son la fibrina y la vimentina
citrulinadas. Interesantemente, existe evidencia de que los autoanticuerpos que
reconocen protenas citrulinadas no solo tienen un inters diagnstico, sino que
pueden jugar un papel patognico en modelos de artritis reumatoide
experimentales (Kuhn et al., 2006), a diferencia del factor reumatoide.
Las primeras pruebas serolgicas dirigidas a detectar anticuerpos contra filagrina

citrulinada utilizaron esta protena, obtenida en forma recombinante y
posteriormente modificada in vitro. Sin embargo, algunas de las limitaciones de
esta estrategia fueron la dificultad en obtener un contenido reproducible de citrulina
en este antgeno, afectando la estandarizacin de la prueba. Sumado a esto, se
demostr que en los sueros de pacientes con AR y an en individuos sanos,
pueden hallarse autoanticuerpos contra la filagrina no citrulinada, que podan
conducir a resultados falsamente positivos. Un adelanto importante en el desarrollo
de estas pruebas sobrevino al introducirse el uso de un pptido sinttico
citrulinado, derivado de la filagrina. Esto simplific la deteccin de los anticuerpos
contra protenas citrulinadas y mejor sustancialmente la estandarizacin, en
comparacin con el uso de la protena completa. Mediante la ciclizacin del
pptido, se encontr que el epitopo que contiene citrulina queda ptimamente
expuesto, llevando a una mejor sensibilidad de la tcnica. Los primeros estudios
basados en el uso de un pptido cclico citrulinado (CCP) describieron una
sensibilidad diagnstica de 68% con una especificidad para AR de 97-98% (Pruijn
et al., 2005). Mediante tcnicas de tamizaje realizadas sobre bibliotecas especiales
de pptidos citrulinados se introdujo el uso de nuevas generaciones de CCP que
han permitido elevar la sensibilidad diagnostica para AR hasta 80% (similar a la
que provee la determinacin del factor reumatoide), con una especificidad del
98%. Un conjunto de estudios apoyan la conclusin de que la deteccin de
anticuerpos contra CCP provee un mejor apoyo diagnstico para distinguir la
artritis reumatoide de otras enfermedades. Adicionalmente, se ha encontrado que
la deteccin de anti-CCP, cuya presencia en individuos sanos es menor del 1%, es
un marcador temprano para el desarrollo de AR. El seguimiento de un grupo de
58
individuos que presentaron la prueba positiva, en ausencia de manifestaciones

clnicas, mostr que posteriormente una proporcin desarroll la enfermedad. Esta
utilidad pronstica es sumamente valiosa, dado que le posibilita al clnico apoyar
sus decisiones teraputicas en la implementacin de un control farmacolgico
temprano de esta enfermedad, antes de que se presenten lesiones erosivas
avanzadas en las articulaciones.
Fig. 1 La conversin de un residuo de arginina en citrulina es catalizada por

enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs). Estas enzimas
poseen polimorfismos genticos que podran tener alguna influencia en la
predisposicin para generar protenas citrulinadas en distintos individuos, las
cuales podran inducir la respuesta autoinmune causante de artritis reumatoide
a. REACTIVOS
CALIBRADORES Y CONTROLES: Los reactivos estn listos para ser

usados. Mezclar cuidadosamente antes de usar.
CONJUGADO ENZIMATICO: El conjugado est listo para ser usado.
Mezclar cuidadosamente antes de usar.
BUFFER PARA MUESTRA: El buffer est listo para su uso.
NOTA: Solo debe ser usado junto con la muestra.
59
BUFFER DE LAVADO: El Buffer est Concentrado 10X, tomar 5ml de

