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ELECTROFORESIS

En biologa molecular, una gran cantidad de tcnicas que se realizan comnmente


requieren el uso de la electroforesis, por lo que supone una parte importante del
procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, purificacin, preparacin) de los
cidos nucleicos y las protenas. La mayora de las biomolculas poseen una carga
elctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran; como
consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo elctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molcula. A diferencia de las protenas, que pueden
tener una carga positiva o negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga negativa,
debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos
migrarn hacia el polo positivo; es decir, el nodo. En el caso de las protenas se realiza
pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere
carga negativa; con ello se homogenizan las protenas de la muestra y todas migrarn
hacia el polo positivo, y slo se separarn por tamao.

El principio de la electroforesis consiste en la migracin proporcional de las molculas a


travs de un gel u otro tipo de matriz porosa, segn su peso molecular o tamao;
movimiento generado por el campo elctrico.

Elementos necesarios para una electroforesis


Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de elementos que se describen a
continuacin, que se enlistan en la figura 12-1.

Cmara de electroforesis
La cmara de electroforesis es un
dispositivo que permite la generacin de
un campo elctrico alrededor de un gel
donde se depositan las muestras. Este
campo se genera dentro de una solucin
amortiguadora en la que se encuentra
sumergido el gel que contiene las
muestras; el alto contenido de electrolitos
permite la transmisin de la corriente
elctrica, manteniendo el pH estable al
paso de la corriente. La cmara cuenta con
dos polos que se conectan a una fuente de
energa. En las cmaras
de electroforesis vertical el polo positivo
se encuentra en la parte inferior de la
cmara (figura 12-2A) y en las
horizontales, en uno de los extremos
(figura 12-2B). En ambos tipos de cmaras
el polo positivo se distingue con color rojo
y el negativo con negro.
Definicin
La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del
pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven
sometidas a un campo elctrico.

Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en


disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica
fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines preparativos.

Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con
la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el que
se desplaza.

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada


molcula, siendo stas esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las
molculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de friccin que las
pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

(Z = nmero entero; e = carga del electrn)

En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada


molcula definir su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van
separando progresivamente unas de otras.

Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que son
atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de stos
en el campo. Todo ello hace que el tratamiento terico cuantitativo de la electroforesis
sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco til para obtener informacin precisa sobre
la estructura de las molculas. Sin embargo, es enormemente til como tcnica analtica
y preparativa.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la


disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera
con el disolvente.
2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran
a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que da soporte a ste. En
este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es
separar los componentes de la muestra.
3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las pp.250-
2 de Freifelder, 1999).

Medios de soporte para realizar la electroforesis


La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar
perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos
soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de
ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la magnitud
de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles, medios
semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz
o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que
queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin
es notable y los factores de forma y tamao adquieren una alta relevancia en la
separacin.

Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja
tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.

Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar).


Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta
porosidad.

Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de


acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

acrilamida (forma polmeros lineales)


N,N-
metileno- (introduce uniones cruzadas entre
bis(acrilamida cadenas de poliacrilamida)
):

poliacrilamida
:
(vista parcial)

Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinnimo:


laurilsulfato sdico) es un detergente aninico que se une a las protenas,
desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS.
Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente proporcional
a su longitud en aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS
que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

H-(CH2)12-SO4

Modos de disposicin del soporte


Horizontal
En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas; en soportes similares
(especialmente, acetato de celulosa),
para protenas.

En gel de almidn o de agarosa, para


protenas y especialmente para
cidos nucleicos. Casi siempre el
tampn cubre el gel (para evitar que
se seque debido al calentamiento
sufrido al pasar la corriente),
denominndose por ello
electroforesis submarina.

El soporte se impregna por capilaridad de disolucin tampn, que disuelve la muestra


y mantiene el contacto elctrico.

Se aplica la muestra depositndola (con pipeta o un aplicador especfico) como una


gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el
gel.

Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se
desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares.
Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimentos del nodo y ctodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el
gel.
En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo
tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente
diferente).
ETAPAS DE LA TECNICA DE ELECTROFORESIS