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Anales de Bromatologa, XLII-2 (1990)

CONTRIBUCION A LA DETERMINACION
POR ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA DEL CONTENIDO
DE CAFEINA EN DISTINTOS TIPOS DE CAFES: CAFES VERDES
Y DE TUESTE NATURAL

CONTRIBUTION TO SPECTROPHOTOMETRY UV DETERMINATION


OF CAFFEINE IN DIFFERENTS TYPES OF COFFEES: l. GREENS COFFEES
AND NATURAL ROASTED COFFEES

Por A. CEPEDA
Departamento de Qttmica Analtica, Nutricin y Bromatologa. Facultad de Veterinaria.
Universidad de Santiago de Compostela. E-27002 Lugo.

y P. PASEIRO, J. SIMAL, J. L. RODRGUEZ


Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa. Facultad de Farmacia.
Universidad de Santiago de Compostela. E-15706 Santiago de Compostela.

RESUMEN

Se ha desarrollado un mtodo de valoracin de la cafena contenida en cafs verdes y de


tueste natural por espectrofotometra ultravioleta (UV). El mtodo supone la clarificacin de
las muestras con xido de magnesio ligero y posterior extraccin y purificacin con minicolum-
nas Sep Pak C18. El mtodo propuesto es sencillo, rpido y preciso, presentando un Cv % in-
ferior a> 0,5 y un % medio de recuperacin para la cafena del 100%. As mismo se ha abordado
el problema de la resolucin de interferencias de fondo estudindose su correccin mediante la
aplicacin de dos mtodos: el mtodo de Morton y Stubb y el mtodo de la segunda derivada.
Los resultados son concordantes con los obtenidos por el mtodo Micro Bailey-Andrew (AOAC).

PALABRAS CLAVE: Cafena, caf verde, caf tueste natural, Espectrofotometra Ultravioleta,
Sep Pak Cl8, Mtodo de Morton y Stubb, Espectroscopia de Segunda
Derivada.

SUMMARY

A new ultraviolet (UV) spectrophotometry method for the determination of caffeine contents
in green grains and natural roasted coffee has been developped. Samples were clarified with
light magnesium oxide. Extraction and purification were made using Sep Pak C18 cartridges.
This method is simple, and rapid (in relation to AOAC Micro Bailey-Andrew method} and it is
also reliable. It shows a less than 0.5 Cv %. Recovering average was 100%. It has also been
studied the problem of background interferences resolution by the Morton and Stubb method

(*) Autor para la correspondencia.

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and the second derivative method. The results agreed with those obtained by using Micro
Bailey.Andrew method (AOAC).

KEY WORDS: Caffeine, green coffee grains, natural toasted coffee grains, UV Spectropho-
tometry, Sep Pak Cl8, Morton and Stubb method, second derivative spec
troscopy.

INTRODUCCION

Para el estudio del contenido de cafena en las diferentes variedades de granos de


cafs, se han desarrollado numerosos mtodos analticos, principalmente la espectrofo-
tometra UV con o sin aplicacin de las diferentes derivadas (1, 2, 3) y los cromato-
grficos, tanto GC con detector FID o NDP (4, 5) como HPLC (6, 7, 8, 9, 10).
Sin embargo, ms que la tcnica analtica utilizada en la determinacin de la ca-
fena en el grano de caf, interesa abordar el problema de la extraccin total de la misma
en dicha matriz y posteriormente aplicar un mtodo analtico que permita ahorrar
tiempo, as como una economa en la realizacin del mismo, siempre que se pretenda
utilizar otro mtodo alternativo al propuesto por la AOAC (11), por ser considerado
largo y engorroso. En cualquier caso, la liberacin de la cafena de su unin con el
cido dorognico, conlleva la utilizacin de OMg sin especificar la AOAC si es ligero
o pesado, aunque este ltimo s se recoge en el mtodo de Bailey-Andrew (12), sin
embargo, su utilizacin en mtodos que empleen la extraccin con disolventes org-
nicos ha dado lugar en todos los casos a la formacin de emulsiones difciles de rom-
per, dificultad que ha sido puesta de manifiestO por algunos participantes en diversos
estudios colaborativos de la AOAC, pero sin concretar sus causas (13, 14). Este pro-
blema ha sido resuelto por nosotros mediante la utilizacin de OMg ligero, que evita
la formacin de emulsiones duraderas, acortando enormemente el proceso de extrac-
cin (2).
En la valoracin de la cafena, creemos de inters el uso de las tcnicas espectro-
fotomtricas por su sencillez y economa, tanto de reactivos como de tiempo de an-
lisis. En este sentido, en base a estas tcnicas, se han descrito numerosos procedimien-
tos, unos basados en la extraccin con cloroformo, purificacin del extracto y lectura
de la absorbancia a 276 nm; y otros merced a la absorbancia, de las soluciones acuosas
purificdas, a 272-273 nm (1).
Tambin hay aportaciones (15) que determinan la cafena en lquidos acuosos su-
primiendo la extraccin y purificacin con solventes orgnicos. Este procedimiento ha
sido practicado por otros autores (16), encontrando que la puficacin sugerida por
los primeros no permite la eliminacin completa de la trigonelina y otras sustancias
que interfieren en la lectura de la cafena en el UV. Para nosotros, el principal incon-
veniente es la no eliminacin y posterior correccin de la absorcin del fondo, sugi-
riendo para ello una clarificacin mediante dos adiciones de reactivo Carrez para la
eliminacin completa de la trigonelina con una mnima prdida de cafena (2).
Como consecuencia, en este trabajo se propone un mtodo que mejora el propuesto
por nosotros anteriormente (2), basado en las indicaciones iniciales del mtodo Micro
Bailey-Andrew con la introduccin del OMg ligero y digestin inicial en caliente con
el fin de eliminar el cido clorognico y otras sustancias. Posteriormente, con el objeto
de evita! la extraccin clorofrmica y la adiccin del reactivo Carrez, se propone una
purificacin del extracto acuoso mediante el empleo de cartuchos Sep Pak (R) [tam-
bin utilizados por otros autores para la extraccin y purificacin de cafena en dife-
rentes tipos de alimentos (8)] y posterior lectura al UV a 272 nm.