Buffer de Lavado y diluirlo en 45 ml de Agua Destilada. Este es estable
desde su preparacin por 4 semanas a condiciones de 2C a 8C.
SOLUCION CROMOGENO / SUSTRATO: La solucin est lista para
usarse. Cerrar la botella inmediatamente despus de su uso, esta solucin
es fotosensible.
SOLUCION DE PARADA: Lista para su uso.
PLACAS RECUBIERTAS CON ANTIGENO: Lista para su uso, almacenar
de 4C a 8C.
b. MATERIALES
Muestra de Sangre
Algodn
Etanol al 70%
Ligadura
Jeringas de 3 cc
Timer
Tubos Eppendorf de 1.5ml.
Papel Toalla.
4. METODOLOGIA
a. Recoleccin de la Muestra
Con la ayuda de una Jeringa descartable o Vacutainer, extraer una

muestra de sangre por Venopuncion del antebrazo, tomndose todas las
medidas de Bioseguridad en la obtencin de la muestra.
Recolectar 3ml de Sangre.
60
Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja) o con anticoagulante
(EDTA y/o Heparina) , centrifugar y separar el suero o plasma del paquete
globular.
5. DESARROLLO
a. PREPARACION DE LA MUESTRA DE SUERO O PLASMA
Tomar 10ul del suero o plasma a analizar y diluirlo en 1.0ml de

Buffer de muestra, obteniendo una dilucin 1:101
b. INCUBACION DE LA MUESTRA
Transferir 100ul de los CONTROLES (positivo y negativo) y la

MUESTRA PROBLEMA diluida previamente en los pocillos de la
placa, asignar un pocillo por control y muestra.
Dejar incubar a temperatura ambiente (18C a 25C) por 60minutos.
c. LAVADO DE LAS MUESTRAS
Con la ayuda de una pipeta de 1000ul, aadir a cada pocillo con la

1ra solucin (punto a) 300ul de Buffer de Lavado.
Esperar 30 segundos y descartar por inversin de la placa el
contenido (realizar este paso cuidadosamente para evitar
contaminacin en los pocillos), secar la placa con la ayuda de papel
absorbente.
Repetir los procedimientos anteriores por 3 veces.
61
d. INCUBACION DEL CONJUGADO
Tomar 100ul de la ENZIMA CONJUGADO (Peroxidasa IgG anti

humano) y depositarlo dentro de los pocillos de trabajo con la ayuda
de una micropipeta.
Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18C a 25C).
Concluidos los 30minutos realizar el lavado de los pocillos repitiendo
los pasos del punto b (Lavado de Muestras).
e. INCUBACION DEL SUSTRATO
Tomar 100ul de la solucin CROMOGENO SUSTRATO con la

ayuda de micropipeta y aadir dentro de los pocillos de trabajo
Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18C a 25C).
La incubacin se realizara protegiendo las muestras de la luz (lugar
oscuro).
f. SOLUCION STOP
Con la ayuda de una micropipeta, tomar 100ul de SOLUCION DE

PARADA y aadir a cada pocillo de trabajo.
Esta solucin ser aadida sobre la solucin CROMOGENO
SUSTRATO.
g. MEDICION DE LA MUESTRA POR ESPECTROFOTOMETRIA
La medicin fotomtrica de la intensidad de color de las muestras se

leern a 450nm en un espectrofotmetro.
h. CALCULO DE LOS RESULTADOS
62
Las absorbancias obtenidas de la lectura del equipo, sern

extrapoladas en una curva de calibracin previamente realizada
(Cuadro N 1).
Los resultados a reportarse son emitidos con las siguientes
unidades RU/ml.
Se considerara un RESULTADO POSITIVO cuando el resultado sea
>5 RU/ml.
Se considerara un RESULTADO NEGATIVO cuando el resultado
sea <5 RU/ml.
Cuadro N 1 Curva de Calibracin de Anti-CCP
6. RESULTADOS
En la siguiente tabla codificar las muestras que se evalan en la prctica, la

absorbancia obtenida y los resultados cuantitativos obtenidos al extrapolar
dicha absorbancias.
63
CODIGO DE LA ABSORBANCIA RESULTADO

MUESTRA OBTENIDA (Abs) a CUANTITATIVO RU/ml
450nm
7. CUESTIONARIO
1. Mencionar cual es la importancia del Dosaje de Anti-CCP.

