CAPTULO
Tcnicas de hibridacin
Miriam Ruth Bueno Topete Alejandra Natal Vega Magaa
Introduccin
Al revelar los numerosos mtodos mediante los cuales
las clulas procesan, aaden, eliminan y transfieren in
formacin gentica, los bilogos moleculares abrieron
el camino para el desarrollo de sus propias manipula
ciones genticas. En los ltimos aos se han desarro
llado tcnicas que han permitido abordar el anlisis y
la manipulacin del cido desoxirribonucleico (DNA,
deoxyribonucleic acid) de una forma antes inimagina
da. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho po
sible investigar ms a fondo la estructura y la funcin
de los genes, en especial de los genes eucariticos,
inaccesibles por otros mtodos. Cuando los investiga
dores se enfrentaron por primera vez con el gran tamao
y la complejidad del DNA, incluso el del virus ms sim
ple, la posibilidad de descifrar la informacin gentica
codificada pareca estar ms all de toda esperanza.
Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se
le deba aislar del resto del genoma, ya que cada gen
representa una pequea seccin dentro de un cromoso
ma; en ese contexto, no puede individualizarse. Para el
aislamiento de un gen o de fragmentos ms pequeos,
el DNA debe fragmentarse. Si bien la rotura del DNA
puede realizarse de forma mecnica, por este medio
la fragmentacin se produce al azar. La obtencin de
fragmentos especficos de DNA fue posible mediante un
mtodo desarrollado a partir de herramientas propias de
ciertos organismos procariotas, como lo son las enzimas
de restriccin (vase captulo 14). Para avanzar hacia un
estudio ms detallado del DNA se necesit una meto
dologa que permitiera obtener grandes cantidades de
fragmentos especficos de DNA. Estos fragmentos po
dan ser DNA genmico, DNA complementario (cDNA)
o DNA obtenidos a partir de oligonucletidos sintticos.
A menudo, antes de que un determinado fragmento de
DNA o de RNA mensajero (mRNA) pueda manipularse
de cualquier modo, primero debe localizarse. Los cro
mosomas, incluso los de las clulas eucariticas ms
simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por
lo que localizar un segmento especfico es como tratar
de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para locali
zar fragmentos especficos se utilizan las tcnicas de
hibridacin de cidos nucleicos. Entre las tcnicas de hi
bridacin ms comunes se encuentran Southern blot,
Northern blot, Slot blot, Dot blot, hibridacin in situ,
hibridacin en solucin y citometra de flujo. Antes de
abordar cada metodologa es importante mencionar al
gunos aspectos bsicos que facilitarn el entendimiento
tcnico de estas herramientas de la biologa molecular,
como son la electroforesis de cidos nucleicos y la defi
nicin de sondas.
16
Electroforesis de cidos nucleicos
La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de
macromolculas. La separacin tiene lugar debido a la dife-
rente movilidad que presentan las macromolculas cargadas
cuando se someten a la influencia de un campo elctrico
como consecuencia de su relacin carga/masa. Los cidos
nucleicos son molculas cargadas de manera negativa, de-
bido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La
naturaleza del enlace fosfodister de las cadenas polinu-
cleotdicas condiciona la carga de un cido nucleico, que
es casi igual al nmero de grupos fosfato. La electroforesis
en geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados,
cmaras por lo general horizontales, y requiere de dos ele-
mentos indispensables: la fase mvil y la fase estacionaria.
La primera es el medio amortiguado que permite la movi-
lidad de las molculas cargadas hacia los electrodos corres-
pondientes cuando se genera un campo elctrico. La fase
estacionaria, o soporte, es un polmero de naturaleza gela-
tinosa conocida como agarosa (originalmente obtenido de
algas, como el agar-agar, pero de composicin ms homo-
gnea). Dependiendo de su concentracin genera poros de
cierto tamao a travs de los cuales migran los fragmentos
de DNA o RNA. Por lo general, la concentracin es de 0.5 a
2%. La agarosa posee la propiedad de permanecer lquida
a ms de 50 C y de formar un gel al enfriarse. Los frag-
mentos de cidos nucleicos separados por electroforesis se
visualizan mediante su tincin con bromuro de etidio, un
colorante que se intercala entre las bases del DNA y que
emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta
(vase captulo 13).
Sondas
Las sondas son segmentos de DNA o RNA de cadena sen-
cilla marcados con molculas reporteras, como enzimas o