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En otro orden de cosas, el estudio de las interferencias se ha realizado por dos di-
ferentes mtodos para su correccin:

l. Por el mtodo clsico de Morton y Stubb (17).

2. Por el mtodo de espectroscopa de derivadas de ms reciente aplicacin en la


resolucin de bandas solapadas, mezclas y correccin de la "absorcin de fondo"
(18, 19, 20, 21),

Para la comparacin de los resultados obtenidos con los procedimientos de correc-


cin de fondos y ante la imposibilidad de preparar de forma segura en el laboratorio
blancos de caf, hemos utilizado como mtodo de referencia el Micro Bailey-Andrew
de la AOAC (11).

PARTE EXPERIMENTAL

Reactivos

Todos los reactivos utilizados son de grado analtico. Etanol, Metano!, Acido clor-
hdrico 1N, Sulfrico, Hidrxido potsico.

Solucin patrn de cafena. Contiene exactamente 1 g/1 de cafena (Merck, art.


2584) en agua destilada. La solucin de referencia se ha preparado por dilucin
al dcimo con agua destilada.
Oxido de Magnesio "ligero" (OMg) (Merck, art. 5862).
- Minicolumnas Sep Pak C18 (Waters, art. 51910). Se han acondicionado segn
las instrucciones del fabricante.

Aparatos

Espectrofotmetro de doble haz (Hitachi 100-60), equipado con una unidad de ba-
rrido automtica y una unidad derivativa de diferenciacin analgica (Hitachi, modelo
200-0507). Los espectros han sido obtenidos a una velocidad de barrido de 240 nm/min
y en modo 6 la unidad derivativa. Cubetas de cuarzo de un cm de espesor.

Preparacin de la muestra

En un matraz Erlenmeyer de 500 mi, tarado, se pesan exactamente unos dos gramos
de caf molido, cinco g de OMg y se aaden 200 ml de agua destilada. Se calienta y
se mantiene a ebullicin durante cuarenta y cinco minutos, agitando ocasionalmente,
e incorporando agua cuando sea necesario para prevenir la formacin de espuma. Pos-
teriormente, se enfra y se ajusta el peso final de forma que el agua aadida sea de
100 g. Esta solucin se filtra a travs de papel (en nuestro caso, papel Whatman n-
mero 542). El filtrado se acidifica hasta pH 4 con Acido clorhdrico 1N. Cinco ml de
esta solucin se pasan a travs de una minicolumna Sep Pak C18 y a continuacin otros
cinco ml de agua destilada acidulada a pH 4. La minicolumna se eluye con cinco ml
de etanol y el eluato se recoge en un matraz aforado de 100 ml aadiendo agua hasta
volumen. Esta solucin es utilizada para realizar las medidas en el espectrofotmetro.

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Preparacin de la Recta de Calibrado

Se pipetean 5, 10, 15, 20 y 25 ml de la solucin de cafena de referencia en un


matraz aforado de 100 ml, se aaden cinco ml de etanol y se completa a 100 ml con
agua destilada (corresponden a 0.5, 1, 1.5, 2 y 2.5 mg de cafena en 100 ml de so-
lucin).
Se prepara un blanco con cinco ml de etanol en 100 ml de agua destilada.

