RECUENTO DE MICROORGANISMOS

VIABLES. TECNICA DEL RECUENTO

EN PLACA
Objetivo:

Realizar el recuento de microorganismos viables a partir de una muestra problema.

Fundamento Terico:

El mtodo de recuento de grmenes en placa permite determinar indirectamente el nmero de

microorganismos presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en
placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas
microbianas viables en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como
las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el
trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC). Adems, a los efectos de que
todas las clulas que estn en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y
que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las condiciones ptimas de
recuento se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Esta regla general se
usa siempre que no haya una especificacin diferente. Para alimentos se utilizan el rango de
colonias ptimas entre 25 a 250 UFC por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir el
recuento para obtener placas con un nmero de colonias ptimas.

Materiales:

Leche cruda y leche pasteurizada

10 pipetas estriles de 1 ml.
10 tubos de ensayo con 9 ml de agua estril o caldo nutritivo.
2 matraces con Agar Plate Count fundido.
8 placas petri estriles y vacas.

Procedimiento:

1. Para ensayar la leche pasteurizada empezamos por agitar bien la muestra para
desagregar las bacterias.
2. Luego transferimos con la pipeta exactamente 1 ml de leche de la muestra a un tubo
con 9ml de agua estril o caldo nutritivo y agitar bien la muestra.
3. Ahora transferimos exactamente 1 ml de esta dilucin a un segundo tubo con 9 ml de
agua estril o caldo nutritivo y mezclamos bien.
 4. Repetimos la operacin usando un tercer tubo con 9 ml de agua estril o caldo nutritivo
y lo mismo para los tubos 4 y 5 (desechamos el mililitro extrado del tubo 5).
5. Para ensayar la leche cruda seguimos exactamente el mismo procedimiento.
6. De antemano calentamos a temperatura constante en la cocina elctrica, los matraces
con el Agar Plate Count a una temperatura promedio a 45 C (temperatura de plaqueo).
7. Tomamos de los tubos con la dilucin 1 ml y los colocamos dentro de la placa petri
estril, y luego vertemos una cierta cantidad del Agar. Agitamos rotando suavemente
con ayuda de la mesa de trabajo la placa petri previamente rotulada.
8. Dejamos solidificar e invertimos luego las placas petri e incubamos a 37 C durante 48
horas.
9. Al final del periodo de incubacin, contamos las colonias en cada caja con un contador
de colonias. Descartamos las placas que tengan menos de 30 o ms de 300 colonias.
10. Anotamos los resultados de cada dilucin y calculamos el nmero promedio de clulas
por mililitro de leche en la muestra original.
11. Comparamos los resultados obtenidos con leche pasteurizada.

Resultados:

1. Se pudo observar que al mezclar la leche cruda en la solucin del primer tubo, se form
un color blanco leche (decolorando en diluciones). Ocurre de la misma forma con la
leche pasteurizada, solamente que en esta se mostr ms concentrada y por tanto no
decolor tanto el color de la solucin al ir diluyendo en los otros tubos. La
concentracin es de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 ,10-5.
2. es necesario calentar el agar para realizar el plaqueo a una temperatura de 45C o a la
temperatura que soporta el calor en la palma de la mano. Se tom de los tubos de
ensayo solo desde los tubos que posean la concentracin de 10 -2, hasta 10-5, ya que el
10-1 posee mucha carga microbiana y por tanto no nos dara una buena lectura de
colonias, teniendo solo como resultado el plaqueo de 4 tubos de cada muestra.

Leche Pasteurizada Leche Cruda

3. Luego del plaqueado y de 48 horas de incubacin a una temperatura de 37 C,

observamos que hubo un crecimiento microbiano, en las placas de la leche cruda, pero
no se observ tal crecimiento en las placas con la leche pasteurizada, mostrando as la
calidad de la leche que es procesada.
Concentracin 10-3 y 10-4: crecimiento de colonias con facilidad de contar a
comparacin con la de 10-2.
Concentracin 10-5: no hubo formacin de colonias.