radioistopos, que permiten su fcil deteccin. El diseo
de la sonda, es decir, su secuencia nucleotdica, es lo que
le permitir, entre miles de fragmentos que forman parte
del genoma de un ser humano, identificar un solo gen o
el fragmento de un gen. Gran parte del xito de este tipo
de estrategias moleculares depende de la especificidad de
la sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 ba-
ses, conocidas tambin como oligonucletidos, hasta miles
de bases de nucletidos. Pueden sintetizarse y purificarse
con relativa facilidad por instrumentos comerciales dispo-
nibles en la actualidad. En trminos generales, las sondas
se obtienen a partir de sntesis qumica o de plsmidos, que
148 Metodologa del DNA recombinante
se clonan con la sonda de inters. La especificidad de la
sntesis de la sonda depender del objetivo de estudio (por
ejemplo, el diagnstico de mutaciones en enfermedades
genticas o la identificacin de un polimorfismo).
Southern blot
Fundamento
La tcnica de Southern blot la desarroll Edwin Southern
en 1975; es una estrategia estndar para analizar DNA pre-
viamente digerido con enzimas de restriccin.
Esta tcnica se utiliza para determinar la presencia de
un gen o fragmentos del DNA especficos en una mezcla
de cidos nucleicos extrados con anterioridad.
Se basa en la aplicacin de dos procesos fundamenta-
les: la desnaturalizacin o separacin de las cadenas com-
plementarias del DNA y la hibridacin o unin de dos ca-
denas complementarias. Este fundamento es compartido
por todas las tcnicas de hibridacin.
Procedimiento tcnico
En este procedimiento, primero se asla el DNA de cual-
quier clula del organismo excepto de glbulos rojos, ya que
carecen de ncleo. Para el anlisis molecular de un pacien-
te, el DNA puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la
extraccin puede hacerse tambin de otras fuentes: cul-
tivos celulares, clulas de lquido amnitico, vellosidades
corinicas o cualquier rgano biopsiado. Una vez extrado
el DNA, se digiere con enzimas de restriccin (una o dos)
y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de
agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasio-
nes se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos
que se van a separar son muy pequeos. En este procedi-
miento electrofortico, como ya se mencion, las muestras
se someten a un campo elctrico; como los fragmentos de
DNA tienen carga negativa se mueven hacia el electrodo
()
Buffer de
transferencia
Papel filtro
Gel
Membrana
Papel filtro
(+)
Figura 16-1.
positivo y los fragmentos ms pequeos migran con ms
rapidez.
Las molculas de DNA separadas pueden visualizarse
mediante su tincin con bromuro de etidio u otro com-
puesto intercalante. En este momento el procedimiento
no es informativo, debido a que el fragmento de inters
se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados
por las enzimas de restriccin. Con posterioridad, el DNA
se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, median-
te un proceso qumico, generalmente por tratamiento con
lcalis. A continuacin, los fragmentos se transfieren del
gel a un soporte slido, como membranas de nitrocelulosa
o de nailon. Las membranas de nailon presentan algunas
ventajas; mayor capacidad de unin de cidos nucleicos
(400 ug/cc2), mayor resistencia y vienen cargadas positi-
vamente o con carga neutra. Existen diferentes mtodos
para la transferencia, como la capilaridad, el vaco o la
electrotransferencia. Es importante sealar que la finalidad
de la transferencia es crear una rplica de lo que se tena
en el gel, ahora en un soporte mucho ms slido, como es
una membrana (figura 16-1). Por ltimo, para identificar
uno o ms fragmentos entre millones, se utiliza una son-
da especfica marcada con alguna molcula reportera (por
ejemplo, radiactividad, 32P-dCTP). La sonda se pone en
contacto con la membrana y en aquellos lugares en donde
la sonda encuentre su secuencia complementaria se pega-
r, proceso conocido como hibridacin. La sonda emitir
radiactividad, la cual se detectar mediante un proceso de
revelado con placas de rayos X. La emisin de la sonda co-
rresponder nicamente al fragmento de inters. En la fi-
gura 16-2 se observa un esquema de cada uno de los pasos
involucrados en la tcnica de Southern blot.
Marcaje de las sondas
Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general
con 32P) o enzimticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una
60 volts
Transferencia
Membrana con
cidos nucleicos
 Tcnicas de hibridacin 149