Determinacin y clculo

Mtodo de Morton y Stubb.- Se mide la Absorbancia de las soluciones de medida


y de los patrones frente al blanco a 285 nm, 272,5 nm y 258 nm, calculndose la
Absorbancia corregida a 272,5 mediante la ecuacin

Az12,s (corregida) = 2,357. A212,s- 1,091. A2as = 1,272. A2sa

Esta Absorbancia corregida se transforma en mg de cafena mediante la ecuacin,


de la recta de mnimos cuadrados obtenida con los patrones,

A212,5 = - o,oo3 + 0,501 e, r = 1,000

El % de cafena en caf se ha estimado de la siguiente forma:

2
% Cafena e--, donde
M

C = Concentracin de cafena en las soluciones de medida expresada en mg/100 ml.


M = Peso de la muestra.

Mtodo de la Segunda Derivada.- Se mide grficamente sobre el papel de registro


la distancia en mm entre el pico a 292,5 nm y el pico a 272,5 nm (D 2 292,5-272,5).
Se convierte el valor encontrado en mg de cafena,

r = 0,9998
donde

C = Concentracin de cafena en las soluciones de medida expresada en mg/100 ml.

2
% Cafena C-
M

RESULTADOS Y DISCUSION

La incorporacin de las minicolumnas Sep Pak C18 al proceso de extraccwn y


purificacin de la cafena en el grano de caf supone eliminar la extraccin con cloro-
formo, por otro lado larga y tediosa, lo cual supone un enorme ahorro de tiempo y
reactivos.
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---------------------------------------- - - .
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Asimismo, hemos comprobado que la eliminacin de la mayor parte de las inter-


ferencias, y en concreto de la trigonelina, en medio cido a pH = 4, es efectiva. Sin
embargo, la eliminacin completa del fondo interferente no es posible, ponindose de
manifiesto en el espectro directo de las soluciones clarificadas de medida.

0,6

A 8 e
0,5

~
o
-eo 0,4
111
.<:>
o

..
"O

111
0,3
"'
"O

"
"O
;::
:;)

0,2
'
'
''
' '
0,1 '' '

220 no 340 220 280 340 220 2?,0 340

Lonqitud de onda (nm)

Fig. l.-Espectros de absorcin de las soluciones de medida: (A) patrn de cafena (1 mg/mL);
(B) caf verde, y (C) caf de tueste natural (lnea continua) y sus respectivos BlancOS>> que
corresponden a la absorcin de fondo (lnea discontinua).

Al objeto de poder observar la forma del espectro directo de la absorcin de fondo


interferente e intentar corregirla, se agotaron en cafena las soluciones problema con
cloroformo en medio sulfrico segn la manera de proceder del mtodo de Micro Bailey-
Andrew. El cloroformo se purific, mediante reestraccin alcalina, tres veces. Estos ex-
tractos alcalinos se incorporaron a la solucin acuosa agotada y se llevaron con hidrxi-
do potsico a su pH inicial. De esta solucin se tomaron cinco ml y se procedi como
lo indicado en la "preparacin de la muestra". Los espectros obtenidos se reproducen
en la figura l. A pesar de la incertidumbre que se introduce por la manipulacin de
la muestra en la obtencin de estos blancos sin cafena, consideramos que es una aproxi-
macin necesaria para conocer la forma del espectro directo de la "absorcin de fondo".

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Su aspecto nos sugiri intentar la correccin mediante los dos procedimientos antes
indicados:

l. En el mtodo de Morton y Stubb la contribucin de la "absorcin de fondo" a


272,5 nm, mximo de la absorcin de la cafena, se corrige aplicando un pro-
cedimiento simplificado debido a stos autores, habiendo escogido en nuestro
caso 285,5 y 258,5 nm, las longitudes de onda a uno y otro lado del mximo,
de tal forma que sus absorbancias son iguales en la sustancia pura y la contri-

A 8 e

'
'
'

r Ln
"'-
en
N

"'
o

-,.,,...,- ''
,.\
:
\ ', ,,
"
N Q A

1 -----4-t---.-t--~J

220 280 340 220 280 340 220 280 340

Lor9!ud de onda (nm J

Fig. 2.-Espectro de segunda derivada de las soluciones de medida: (A) patrn de cafena (1 mg/
mL); (B) caf verde, y (C) caf de tueste natural (lnea continua) y sus respectivos Blancos
que corresponden a la absorci6n de fondo continua (lnea discontinua).