2. Menciona y describe otras tcnicas empleadas en el dosaje de Anti-CCP
3. Describa y grafique brevemente las reacciones inmunolgicas que ocurren en
la reaccin para el dosaje de Anti-CCP.
4. Mencione las diferencias clnicas que existen entre la prueba de Anti-CCP y
Factor Reumatoideo.
64
PRACTICA N12
IDENTIFICACION DE VIRUS RESPIRATORIOS USANDO ANTICUERPOS MONOCLONALES

POR INMUFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
1. OBJETIVO
Conocer el fundamento de Inmuno Fluorescencia Indirecta .

Identificar los Virus Respiratorios por la tcnica de IFI
2. INTRODUCCION
El empleo de la reaccion de inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ha permitido ampliar

elestudio serologico en diferentes enfermedades infecciosas. Dicha tecnica, de ejecucion
relativamente simple y rapida, ofrece la doble ventaja de ser aplicable tanto en la pesquisa
de diferentes agentes infecciosos, lo que depende del microorganismo que se emplee
como antigeno, como en la demostracion de diferentes tipos de anticuerpos, de acuerdo
con la antigammaglobulina que se utilice como reactivo.
La IFI para Virus Resiratorios es una tcnica de tincin indirecta de anticuerpo fluorescente
para la identificacin de virus en cultivos de tejido infectado y en muestras preparadas de
de hisopados nasal y farngeo combinado. Consta de dos reactivos inmunolgicos, un
anticuerpo monoclonal antiviral de ratn sin conjugar que se aplica a clulas fijas y se une
al antgeno viral en cuestin, si est presente en el sustrato celular; luego se aade una
inmunoglobulina anti-ratn conjugada con fluorescena isotiocianato (FITC) y se observa
en microscopio de inmunofluorescencia a 570 nm. El uso de anticuerpos monoclonales
maximiza la especificidad. Una reaccin positiva es aquella en la cual se observa una
fluorescena brilante de color verde manzana y la clulas no infectadas se contratien con
azul de Evan.
65
Fig. 3 Tcnica de inmunofluorescencia indirecta para la deteccin

de anticuerpos.
3. PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD
Seguir los procedimientos de bioseguridad

Seguir los procedimientos de buenas prcticas de Laboratorio.
4. EUIPOS Y MATERIALES
Microscopio para fluorescencia

Estufa de Temperatura regulablea 37C
Balanza de precisin.
Timer
Secador o Ventilador.
Refrigerador
Placas para micro titulacin fondo en U
Couplin o recipiente para lavado de laminas
Tips de 10 hasta 100ul y de 0.5 a 10ul.
Pizetas
Papel toalla o secante
Laminas cubreobjetos de 24 x 48mm
Cmara hmeda.
Solucin de azul de Evans
Anticuerpos INFLUENZA A
Anticuerpos INFLUENZA B
Anticuerpos ADENOVIRUS
Anticuerpos VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL
Conjugado Anti lgG DE raton- FITC, titulado
Buffer fosfato salino pH7,4
Glicerina tamponada.
66
5. PROCEDIMIENTOS TECNICOS
Agitar el hisopo en el medio de transporte utilizando un vortex.

Antes de retirar el hisopo presionarlo contra las paredes del tubo para escurrir el
lquido.
Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos. Separar el sobrenadante y conservarlo en
un vial estril de 2ml a 4C para aislamiento viral en cultivo de clulas o almacenar
a 70C.
Agregar al sedimento de clulas 2.0 ml de PBS pH7.2, resuspender el sedimento
celular y luego agregar 2.0 ml mas de PBS.
Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
Descartar el sobrenadante, eliminar el moco y resuspender el sedimento de
clulas en PBS pH7.2
Homogenizar en un vortex y Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos.
Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con el PBS sobrante, partir
de la suspensin obtenida proceder a cubrir cuatro pocillos de la lmina
portaobjetos, una lmina por paciente.
Se debe comprobar por observacin al M/O/C que la concentracin de clulas sea
la adecuada sin que exista sobre posicin, dejar secar al medio ambiente.
Fijar con acetona fra (2-8"C) durante 10 minutos y dejar evaporar la acetona al
medio ambiente. La acetona debe ser fresca, de otra forma las clulas no fijaran y
se desprenderan durante el proceso.
COLORACION DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
Colocar sobre cada pocillo de la lmina una gota que cubra el pozo con la solucin
de trabajo del anticuerpo monoclonal especfico para el virus que se desea
detectar y el control negativo es el suero normal de ratn o adicionar PBS. Evitar la
contaminacin entre pozos continuos.
lncubar en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. La cmara debe estar
suficientemente hmeda para evitar que los monoclonales se sequen en la lmina.
67
Los tiempos y las temperaturas de incubacin diferentes de los indicados en las