Corte con enzimas

de restriccin Electroforesis Fragmentos
separados

DNA genmico
Fragmentos de DNA

Pelcula
Papel absorbente

Membrana
Membrana Gel
Autorradiografa Amortiguador

Deteccin de la secuencia
de inters Hibridacin con la
sonda marcada

Figura 16-2. Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la tcnica de Southern blot. Obtencin del DNA
genmico y digestin con enzimas de restriccin, electroforesis, transferencia, hibridacin especfica con una sonda y deteccin
de la secuencia de inters.

ventaja de los sistemas enzimticos es que, una vez marcada
la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que
el marcaje radiactivo es ms corto (para 32P, de 15 das). Sin
embargo, la sensibilidad vara: las sondas radiactivas detec-
tan hasta 0.1 pg de cido nucleico y las enzimticas, entre 1
y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo
largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede
utilizarse la enzima polinucletido cinasa (que introduce un
nico nucletido marcado en el extremo 5 de la sonda) o la
enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleti-
dos marcados en el extremo 3 de la sonda).
El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedi-
miento de nick traslation (figura 16-3). En este mtodo se
combinan dos actividades enzimticas:
1. Actividad DNasa 1, que suprime un nucletido al azar
de una de las dos cadenas de la sonda.
2. Actividad de DNA polimerasa, que, a partir del hueco
dejado en la cadena de DNA por la DNasa 1, va incor-
porando nuevos nucletidos por complementariedad
(entre los que estn marcados), tomando como molde
la otra cadena de DNA intacta.
Otro mtodo para marcar sondas es el de random pri-
mers (secuencias cortas de oligonucletidos, normalmente
hexmeros, que por su pequeo tamao hibridan al azar a
lo largo de toda la cadena). Al aadir la enzima DNA po-
limerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van
incorporndose nucletidos en que algunos van marcados
radiactivamente hasta que finalmente se completa la ca-
dena.
Aplicaciones
La tcnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para
identificar genes asociados con enfermedades de transmi-
sin gentica, e identificar mutaciones, como rearreglos,
deleciones y dosis gnica en caso de portadores. La figura
16-4 representa el diagnstico de anemia falciforme a tra-
vs de Southern-blot.
Tambin se utiliza para detectar polimorfismos en los
fragmentos de restriccin de diversos genes y la presen-
cia de DNA de ciertos microorganismos infectantes como
bacterias y virus.
150 Metodologa del DNA recombinante

