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UNIVERSIDAD CIENTIFFICA DEL SUR

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA


LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR

CURSO: BIOLOGIA CELULAR


PROFESOR: ROGER IZIGA GOICOCHEA
INFORME DE PRCTICAS
PRCTICA N6

TTULO: Obtencin y Anlisis de Fracciones Celulares

INTEGRANTES:
- vila Terrones, Renzo.
- Gutirrez Castaeda, Jeremi.
- Alvarado Rosales Patricia.
- Pedrosa Alonso , Sebastian.
HORARIO DE PRCTICAS
DA: MARTES
HORA: 7:10 9:00
FECHA DE REALIZACIN DE LA PRCTICA: 02/05/17
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 09/05/17

LIMA PER
OBTENCIN Y
ANLISIS DE
FRACCIONES
CELULARES

INTRODUCCION (marco terico y objetivos de la prctica)


MARCO TEORICO

Las diferentes metodologas utilizadas para el estudio de la composicin celular, entre ellas las tcnicas
bioqumicas, fisiolgicas, citolgicas. Permiten analizar en gran medida la anatoma y localizacin de las
estructuras y organelas celulares.
Generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas con las distintas estructuras u organelas.
Una de las tcnicas ms utilizadas para obtener dichas fracciones es el fraccionamiento celular , el cual es un
conjunto de procedimientos que tienen como principal objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un
determinante componente celular , ya sea esta una organela como el ncleo, mitocondrias ,lisosomas ,
peroxisomas , etc.
Todo procedimiento de fracciones celulares tienen 3 etapas:
HOMOGENIZADO:
Ruptura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) , de tal modo que se liberen sus
componentes , en particular sus organelas , sin que estos sufran daos y que se encuentren en condiciones
adecuadas para su purificacin .En el caso de ruptura existen muchas formas de hallar pero solo se usan dos el
mtodo qumico y el mtodo mecnico
FILTRADO:
Proceso que consiste en la separacin de componentes no deseados presentes en la suspensin celular
mediante un medio poroso , que retiene slidos y deja pasar lquidos .
CENTRIFUGADO (O PURIFICACION)
Una que tienen todos los componentes celulares libres , es necesario separlo en fracciones , es decir , realizar el
fraccionamiento y el mtodo mas utilizado . Cuando los diferentes componentes celulares se encuentran
suspedido en un liquido, tienden a sedimentar hacia el fondo por el efecto de la gravedad .

Objetivos

1. Identificar las fracciones celulares en el hgado de pollo


2. Deduce el rendimiento y pureza de cada fraccin
3. Uso de colorantes que identifiquen organelas especificas celulares
MATERIALES:
1 Cubeta con hielo (no se us)

1 mortero 100 l de colorante Hoechst 33258

100 l de Mytotracker

4 gasas 1 caja de lminas y laminillas

16 tubos ependorf de 1,5mL


Microscopio de campo claro y de
fluorescencia.
2 beaker de 100 ml
10 gr. de hgado de polio por todo el
laboratorio

1 beaker de 50 ml

100 ml de Verde de Janus


100 ml de buffer Tris 10 mM pH 7,5
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (MATERIALES Y METODOS USADOS)

PROCEDIMIENTO

1- Molemos el hgado en el
motero, aadir 20 ml de
la solucin Tris 10 mM
pH 7,5 y filtramos con la
gasa en el beaker.
2- Vertemos el filtrado en 2
tubos eppendorf y
agregue 500 IA de la
solucin de buffer Tris 10
mM pH 7,5. Rotulndose
con la palabra ncleo.

3- Centrifugue a 3000 rpm


durante 3 minutos. (El
pellet que ha quedado se
denomina fraccin
nuclear y re suspender Sobrenadante
en 200 p.1 de Tris 10 mM
pH 7,5)

Fraccin
nuclear

4- Coloque el sobrenadante
del proceso anterior a 2
ependorf nuevos y
mrquelos con la palabra
mitocondrias. Centrifugar
a 10000 rpm durante 8 Solo necesitaremos la f.
minutos. eliminar el mitocondrial. As que
sobrenadante y re agregamos tris.
suspender el pellet en
200 111 de buffer Tris 10
mM pH 7,5).

Observaciones a microspio de fraccin nuclear y mitondrial


Aadiremos a unas gotas de Azul de Al suspendido o fraccin mitocondrial aadiremos el
metileno a la fraccin nuclear en la colorante mytotracker dejndolo incubar por
lmina portaobjetos, cubrimos y vemos 10 min a 37C.
lo siguiente.

RESULTADOS : 400x
1. Identificacin de ncleos (fraccin celular obtenida) a partir del hgado de pollo

Despus de haber sometido la muestra en la centrifuga por 3 minutos a 3000 rpm (menor fuerza
centrfuga y tiempo que el de la mitocondria por tener mayor densidad y ser ms grande) obtuvimos
A 100x
una mezcla heterognea en el tubo eppendorf , donde se observaron dos fases, una en la parte de
arriba transparente y un sedimento en la parte inferior de color blanquecino debido a que son ms
En otra muestra de fraccin mitocondrial aadiremos
grandes y se sedimentan ms rpido en el fondo del eppendorf; que fue el que utilizamos para
verde de Janus
posteriormente colocar 10 l del re suspendido del tubo marcado como ncleo en una lmina
portaobjeto y con la ayuda de una gota de colorante azul de metileno y lo cubrimos con una lmina
cubreobjetos , diferenciamos los ncleos de las clulas en el microscopio electrnico de campo claro.
En la muestra tomada para la obtencin de estructuras nucleares, al someterlas al microscopio con el
azul de metileno pudimos observar claramente dicha estructura

A 100
En otra lamina adicionamos 10 l del colorante Hoechst 33258 y cubrimos con unax lmina
cubreobjetos, dejamos reposar
A 1000x por 2 min y lo observamos en el microscopio de fluorescencia.