instrucciones de la prueba pueden arrojar resultados errneos.
Lavar la lmina con PBS pH 7.6, primero agregando en forma de chorro y luego
sumergir las lminas de 5 - 10 minutos en un couplin conteniendo PBS.
Eliminar el exceso de lquido. No dejar que los pocillos que contienen la muestra
se sequen, deben estar hmedos durante el proceso (no debe haber lquido entre
los pocillos).
Colocar una gota del conjugado anti-ratn lgG - FITC. El conjugado fluorescente no
debe exponerse a la luz durante periodos prolongados.
lncubar a 37C por 30 minutos en cmara hmeda.
Lavar la lmina con PBS pH 7.2, primero agregando en forma de chorro y luego
sumergir las lminas de 5 - 10 minutos en un couplin conteniendo PBS.
Eliminar el exceso de lquido y dejar secar al medio ambiente, proteger las lminas
de la luz . Agregar a la lmina la solucin de montaje.
Colocar la laminilla cubreobjetos evitando se formen burbujas de aire.
Leer al microscopio de luz UV (Epifluorescencia) con objetivo de 40X y ocular de
10 X longitud de emisin de onda 520 nm. La observacin de las lminas deber
realizarse inmediatamente despus de su montaje o guardar a -20C.
LECTURA E INTERPRETACION
Inmunofluorescencia No Especifica en Pacientes:
Luminosidad difusa de color amarillo verdoso: la tincin no se identifica con una

morfologa especfica, las posibles causas: objetivos y lminas sucios.
Flourescencia amarillo verdosa apagada asociada a agrupamiento de clulas: la
causa es el excesivo nmero de clulas y el conjugado esta atrapado entre las
capas de clulas, usar lminas con pozos de 5 a 6 mm. y una lmina por paciente.
Fluorescencia verde manzana slo en el extremo de la muestra, la tincin puede
parecer especfica, pero se debe a que la lmina se ha secado durante la
68
incubacin con los monoclonales o el conjugado o en el periodo antes de agregar

el conjugado.
El Kit incluye las lminas control con clulas infectadas y no infectadas,

permitiendo controlar la reaccion de los anticuerpos monoclonales y del
conjugado. Se debe realizar esta prueba antes de iniciar el trabajo con un nuevo
kit. El examen de las lminas permite reconocer el patrn de coloracin especfica
para cada anticuerpo monoclonal.
El conjugado contiene Azul de Evans (Evans Blue), el cual, permite observar de
color rojo las clulas negativas. La coloracin positiva especfica es de un color
verde manzana intenso y brillante. Si se observa una o ms clulas con este patrn
de coloracin puede considerarse un resultado positivo.
Se deben visualizar clulas completas con inclusiones fluorescentes verde brillante
intenso, tambin se pueden observar con luz blanca las clulas y se les observara
de color azul opaco y las clulas que no presenta fluorescencia son de color rojo
(negativas)de esta manera nos aseguramos que no hay fluorescencia inespecfica.
6. OBSERVACION DE LOS RESULTADOS: Dibuje y comente lo observado.
--------------------------------------------- ----------------------------------------------
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--------------------------------------------- ---------------------------------------------
69
---------------------------------------------- ------------------------------------------
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70
PRACTICA TALLER N 12
ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU APLICACIN CLINICA
Cetuximab Inhibidor del Crecimiento del Cncer Colorrectal
I. INTRODUCCIN
Cetuximab es el primer anticuerpo monoclonal aprobado para uso clnico que acta bloqueando lo
que se conoce como receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR), una protena
expresada en la mayora de los cnceres colorrectales. Cuando est presente esta protena, se
produce un crecimiento mucho ms rpido del tumor y las perspectivas de supervivencia
disminuyen. Cetuximab bloquea el EGFR e inhibe el crecimiento anormal de las clulas cancerosas,
reduciendo adems el tamao de la metstasis.
II. OBJETIVOS
- Analizar la aplicacin de los anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cncer
III. MARCO TERICO
El receptor EGFR: estructura y funcinEl EGFR es un receptor transmembrana del factor de