A G G T C C A T G C T cundarias), la transferencia, la hibridacin con una sonda

y el revelado.
T C C A G G T A C G A
Aplicaciones
Actividad DNasa Es una herramienta muy til para el estudio de los produc-
OH
tos de la transcripcin gnica (mRNA) y de su regulacin,
ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la
A G T C C A T G C T
abundancia de especies del RNA en diferentes condiciones
experimentales o comparar condiciones clnicas normales
T C C A G G T A C G A C*
o patolgicas.
A
Actividad DNA pol
G*
Dot/slot blot
T Tras el aislamiento y separacin de los cidos nucleicos,
A G G* C C A T G C T
stos se aplican directamente a la membrana sin separar-
los, segn su peso molecular; es decir, no se realiza elec-
T C C A G G T A C G A
troforesis. La fijacin se hace por lo general con vaco y en
un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot
blot) o ser lineal (slot blot) (figura 16-5). Es posible reali-
OH zar detecciones no slo cualitativas (positivo o negativo)
A G G* T C A T G C T sino tambin cuantitativas, utilizando como patrn dilucio-
nes seriadas de concentraciones conocidas del genoma que
se est determinando. Son especialmente tiles cuando se
T C C A G G T A C G A
quieren detectar fragmentos obtenidos a partir de una clo-
nacin en que la cantidad de fragmentos en la mezcla es
pequea y no representa mucha dificultad su localizacin.
A G G* T C* C* A T G* C* T
Hibridacin in situ
T C C A G G T A C G A Este es un mtodo histoqumico que emplea a la biologa
Figura 16-3. Marcaje de una sonda del DNA por nick transla- molecular de la misma manera que la inmunohistoqumica
tion. En el primer paso de la reaccin, la enzima DNasa 1 utiliza los mtodos de la inmunologa. Los principios de
produce una pequea rotura (nick) en una de las cadenas del ambos mtodos son semejantes y el resultado final es el
DNA. A partir de sta, la DNA polimerasa 1 aade nuclotidos mismo: la identificacin de componentes tisulares en una
al extremo 3 OH generados. Dicha enzima tiene, adems, laminilla que pueden observarse al microscopio (figura
actividad de exonucleasa 5-3, que libera nucletidos del 5
16-6). La especificidad de la inmunohistoqumica se basa
del nick. La eliminacin de nucletidos del extremo 5
y la adicin de nuevos nucletidos al extremo 3 provoca el
en la unin antgeno/anticuerpo, mientras que la especifi-
movimiento del nick a lo largo del DNA (nick translation). La cidad de la hibridacin in situ se basa en la unin de una
sustitucin de uno o ms de los nucletidos que van a ser sonda con una secuencia complementaria de DNA o RNA
incorporados de nuevo por nuclotidos marcados radiactiva- dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Nor-
mente origina la formacin de molculas marcadas (sondas). thern blot, la hibridacin in situ no requiere de la extrac-
cin de cidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se
lleva a cabo el procedimiento de deteccin e hibridacin;
de ah el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas
Northern blot que se utilizan para la hibridacin in situ pueden ser ra-
diactivas y no radiactivas. En la actualidad, las ms utili-
Diferencias con Southern blot zadas son las no radiactivas de las cuales existen variantes;
sta es la contraparte del Southern blot y como cido nu- marcadas con fluorescencia, modalidad conocida como hi-
cleico se utiliza RNA en lugar de DNA. A diferencia del bridacin in situ acoplada a un sistema de fluorocromos
Southern blot, con esta tcnica no se utilizan enzimas de (FISH) (figura 16-7), diogoxigenina (DIG), biotina, fosfa-
restriccin, ya que las molculas de RNA son ms peque- tasa alcalina o peroxidasa. Un aspecto relevante de este
as y para su anlisis no requieren su fraccionamiento. Sin tipo de sondas es que el detalle morfolgico no se pierde, a
embargo, prcticamente comparten todos los dems pasos, diferencia de lo que ocurre con las sondas radiactivas. Otra
como son la electroforesis, la desnaturalizacin (aunque el modalidad de marcaje es con anticuerpos antihaptenos,
RNA es de cadena sencilla, puede formar estructuras se- ofrece la ventaja de usar etiquetas fluorescentes diferentes
 Tcnicas de hibridacin 151

Gel de electroforesis teido

Membrana de hibridacin

Normal portador afectado

Kb

20

Figura 16-4. Southern blot para el diagnstico de anemia falciforme. El esquema de la izquierda representa el DNA digerido con
enzimas de restriccin, separado por electroforesis y teido con bromuro de etidio. Al extremo del gel, se observa un marcador de
peso molecular como referencia, expresado en kilobases (kb). El esquema de la derecha muestra el resultado de la hibridacin,
en que se observan las bandas que se reconocen por la sonda. En este caso, el diagnstico se dirigi hacia una hemoglobinopata
(anemia falciforme), una enfermedad autosmica recesiva. Por el mtodo de Southern blot se observa claramente la dotacin
gnica en caso de sujetos portadores y afectados por la enfermedad.

simultneamente para la deteccin de secuencias distintas.
Esta estrategia es utilizada generalmente para la hibrida-
cin de cromosomas y de mRNA. Una nueva alternativa es
el marcaje de anticuerpos con molculas de oro coloidal,
usadas para la deteccin por microscopia electrnica.
o revelado. En el caso de sondas radiactivas se realizar
autorradiograf a. Se cubren las secciones con emulsin fo-
togrfica y se exponen durante tres a siete das a 70C. En
A) Dot blot B) Slot blot

Aspectos tcnicos
El primer paso para la hibridacin es la preparacin y fi-
jacin del tejido, en el cual deben conservarse los cidos
nucleicos lo ms ntegramente posibles, mantener la mor-
fologa del tejido y permitir una accesibilidad suficiente
para que la sonda penetre. La fijacin con formalina, segui-
da de una inclusin con parafina es el procedimiento ms
usado. Despus de la fijacin las secciones de tejido deben dots slots
adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante
el procedimiento de hibridacin. Para la adhesin, por lo
general se utiliza gelatina crmica o polilisina. Antes de la
hibridacin, los tejidos se pretratan con HCl (que extrae Figura 16-5. Esquema de la visualizacin del dot blot y slot
blot. El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de
protenas e hidroliza parcialmente las secuencias diana)
fijacin de los cidos nucleicos en una membrana o filtro es
y proteinasa K (que incrementa la penetracin y la acce- lo que determina la forma en que se visualiza esta tcnica
sibilidad de la sonda) y se someten a una posfijacin con molecular. A) Soporte que se utiliza para realizar un dot blot,
paraformaldehdo (incrementa la especificidad de la seal). en que los orificios estn en forma de puntos. B) Soporte
Se realizan diferentes lavados para remover las sondas que se utiliza para realizar un slot blot, en que los orificios se
que no hibridaron y finalmente se procede a la deteccin encuentran en forma de lneas.
152 Metodologa del DNA recombinante

