UNIVERSIDAD PERUANA UNION

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA

E.A.P. INGENIERA AMBIENTAL

CURSO:

MICROBIOLOGA AMBIENTAL

TEMA:

PREPARACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

PARA ESTERILIZAR

DOCENTE:

ING. SADY LOURDES HARO CASILDO DE MATHEWS

ALUMNA:

NELLY MAIV CATACORA CHOQUEAPAZA

CHULLUNQUIANI JULIACA
 INGENIERA AMBIENTAL

PRCTICA N5

PREPARACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA

ESTERILIZAR

1. Objetivo:

Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilizacin como su posterior

utilizacin.

Comprender la importancia de la esterilizacin as como la proteccin de los

materiales contra la contaminacin microbiana.

2. Introduccin

Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales particulares. Al

preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe tenerse en

consideracin el proveer de las fuentes de energa, carbono, nitrgeno, fsforo, azufre y de los

factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulacin de los medios de cultivo

podemos distinguir entre medios definidos y complejos.

2.1. El medio definido

Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de compuestos qumicos

de concentracin conocida .Por ejemplo un medio definido para un hetertrofo como

Escherichia coli puede ser compuesto de NH4Cl, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4 y glucosa.

Otros elementos como fierro, manganeso y cobre estn generalmente presentes como

contaminantes de los compuestos qumicos en cantidades adecuadas para el crecimiento.

2.2. El medio complejo

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Tristemente la vida no tiene una polimerasa inversa lo que se
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Virologia.
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Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos pero ellos

estn contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos los componentes del medio ni

sus concentraciones exactas son conocidas .Ingredientes de este tipo son los extractos de la

levadura, de carne, los hidrolizados de protenas (peptona, tristona), que constituyen fuentes de

polipptidos aminocidos, vitaminas, algunos carbohidratos, etc.

De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden

clasificarse como:

2.2.1. Comunes:

Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de microorganismos. Ejemplo:

Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc.

2.2.2. Especiales:

Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o caractersticas

bioqumicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos o mejorados, selectivos y

diferenciales.

2.2.3. Medios mejorados o enriquecidos:

Son aquellos a los que se les agrega determinadas sustancias nutritivas (sangre, yema de

huevo, suero, etc.) y con ello estimulan las exigencias nutritivas de ciertos microorganismos.

Ej. Agar sangre, Caldo selenito, etc.

2.2.4. Medios selectivos:

Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el crecimiento de determinadas

especies y sustancias que inhiben el crecimiento de otras no deseadas. Ej .Agar salmonella

Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.

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2.2.5. Medios de diferenciacin:

Ponen de manifiesto algunas propiedades bioqumicas del microorganismo, como formacin

de gas, cambios en le pH, etc. Los cambios de pH se evalan incorporando indicadores en el

medio y se determinan de acuerdo al rango en estudio. Ej. .Medios azucarados como: Caldo

glucosado, Caldo Lactosado, Kligler, etc.

Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para aislar e

identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes convenientes

para este doble propsito y resultan de gran utilidad y economa .Ej. .Agar Manitol salado, Agar

Mac Conkey, etc.

Dependiendo de la tcnica de cultivo elegido, los medios mencionados anteriormente pueden

ser preparados como lquidos o slidos. Los medios mencionados anteriormente pueden ser

preparados como lquidos o slidos. Los medios lquidos contienen los nutrientes y otros

elementos en una solucin acuosa que generalmente recibe el nombre de caldo; los medios

slidos contienen adems un agente solidificante llamado agar que se utiliza para dar parte del

nombre del medio e identificarlo como slido. El agar es un polisacrido complejo derivado de

un alga marina y posee caractersticas muy tiles para microbiologa. Muy pocos

microorganismos degradan el agar de tal manera que an despus de un periodo de crecimiento,

el medio con agar se mantiene slido .El agar se funde a 90C o al punto de ebullicin del agua

y permanece en estado lquido hasta que la temperatura desciende hasta aproximadamente

40C.

Una vez preparado el medio de cultivo lquido o slido debe ajustarse al pH adecuado,

disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y protegerlo con un

tapn de algodn o material plstico que permita el intercambio de gases y que impida el ingreso

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de otros microorganismos. El medio de cultivo as dispuesto debe ser esterilizado en autoclave

a 121 C bajo 15 lb. de presin de vapor por 15 minutos. En caso de contener ingredientes

termolbiles, pueden emplearse otros mtodos de esterilizacin como la filtracin.

3. Materiales y Mtodos

3.1. EJERCICIO 1

3.1.1. Objetivo.

Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes caractersticas para el cultivo de

microorganismos.