crecimiento que ha sido objeto de una gran atencin en los ltimos aos, ya que en la actualidad
hay abundantes pruebas que lo relacionan con la progresin de diversos tumores malignos y que
demuestran que el bloqueo de los receptores podra ser una estrategia teraputica eficaz.
71
La identificacin del EGFR y su participacin en el cncer abri la puerta al desarrollo de agentes

biolgicos capaces de interrumpir la va de sealizacin. Una de las ventajas de estos agentes
radica en que la inhibicin especfica de un receptor determinado dar lugar a una eficacia
teraputica exenta de las toxicidades asociadas a muchos frmacos citotxicos empleados en la
actualidad. Los mecanismos conocidos de la sealizacin del EGFR sugieren que la combinacin de
algunos inhibidores especficos del EGFR con ciertos agentes citotxicos, o con radioterapia,
debera potenciar los efectos teraputicos de estas estrategias sin incrementar las reacciones
adversas, txicas y especficas de estos tratamientos.
Se han investigado diversas estrategias para la inhibicin del EGFR, que se dividen en dos
categoras principales:
Anticuerpos monoclonales orientados hacia el do-minio externo del receptor, como cetuximab.
Pequeas molculas inhibidoras de la tirosincinasa asociada al EGFR, como gefitinib.
72
73
Definicin
Cetuximab es un anticuerpo monoclonal de la subclase IgG1 que acta sobre el EGFR humano y
consta de 4 cadenas polipeptdicas, 2 cadenas pesadas idnticas de 449 aminocidos cada una y 2
cadenas ligeras idnticas de 214 aminocidos cada una.
Las cadenas de anticuerpos contienen el dominio de unin funcional entre el anticuerpo murino y
el EGFR humano.
Las 4 cadenas se mantienen unidas a travs de una combinacin de enlaces covalentes y no
covalentes.
Mecanismo de accin
Cetuximab es un anticuerpo monoclonal IgG1 que se une especfica-mente al EGFR y tiene una
mayor afinidad que los ligandos naturales. Asimismo, inhibe competitivamente la unin a los
ligandos endgenos.
Los efectos biolgicos del bloqueo del EGFR los media la activacin reducida de la tirosincinasa, e
impactan en todas las funciones ce-lulares implicadas en el crecimiento y la metstasis tumoral,
como la proliferacin celular, la supervivencia celular, la reparacin del ADN, la angiogenia
tumoral, la motilidad celular y la invasin celular.
Cetuximab promueve la internalizacin del EGFR, lo que causa una regulacin por disminucin de
los receptores de la superficie celular y una reduccin de la sealizacin de los receptores. El
frmaco ejerce una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
74
Se dispone de un gran volumen de datos preclnicos relativos a cetuximab en diversas lneas

celulares y modelos tumorales in vivo que muestran los efectos antitumorales del frmaco
administrado en mono-terapia y sus efectos sinrgicos con quimioterapia y radioterapia sobre el
crecimiento tumoral. Se ha demostrado que cetuximab inhibe el crecimiento de diversas lneas
celulares cancergenas humanas, incluidos colon, cabeza y cuello, vejiga, mama y rin. Se une in
vitro al EGFR con una gran afinidad en diversos tipos de tumores.
La actividad in vivo es considerablemente superior a los efectos in vitro, lo que indica unos
mecanismos antitumorales que no se limitan a la inhibicin de la proliferacin celular y la
estimulacin de la apoptosis.
La marcada actividad de cetuximab en diversos modelos tumorales, especialmente en asociacin