Muestra fijada en el caso del uso de sondas no radiactivas, las laminillas se

portaobjetos incubarn con un anticuerpo secundario dirigido contra la
sustancia con la que estaba marcada la sonda (p. ej., anti-
cuerpo antidigoxigenina o antibiotina) siguiendo el protoco-
lo segn lo ya establecido en las tcnicas inmunohistoqu-
Desnaturalizacin
micas (figura 16-8).

Aplicaciones
Hibridacin 1. La hibridacin in situ tiene un alto grado de resolu-
cin, que permite la localizacin de secuencias gnicas
a nivel cromosmico, con lo que se pueden detectar
translocaciones y otras alteraciones cromosmicas,
Sonda as como el estudio de expresin de genes (mRNA) a
DNA blanco nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones
Visualizacin
Fluorocromo son la identificacin de infecciones virales en tejidos,
as como el mapeo cromosmico.
2. La translocacin bacteriana es la migracin de bacte-
rias o productos bacterianos desde el lumen intestinal
Figura 16-6. hacia el exterior. En pacientes con cirrosis heptica, es
un detonador importante de infecciones bacterianas,
lo cual contribuye a la mortalidad de estos pacientes.
La hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) es una
herramienta importante para la deteccin de este pro-
ceso; mediante una sonda dirigida a una secuencia
conservada de la subunidad ribosomal 16S de bacte-
Laboratorio de Gentica - INEN rias, permite la deteccin y localizacin de bacterias
en la mucosa intestinal. Para este proceso es funda-
mental la fijacin rpida de pequeos fragmentos de
colon con contenido fecal para preservar la mayora
de bacterias adheridas a la mucosa (cuadro 16-1).

Hibridacin en solucin: captura

HER-2/neu CEP 17
Figura 16-7. Tcnica de FISH. Identificacin del gen
HER2/NEU en cncer de mama por la tcnica de FISH.
El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el cromosoma
17q, y su amplificacin est presente en 25 a 30% de las
neoplasias de mama; se relaciona estrechamente con
los estadios avanzados, metastsicos, que implican un
mal pronstico. En la actualidad existe un tratamiento
con anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos
especficamente contra el producto del gen HER2/NEU
que mejora el pronstico y la sobrevida del paciente.
de hbridos
Este mtodo utiliza sondas de RNA que tienen la capaci-
dad de hibridar con el DNA viral en solucin. Los hbridos
formados podrn detectarse por unin de anticuerpos es-
pecficos marcados con sustancias luminiscentes. Los mo-
dernos mtodos comerciales, a diferencia de las versiones
anteriores que se consideraban como subptimas, tienen
una adecuada relacin entre sensibilidad y especificidad si
se establecen lmites de seal lumnica adecuados (1 pg de
DNA; equivalentes a 100000 copias del genoma viral). La
utilizacin de un cctel de sondas de alto riesgo, que en
la ltima versin incluye 13 tipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 y 68) y otro para el grupo de bajo riesgo que
incluye cinco tipos (6, 11, 42, 43 y 44), permite la deteccin
de cualquiera de estos tipos en dos nicas reacciones. Tie-
ne como ventaja la posibilidad de semicuantificar la carga
viral, aunque esta cuantificacin solamente indica nme-
ro de copias virales y no puede corregirse en funcin del
nmero de clulas obtenidas en la toma. El inconveniente
principal es que no permite distinguir entre los diferentes
 Tcnicas de hibridacin 153

a)

Smbolos
b)
Sonda

DNA

DIG Fluorocromo
c)
DIG

Anticuerpo

HPR TSA HPR

d)
TSA

HPR TSA Biotina

DIG Estretavidina
e)

f)

Figura 16-8.

tipos virales ni la presencia de infecciones mltiples; varios suspensin de partculas (por lo general clulas) alineadas
estudios refieren inespecifidades debidas a reaccin cruza- por un lser focalizado. La citometra es un proceso que
da entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de permite medir de manera simultnea distintas molculas
bajo riesgo que pueden superar 10% de los casos. en una sola clula.