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bucin de fondo, aproximadamente lineal en este intervalo de longitudes de


onda. Al objeto de obtener valores seguros para estas longitudes de onda, as
como para el cociente A 272, 5 / A 28 5,2 , se realizaron medidas en 10 soluciones
patrn de cafena entre 0,5 y 2,5 mg/100 ml, encontrndose para este cociente
el valor 1,737 + 0,010 (X S).

2. En el mtodo de la Segunda Derivada el espectro correspondiente a la "absorcin


de fondo" toma valores prximos a O en la regin comprendida entre 300 y
225 nm, lo cual permite utilizar la medida < pico (292,5 nm) a pico (272,2
nm) > (D 2 202 , 5 _ 27 .2>2) para cuantificar la cafena en las soluciones problema
(fig. 2).

Tabla 1
Estudio de la recuperacin de la cafena sobre soluciones de cafs verdes
y de tueste natural

Mtodo de Morton y Stubb Mtodo de 2." Derivada

Muestra Cantidad Cantidad Recu- Cantidad Recu-


aadida encontrada peracin encontrada peracin
(a) (a) (%) (a) (%)

CAFS VERDES

1 0,500 0,511 102,2 0,508 101,6


2 0,750 0,758 101,1 0,756 100,8

x +S 101,7 + 0,78 101,2 0,57

CAFS DE TUESTE NATURAL

3 0,500 0,505 101,0 0,506 101,2


4 0,750 0,753 100,4 0,747 99,6

x +S 100,7 0,42 100,4 + 1,13

(a) = mg/100 mL. Concentracin referida a las soluciones clarificadas de medida, y se corres-
ponden con el % de cafena! en las muestras de caf.

Con el fin de corroborar la ausencia de interferencias en la regin de cuantificacin


de la cafena se han utilizado los criterios estudiados por nosotros (2).
La precisin de los dos mtodos, seguidos en la correccin del fondo, ha sido eva-
luada realizando seis ensayos sobre una solucin de caf de tueste natural, obtenindose
un Cv% (n = 6, X = 1,26) en todos los casos inferior a 0,5 (para el mtodo de
Morton y Stubb de 0,4, y para el mtodo de la Segunda Derivada de 0,3), lo que in-
dica una elevada precisin.

Estudio de la recuperacin.- Se han utilizado ocho soluciones problemas, cuatro de


cafs verdes y cuatro de tueste natural, a los que se aadieron cantidades de cafena de
concentracin 0,5 y 0,75 mg/100 ml (tabla 1), encontrndose una recuperacin de al-
rededor del 100%.

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Por ltimo, se han analizado cinco muestras comerciales de caf verde (Brasil, Co-
lombia, Etiopa, Kenia y Mxico) y cinco muestras de caf de tueste natural de dis-
tintas casas comerciales, por estos mtodos y el de referencia de la AOAC, no obser-
vndose diferencias significativas entre ellos al aplicar el test "t" de diferencia entre
pares.

Tabla 11

Determinacin del contenido en cafena en cafs verdes y de tueste natural


por el mtodo de referencia y los dos mtodos estudiados

Mtodo de:
Muestra
Micro Bailey-Andrew Morton y Stubb Segunda Derivada

CAFS VERDES

1 .. . 1,13 1,19 ( 0,06) (a) 1,19 ( 0,06)


2 .. . 1,28 1,23 ( -O,OS) 1,22 ( -0,06)
3 .. . 1,13 1,10 ( -0,03) 1,10 ( -0,03)
4 .. . 1,11 1,11 ( o ) 1,13 ( 0,02)
S .. . 1,12 1,13 ( 0,01) 1,13 ( 0,01)

X:-t-S -0,002 + 0,0421 o 0,0464


tcal (b) ...... 0,106 o
CAFS DE TUESTE NATURAL

1 1,18 1,18 ( o ) 1,18 ( o )


2 1,49 1,SO ( -0,02) 1,47 ( -0,04)
3 1,22 1,2S ( 0,03) 1,24 ( 0,02)
4 1,S4 1,SS ( 0,01) 1,S2 ( -0,02)
S 1,S4 1,S4 ( o ) 1,S2 ( -0,02)
X:+ S... .. ...... . 0,004 + 0,0182 -0,012 0,0228
tcal (b) ........ . 0,491 1,177

(a) = Entre parntesis figuran las diferencias de cada mtodo con el mtodo de referencia.
(b) = t calculada para la t terica (t1-re/2, = 0,05, 4 grados de libertad) = 2,776.

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Aceptado el 7 de marzo de 1990.

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