con quimioterapia citotxica o radioterapia, sugiri el potencial para el desarrollo clnico de
cetuximab para su uso en monoterapia o en asociacin con quimioterapia y radioterapia en
pacientes con tumores que expresan EGFR.
75
Eficacia clnica
La asociacin de cetuximab e irinotecn es eficaz en el tratamiento del cncer colorrectal

metastsico en pacientes cuya enfermedad ha progresado durante la administracin de un
tratamiento que contiene irinotecn o despus de ste.
La pauta con cetuximab e irinotecn demostr una gran eficacia, incluso en pacientes que se
haban expuesto a un tratamiento intensivo previo y que haban recibido ms de dos ciclos de
quimioterapia, incluidas pautas basadas en oxaliplatino.
Cetuximab ha mostrado resultados esperanzadores en asociacin con irinotecn ms 5-FU/AF en
bolus e infusin, o con oxaliplatino ms 5FU7AF en infusin en el tratamiento de primera lnea de
enfermedad metastsica.
Por lo general, cetuximab se tolera bien cuando se utiliza en asociacin con irinotecn, y no parece
agravar la toxicidad asociada a este ltimo principio activo cuando se utiliza en asociacin.
Las reacciones adversas ms comunes fueron erupcin cutnea acneiforme, astenia/malestar,
fiebre, nuseas, estreimiento, diarrea y dolor abdominal, reaccin a la infusin, cefalea, vmitos
y anorexia.
La incidencia de reacciones de hipersensibilidad a cetuximab es del 5% y, por lo general, estas

reacciones pueden tratarse.
La incidencia de anticuerpos humanos antiquimricos con la administracin de cetuximab es baja y
se considera sin relevancia clnica respecto a la farmacocintica, la eficacia o la seguridad de
cetuximab.
En resumen, la asociacin de cetuximab e irinotecn presenta un perfil de seguridad aceptable y

puede administrarse sin incrementar en los pacientes el riesgo de reacciones adversas solapadas.
IV. CUESTIONARIO
1. Describir la estructura del receptor Del factor de crecimiento epidrmal EGFR y las vas de
traduccin de seales activadas por este receptor.
2. Cules son los principales mecanismos que aumentan la activacin del receptor EGFR?.
3. Explicar los distintos mtodos de inhibicin del receptor EGFR
4. Describir la estructura molecular del Cetuximab
5. Definir qu es un anticuerpo quimrico y uno humanizado?
6. Explicar el mecanismo de accin del Cetuximab
7. Cules son las principales ventajas del tratamiento antitumoral con anticuerpos monoclonales
respecto a otros tratamientos?
8. Por qu mejora la eficacia clnica Cetuximab cuando se aplica con l irinotecn
76
77
ANEXOS
OTENCION DE SANGRE VENOSA
PRINCIPIOS GENERALES
Un adulto que pesa 60 kilos tiene

aproximadamente 4,5 litros de
sangre. Por lo tanto, no existe
peligro si se llenan dos o ms
tubos de ensayo de 10 mL para el
estudiode su sangre. Se debe
explicar esto alos pacientes que
muestren temor al extraer sangre
venosa.
La sangre venosa se extrae de una

vena del brazo por medio de una aguja y
una jeringa.
Es importante considerar toda muestra como sospechosa de VIH u otra enfermedad

que puede ser transmitida por la sangre.
Usar guantes durante la obtencin y

procesamiento de la muestra.
78
SANGRE COAGULADA
Cuando la sangre se coloca en un

tubo de vidrio se solidifica en 5 - 10
minutos formando un cogulo. Se
separa en dos componentes:
El suero, un lquido amarillo.

El cogulo, una masa slida de
color rojo.
SANGRE ANTICOAGULADA
Si se aade a la sangre un anticoagulante

especial tan pronto como se extraiga, se
evitar que se coagule y seguir siendo
lquida. La sangre tratada con un
anticoagulante se separa en dos componentes:
El plasma, un lquido amarillo.