Citometra de flujo acoplado a sondas Aspectos tcnicos

La citometra de flujo es una tcnica de anlisis multipa- En el contexto de analizar el DNA mediante citometra
ramtrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una de flujo, es necesaria la utilizacin de sondas acopladas

Cuadro 16-1.

Tcnica Deteccin Sondas Tcnicas alternativas

Southern blot DNA Secuencias complementarias PCR, PCR en tiempo real, FISH
(antisentido) de DNA o RNA

Northern blot RNA Secuencias complementarias de RT-PCR, RT-PCR en tiempo real

DNA o RNA
154 Metodologa del DNA recombinante
a fluorocromos o colorantes que se puedan intercalar en
el DNA. La unin sonda-DNA no es tan fuerte como la
unin antgeno-anticuerpo; como consecuencia, cambios en
la concentracin de la sonda o la muestra pueden influir
en la intensidad de fluorescencia emitida. Una caracters-
tica de las sondas de DNA es que son estequiomtricas, lo
cual significa que el nmero de molculas de sondas unidas
al DNA es equivalente al nmero de molculas de DNA
presente en la solucin. Dependiendo de las propiedades
de la sonda, sta podr requerir o no tratamientos para su
correcto funcionamiento, ya que si la sonda tiene caracte-
rsticas liposolubles puede penetrar directamente a la c-
lula; de lo contrario ser necesario realizar un proceso de
permeabilizacin celular.
Aplicaciones
Dentro de las aplicaciones de esta tcnica se encuentra el
estudio de ploidas. La ploida de una clula indica el n-
mero de cromosomas en dicha clula. Se pueden encontrar
variaciones dentro de una poblacin individual debido a
mutaciones, ciertas enfermedades (incluyendo el cncer) y
apoptosis. Otras aplicaciones, utilizadas en su mayora en
el campo de investigacin son la muerte celular, expresin
de genes reporteros, as como las etapas del ciclo celular.
Ejercicios de integracin
1. Consulte la secuencia del mRNA de NFkB nmero
(NM_001077494.1) del banco de genes (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov). Segn la informacin all indicada,
responda lo siguiente:
En qu posicin del mRNA se unen las siguientes
sondas?
a) 5agctctgctggatcggcatggag3
b) 5acgcggacccgcgggcgtctaaaatt3
En qu exn se localizan estas secuencias?
Cul es la secuencia complementaria de cada sonda?
Segn lo mencionado en este captulo, cul tcnica
de hibridacin es la ms adecuada para detectar el
mRNA?
2. Cul de los siguientes enunciados es verdadero para la
tcnica Southern blot?
a) Se extrae RNA celular, separado por electroforesis
y transferido a una membrana, se hibrida con una
sonda marcada especfica para un gen.
b) Se extrae DNA, se digiere con enzimas de restric
cin, los fragmentos generados son marcados con
radiactividad, se separan por electroforesis y se
transfieren a una membrana, donde hibridan con
una sonda marcada especfica para un gen.
c) Se utilizan fragmentos de DNA cortados con enzi
mas de restriccin, que se separan por electrofo
resis y se transfieren a una membrana, donde se
hibridan con una sonda marcada especfica para
un gen.
3. Cul frase es correcta para describir la hibridacin in
situ?
a) La tcnica permite localizar un segmento concreto
de DNA en una posicin determinada de un cromo
soma eucaritico.
b) Si el marcaje es de tipo quimioluminiscente, la tc
nica se denomina FISH.
c) Consiste en detectar determinados mRNA marcados
con fluorescencia, utilizando sondas de DNA marca
das procedentes del cromosoma deseado.
4. La siguiente fotografa muestra la hibridacin de una
sonda en el DNA digerido con enzimas de restriccin
de los miembros de una familia con alteraciones en el
gen de distrofina. Puede identificar cules individuos
presentan el gen alterado?
1 2 3 4 5 6
5. La siguiente fotografa muestra la hibridacin de una
sonda en el mRNA del virus del papiloma humano
en pacientes con sospecha de presentar la infeccin.
Puede identificar cules individuos estn infectados?
D
1 2 3 4 5