Se emple un marcador para poder contabilizar las colonias ms visibles, ya que el

contador de colonias se encontraba con fallas tcnicas, por tanto solo se pudo
contabilizar las colonias ms grandes y visibles. Del tubo con 10 -4 se obtuvieron 53
colonias contadas y del tubo de 10-3 se obtuvieron 132 colonias contadas.
 Leche Cruda Leche Pasteurizada

4. Con los datos obtenidos se puede determinar el nmero de colonias obtenidas en la

leche cruda sacado un promedio entre la cantidad de colonias en las placas con 10 -4 y
10-3, y multiplicndolo por el recproco factor de dilucin que viene a ser la
concentracin de 10-4 (1:10000) en 104, determinado as el nmero original de bacterias.

Colonias formadas
10-4: 53 colonias
10-3: 132 colonias

En promedio tenemos aproximadamente 93 colonias, que al multiplicarse por 10 4

tenemos en total 93x104 UFC/ml, en la leche fresca o cruda.

Conclusiones:

La diferencia del crecimiento de microorganismos en la leche cruda y pasteurizada nos

indica que la leche cruda es ms propensa a infecciones que perjudican la salud del
consumidor. A diferencia de la leche pasteurizada.
El nmero de colonias se expresa en UFC/ml, lo cual nos dice la cantidad formada de
colinas en 1 ml de muestra.
Cuestionario:

1. Qu tcnica utilizaste para evaluar el crecimiento microbiano?

La tcnica empleada para evaluar el crecimiento microbiano es la de Siembra
Incorporada.
2. En qu consisti la tcnica que emplaste?
Consiste en depositar 1 ml de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado.
Se agrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, previamente fundido y
termostatizado a 45 C (en bao o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la
superficie de la mesa con movimiento circular, horario, antihorario, hacia delante y
hacia atrs.
3. En qu diluciones se desarrollaron un nmero de colonias entre el rango
representativo (entre 30 y 300 colonias)?
Leche cruda: en los tubos de 10-4 y 10-3.
Leche pasteurizada: en ninguna de ellas hubo crecimiento de colonias
4. Registra el nmero de colonias contadas para:
Leche cruda: 93 colonias, en promedio (tubo 10-4: 53 colonias, tubo 10-3: 132 colonias)
Leche pasteurizada: No hubo formacin de colonias.
5. Registra el numero de bacterias que contena 1 ml de la muestra original para:
Leche cruda: 93x104 UFC/ml.
Leche pasteurizada: No hubo formacin de colonias, por tanto no pudo calcularse el
nmero de bacterias.
6. Qu es la pasteurizacin?
Este procedimiento, cuyo nombre proviene justamente de su creador, Louis Pasteur, se
basa en someter a los lquidos a altas temperaturas durante un periodo de tiempo
determinado. Puede sonar simple, pero se trata de un clculo complejo, ya que si no se
hace de forma correcta no slo quedan agentes infecciosos, sino los alimentos podran
perder parte de sus propiedades.
Existen tres mtodos de pasteurizacin que se aplican actualmente y se diferencian
tanto por la temperatura utilizada, como tambin por el tiempo y forma de proceso
industrial en que se usa.
VAT: Consiste en calentar los lquidos hasta una temperatura de
aproximadamente 63 C y luego dejarla enfriar durante 30 minutos dentro del
mismo recipiente. Al terminar, se les envasa de inmediato para prevenir
contaminacin.
HTST: Los lquidos se calientan rpidamente a entre 71 C y 89 C,
dependiendo de su tipo, por slo 15 segundos. Es el ms utilizado por la
industria, ya que es rpido y se puede trabajar con grandes volmenes.
UHT: Tambin conocido como la ultra pasteurizacin, consiste en someter a los
lquidos a una temperatura de 137 C por slo 2 segundos, para luego enfriarla
rpidamente.
La UHT tiene una variante conocida como asptica, donde las temperaturas pueden
llegar a los 150 C por 4 segundos, para luego esperar que se enfre a temperatura
 ambiente.
El mtodo que se utiliza, depende del tipo de lquido con que se trabaja, aunque el VAT
ya casi no se usa.

Bibliografa:
http://www.unavarra.es/genmic/recuento%20microorganismos.htm