Tubo eppendorf
Colorante: Azul de colorante Hoechst
Colorante: Azul de
metileno 33258 (fluorescencia)
(fraccion nuclear)
metileno.
(Fraccion nuclear) 1000x
Fraccion
1. Identificacin nuclear.
de mitocondrias (fraccin celular obtenida) a partir del hgado
100x de pollo 40x
Para la obtencin de la fraccin mitocondrial, se coloc el sobrenadante de la mezcla
anterior a 1000 rpm durante 8 minutos ( porque la fraccin celular que queremos
recuperar es ms ligera y ms pequea , se precipitan ms rpido, se necesita mayor
fuerza centrfuga y tiempo) , obtuvimos una mezcla un poco ms homognea, con un
sedimento ligeramente claro en el tubo Eppendorf de 0,5 l , adicione 5 l del
colorante verde de Janus en un frotis, lo someti al microscopio de campo claro y
observe claramente las mitocondrias, con las caractersticas que las diferencian como
lo son su estructura granular diferencial.
En un ependorf de 0,5 ml adicione 5 l del resuspendido y 5 l del colorante
mytotracker dejndolo incubar por 10 min a 37C y se observo lo siguiente :

Tubo eppendorf
( tubo mitocondrial)

A 100 x

Colorante : Verde de
Janus

Fraccion
mitocondrial

Colorante: mytotracker.
(microscopio de
fluorescencia)

ANLISIS DE RESULTADOS

Por qu es necesario juntar ciertos colorantes con ciertas estructuras ,ejemplo,


queremos examinar los ncleos del hgado de pollo , pero no podemos poner
cualquier colorante , tiene que ser uno con carcter bsico , ya que, los ncleos portan
ADN y lo que hace que sea acido es el grupo fosfato y al echar un colorante bsico
como el azul de metileno lo neutraliza haciendo que la muestra sea ms visible
Es necesario hacer todo el proceso de fraccionamiento celular; ya que, en este caso el
hgado tiene muchas estructuras que no queremos visualizar y necesitamos centrarnos
en lo que realmente queremos por eso tenemos que homogenizar, filtrar y purificar
nuestra muestra para separar todo lo que no nos interesa.
En un microscopio de fluorescencia se pueden apreciar las estructuras mejor, ya que,
este se centra en las estructuras internas especficas.

En la muestra tomada de fraccin nuclear, al observarlas en el microscopio de campo


claro con el azul de metileno pudimos observar claramente dicha estructura, las cuales
se caracterizan por ser estructuras ms oscuras al centro de las clulas.

Por otro lado en el caso de la obtencin de fraccin mitocondrial y haberlas sometido


al microscopio con el colorante verde de Janus, observamos la estructura granulosa y
rugosa de la mitocondria.

Otro aspecto que llegamos a diferenciar fue el grado de sedimentacin que ocurri
posterior a colocar los tubos Eppendorf en la centrfuga, pues el tubo rotulado con la
letra M (mitocondria) fue sometido a una velocidad rpm mayor y tambien a un mayor
nmero de minutos, a diferencia del tubo rotulado con la letra N (ncleo), que se
podra decir que ya que posee una mayor densidad y con la ayuda de la gravedad, el
sedimento fue enviado al fondo y la diferencia en la mezcla heterognea que se
produjo era ms evidente. Debido a que El nucleo es mas grande que la mitocondria
que es mas ligero y necesita menos tiempo de cetrifugacion.

(DIFERENCIA QUE VIMOS ENTRE LA FRACCION MITOCONDRIAL Y NUCLEAR)

CONCLUSIONES

1. se observ la tcnica de fraccionamiento celular y se hiso uso de conocimientos en los cuales se reconoca que el mayor
peso lo llevaban los ncleos el por ello de su evidente aparicin despus de la primera centrifugada a menor velocidad y
tiempo en comparacin a la que buscaba la de las mitocondrias.

2. La visualizacin de las mitocondrias se hiso ms dificultosa con el microscopio ptico ,por lo cual se tuvo que hacer uso
de imgenes de un microscopio electrnico
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Villee, Cluade. Biologa. Fraccionamiento celular; 1998.


2. Montero Hilda. Mtodos. Centrifugacin. Disponible en
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf
3. THERMO. Conceptos Bsicos de centrifugacin. Disponible en http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle/910
4. PAPIME. Anlisis de alimentos, fundamentos y tcnicas. Disponible en
http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret.
5. Pruebas cualitativas .Identificacin de compuestos bioqumicos.Disponible en
http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/2_EstructuradeCompuestosBioquimicos/9-
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6. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregma. cell fractionation. Link available at:
http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm
7. Marino Villavicencio Nez. Bioqumica. Tomo primero. Captulo V. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
8. Homogeneizacin de tejidos y clulas. Tcnicas instrumentales en bioqumica y biologa. Francisca Barcel Mairata.
Servicio de Publicaciones e Intercambio Cientfico. Universidad de las Islas Baleares, 2003. ISBN: 8476328087.
Pg.138
http://www.gac.edu/cgi-bin/user/~cellab/phpl?index-1.html
9. Karp, G.; (1998) Biologa Celular y Molecular. Ed. Mc Graw Hill Interamericana. Mxico.