Las clulas sanguneas, que se sedimentan y forman:
una capa delgada de leucocitos y un precipitado de eritrocitos.
MATERIALES
Etanol al 70% para desinfectar la piel.

Algodn.
Una ligadura hecha con un tubo de goma de 2 - 5 mm de calibre.
Agujas estriles con calibre de 20, 19, 18. En nios menores de cinco
aos se usan agujas de calibre 23 o 25.
Jeringas estriles con capacidad para 2,5, 10 o 20 mL de acuerdo con
el examen solicitado.
79
Verificar que la desembocadura de cada jeringa

se ajuste adecuadamente a la entrada de las agujas.
Tambin se pueden utilizar jeringas descartables con sus respectivas
agujas, provenientes de sus envases originales.
Frascos y tubos para recolectar muestras de sangre.
Rtulos para los frascos o tubos. Preparar y rotular el frasco o el tubo
adecuado, que usar para el examen correspondiente.
Un depsito de metal que contenga leja u otro desinfectante para colocar el
material utilizado.
MTODO DE OBTENCIN
Leer con cuidado la orden de examen del paciente y decidir la cantidad de

sangre que se necesitar.
POSICIN DEL PACIENTE
Si el paciente se encuentra en el
laboratorio, hacer que se siente.
Poner el brazo del paciente sobre la
mesa de trabajo apoyndolo en un
pequeo cojn bajo el codo, con la
palma de la mano hacia arriba.
Si el paciente se encuentra en cama,

extender el brazo del paciente en
una posicin descansada.
80
PUNTO PARA LA EXTRACCIN DE SANGRE
El sitio ms adecuado es la vena que

se encuentra en el pliegue anterior
del codo, en el punto donde es ms
gruesa y visible.
USO DE LA JERINGA
Colocar la aguja en la jeringa,

tocando slo la base de la aguja.
Asegurarse que la aguja y la jeringa
no estn obstruidas.
APLICAR LA LIGADURA
Aplicar la ligadura por encima del punto ubicado

para la extraccin de la sangre.
Con la mano derecha colocar,

firmemente, la ligadura alrededor del brazo del
paciente, y sujetar los extremos.
Con la mano izquierda tirar de un

extremo cruzndolo y a continuacin
introducir este extremo por debajo
de la parte principal de la ligadura.
81
Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias

veces, para favorecer la dilatacin de las venas.
Con el dedo ndice de la mano

izquierda palpar la vena en que se
introducir la aguja.
Desinfectar la piel con una pieza de

algodn embebido en etanol al 70%.
Tomar la jeringa con la mano derecha, colocando

la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja.
Colocar la aguja sobre la vena, con

el bisel hacia arriba.
Introducir la aguja en el centro de la
vena, sin dudar.
Nunca intentar punzar una vena por
un lado. Se sentir que la aguja
atraviesa la piel.
Introducir la aguja 1 - 1,5 cm a lo largo de la vena.
82
Con la mano izquierda tirar hacia

atrs el mbolo de la jeringa muy
lentamente. Deber entrar sangre
en la jeringa. Llenar la jeringa con la
cantidad de sangre que necesite.
Retirar la ligadura tirando del

extremo doblado.
Aplicar un pedazo de algodn seco

sobre la parte donde se encuentra
oculta la punta de la aguja. Sacar la
aguja con un movimiento rpido.
Pedir al paciente que presione

firmemente el algodn durante 3
minutos, con el brazo extendido.
No se recomienda que se flexione
el brazo a causa del riesgo que se
83
forme un hematoma.
Luego de extrada la sangre

venosa, retirar la aguja de la jeringa con
el mximo cuidado y depositar la
aguja en el recipiente de metal con
desinfectante.
Llenar los frascos o tubos rotulados con la muestra de sangre. Si estos recipientes
contienen anticoagulante, mover varias veces con suavidad y uniformidad el
recipiente. No agitar el contenido.
84

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Facultad de Medicina Humana UCSM Inmunologa Bsica

SUERO Y PLASMA SANGUNEO

El uso de la sangre como un recurso teraputico se remonta a los primeros albores de la

Hoy en da el uso clnico de la sangre y sus derivados ha cambiado de forma significativa ,

El plasma es el medio acuoso de la sangre, desde un punto de vista tcnico, el plasma

El suero viene a ser el lquido sobrenadante cuando la sangre coagulada es llevada a

Ambos, el suero y el plasma se deben conversar en condiciones de esterilidad.

- Aislar suero y plasma sanguneo.

- Equipo para la extraccin de sangre

1. Extraiga 10 ml de sangre de sangre de una vena del brazo

Para efectuar algunos ensayos serolgicos, se puede aadir un antisptico

Recuerde que la sangre debe ser extrada con anticoagulante.

Describa lo explicado por el profesor

Rotule correctamente los tubos correspondientes al suero y plasma sanguneo obtenido

1. Cual es la diferencia entre el suero y el plasma.

RECUENTO LEUCOCITARIO Y HEMOGRAMA

Valores elevados: El aumento del nmero de leucocitos circulantes se llama leucocitosis,

Valores reducidos: La disminucin del nmero total de leucocitos circulantes se

La concentracin de leucocitos es el nmero de ellos que se encuentran en un litro de

Hemograma, es el recuento diferencial o porcentual de los leucocitos, que indican el

ALGUNOS DATOS GENERALES

No todos los leucocitos (glbulos blancos) que circulan en la sangre son

La proporcin o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el

Los valores normales de los distintos leucocitos en su proporcin relativa

l. Examinar la extensin de sangre

2. Verificar que los glbulos blancos

3. Verificar que la extensin no sea

4. Si la lmina coloreada, est en buenas condiciones, colocar una gota de aceite

l. Iniciar el recuento en la ltima

2. Examinar una porcin rectangular de la extensin mediante un movimiento

3. Tomar nota del tipo de leucocito que se observe en cada campo.

4. Contar un total de 100 leucocitos.

PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LEUCOCITOS

1. Con la micropipeta de 1000 l ml traslade 950 l del lquido para dilucin de

1. Hacer un frotis sanguneo.

4. Inicie el recuento en la ltima porcin de la extensin.

7. Vigile que la extensin no sea demasiado gruesa, si observa que la extensin es

Es el aumento de la proporcin de neutrfilos (ms de 7 000) en sus formas

Es el aumento de la cifra total de los leucocitos con cifras superiores a 10 000 o 12

Es el aumento de la proporcin de neutrfilos en sus formas inmaduras

Es el aumento de la proporcin de eosinfilos (ms de 400). Ocurre en casos de

Es el aumento de la proporcin de linfocitos (ms de 3 000). Ocurre en casos de

Es el aumento de la proporcin de monocitos (ms de 800). Se puede observar en

Es la disminucin del nmero de neutrfilos. Puede ocurrir en enfermedades

VALORES NORMALES DE LEUCOCITOS POR GRUPO DE EDAD

En lactantes y nios menores de 10 aos.

En adultos, nios mayores de 10 aos y recin nacidos.

EXAMEN DE LOS LEUCOCITOS

a. Se debe diferenciar y tomar nota

Forma y tamao de los leucocitos en comparacin con los glbulos rojos

Del citoplasma de los diferentes leucocitos:

Las vacuolas y nuclolos constituyen reas ovales o redondas, que no se

Los neutrfilos polimorfonucleares (P) tienen un ncleo con varios lbulos y

1. Haga una clasificacin de leucocitos

II. Actividades: Con Ayuda de la frmula leucocitaria, halle el numero de leucocitos

Clculo del nmero de leucocitos en un mm3 de sangre

Usar la siguiente frmula:

Leucocitos / mm 3 = leucocitos contados x 10 x 20

OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS

Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los

Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran tambin en grandes

II. MATERIALES Y REACTIVOS

- Medio RPMI 1640

5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el