3.1.2. Materiales.

Medios de cultivo o ingredientes deshidratados

Agua destilada o desionizada

Algodn, gasa

Balanza

Erlenmeyers de 250 y 500 ml

Esptulas

Lpiz marcador de vidrio

Papel indicador de pH

Papel aluminio y papel corriente no absorbente

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Pipetas graduadas

Probetas de 100 ml

Tubos de ensayo

3.1.3. Procedimiento

3.1.3.1. Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %)

Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio

deshidratado suficiente para prepara 100ml de caldo nutritivo.

Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue

cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.

Mezcle la preparacin con movimientos giratorios hasta la completa disolucin.

Elabore tapones de algodn para 15 tubos.

Distribuya el medio lquido con una pipeta graduada a razn de 5 ml en cada tubo.

Coloque los tubos los tapones de algodn evitando que queden flojos o muy

compactos.

Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envulvalos con papel,

identifquelos con el nombre del medio, la fecha de preparacin y el nombre de la

persona responsable en la elaboracin.

Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 C (15 lb. de presin) durante

15 minutos.

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3.1.3.2. Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar, 1.5%)

Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento anterior

con la correccin en el peso para la nueva cantidad solicitada y el erlenmeyer a usar,

debe tener unas tres veces el volumen que tendr el medio).

Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en bao de agua a ebullicin hasta que

el medio luzca transparente a la luz.

Elabore tapones de algodn para unos 16 tubos.

Una vez licuado el medio, djelo enfriar ligeramente y distribyalos en los tubos con

una pipeta graduada .Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.

Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior.

El medio restante debe ser acondicionado para su esterilizacin junto a lo anterior.

3.1.3.3. Agar Mac Conkey

(peptona, 1.7 %; proteosa peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales biliares,0.15%; NaCl, 0.5%;

agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001 %)

3.1.3.4. Agar manitol salado

(Extracto de carne 0.1 %; proteosa peptona, 1.0 %; NaCl, 7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%,

rojo fenol, 0.0025%)

Pese la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada uno.

Observando la formulacin de cada medio comprobar que los pesos a realizar son

distintos.

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Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 25. ml y llvelos a licuar en bao

de agua caliente hasta la completa disolucin del agar.

Elabore tapones de algodn para cada erlenmeyer.Luego de colocarlos cubra los

recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio,

fecha de elaboracin y el nombre de la persona responsable de su preparacin.

Esterilice en autoclave a 121 C por 15 min.

3.1.3.5. Agar almidn (Peptona, 1%; K2HPO4 ,0.5 %; almidn, 0.3%; agar, 1.5%).

Pese cuidadosamente el almidn necesario para preparar 100 ml de medio.

Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeo de agua

destilada que ha medido en la probeta.

Caliente el recipiente con el almidn agitando constantemente hasta su disolucin.

Pese el resto de los ingredientes y agrguelos con la cantidad de agua destilada

restante.

Licue el medio al bao de agua cliente hasta la completa disolucin del agar. Deje

enfriar ligeramente y ajuste el pH.

Coloque en el Erlenmeyer un tapn de algodn a la medida, cubra con papel, etiquete

el material y esterilice a 121 C por 15 min.

3.1.3.6. Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%;
agar, 1.5%).

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Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar 100 ml

de medio.

Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada

medida en probeta.

Lleve el recipiente a licuar en bao de agua en ebullicin hasta la completa disolucin

del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.

Acondicione su medio para esterilizacin como en los procedimientos anteriores.

Esterilice en autoclave a 121 C por 15 minutos.

3.2. EJERCICIO 2

3.2.1. Objetivo

Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de esterilizacin de

diversos materiales y medios de cultivo, de uso en la microbiologa.

Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en la aplicacin de los mtodos de

control microbiano.

3.2.2. Procedimientos:

3.2.2.1. Preparacin de materiales para su esterilizacin

Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua

corriente.

Dejar escurrir y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre un papel

toalla.

Elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces.

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Envolver placas Petri, pipetas, tubos y matraces, siguiendo las indicaciones.

3.2.2.2. Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarn en un horno a 150C

durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea

asptica (cerca del mechero).

Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo con las siguientes

instrucciones:

Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el nivel coincida con la marca en el

tubo indicador. En caso necesario cambiar o aadir agua destilada.

Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento mximo. Con el uso de

guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave

y colocarla dentro.

Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y a que salga

el vapor por el orificio de purga, despus cerrarlo con la vlvula.

Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 lbs /in2 de presin y

mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el

manmetro y regular el control de temperatura a valor medio o mnimo.

Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de cero. Quitar la vlvula y

con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte

trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

3.2.2.3. Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin

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Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que contienen agar se colocarn en una

superficie inclinada para que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1-2

cm de la boca del tubo.

Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de

45-50C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la

mano sin quemarse.

Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y

colocarlos a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los

medios en tres cajas Petri en esta zona asptica. Dejar que los medios solidifiquen.

3.3. EJERCICIO 3

3.3.1. Objetivo

Comprobar y evaluar los procedimientos, como prcticas aspticas realizadas en los

anteriores ejercicios.

3.4. Prueba de esterilidad de materiales

Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante

minuto en zonas no aspticas y etiquetarlas.

Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1

minuto en zona asptica y etiquetarlas.

Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30C durante 24- 48

horas. Las cajas Petri se colocarn con la tapa hacia abajo.

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Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la

aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los

tubos con medio lquido, as como la formacin de colonias microbianas en la

superficie de los medios slidos.

4. RESULTADOS

1. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco

crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.

Medio de cultivo rea no aseptica rea asectica

Caja ++ -
PCA
Caja ++ -
Caja + +
MHA
Caja + -

2. Describir la morfologa de las colonias.

En la zona no asectica hubo un crecimiento regular y su morfologa de las colonias fueron

medias ovaladas, y su dispercin es irregular ya que las colonias estn separadas.

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La esterilizacin fue realizada de una manera muy cuidadosa y por grupos por lo que

obtuvimos buenos resultados a la hora de la esterilizacin, los cuales comprobamos a la hora

de ver que ningn microorganismos crecio en la zona asptica y los materiales fueron

manejados de una manera adecuada ya desinfectadas y limpias, para esto tuvimos que hacer

todo lo que el ing. Sady Haro nos indicaba.

5. DISCUSIONES

La esterilizacin fue bien realizada pero para ser nuestra primera vez nos demoramos menos

en realizarlos, lo realizamos de una manera correcta ya que lo comprobamos con las placas

Petri que estaban en zonas acepticas.

6. CONCLUSIONES

En el presente trabajo realizado en el laboratorio aprendimos a preparar los materiales de

vidrio para la esterilizacin correcta y su posterior utilizacin; y entendimos la importancia de

la esterilizacin ya que si no son bien esterilizados los materiales de vivdrio sobre todo las mas

utilizables podemos obtener otra clase de microorganismos o talvez ningn tipo de

microorganismo sobre todo en la hora de realizar cultivos; y a realizar complejos de cultivos

de microorganismos en una zona asptica y la otra en una zona no asptica; nos aseguramos

que la practica fue bien realizada.

7. CUESTIONARIO

1. Cules son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?

En los medios complejos, la energa, el carbono, nitrgeno y azufre son provisto

principalmente por las protenas. Las vitaminas y otros factores de crecimientos orgnico son

provisto por extracto de res o extracto de levadura. Estos medios son muy tiles, pues un nico
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medio complejo puede ser suficientemente rico para satisfacer las necesidades nutricionales de

diversos microorganismos. Adems, los medios complejos se necesitan porque a menudo se

desconocen los requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular, por lo que no

se puede elaborar un medio definido.

2. Por qu no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo y s lo es en el agar almidn?

El caldo de cultivo es un medio casi liqudo sin embargo el agar de almidon es un poco

viscoso y un poco mas consistente

Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el pH del medio

usualmente quedar dentro de los lmites adecuados, an as es conveniente ajustar el pH lo que

se puede hacer con un potencimetro o en su defecto con papel pH 4.0-7.0. Si el medio es slido

la medicin y el eventual ajuste se hace a 45-50C (an est liquido) y en los medios lquidos

se hace a temperatura ambiente. La correccin del pH se efecta con HCl o NaOH 1N o 0.1 N

tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estril, se mide el pH y si fuera necesario

se ajusta en la muestra calculando despus el volumen de cido o base que sea requerido para

el total de medio.

3. Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva de cada uno de los ingredientes

que contienen los medios que ha utilizado.

El medio debe proveer una fuente de energa para que el microorganismo pueda crecer, debe

de tener carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y factores de crecimientos orgnicos que el

microorganismo no pueda sintetizar. Un medio qumicamente definido es aquel donde se

conoce exactamente la composicin qumica.

4. Describa el autoclave y su forma de uso.

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El autoclave es el equipo que se utiliza para esterilizar. Por esterilizar se entiende la

destruccion o eliminacion de toda forma de vida microbiana, incluyendo esporas presente en

objetos inanimados mediante procedimientos fisicos, quimicos o gaseosos.

La esterilizacion debe ser considerada como un conjunto de procesos interrelacionados de

enorme importancia para que puedan prestarse los servicios de salud esterilizacion de

materiales, medios de cultivo, instrumentos- dentro de condiciones rigurosas de asepsia. Los

procesos asociados para lograr un objeto inanimado este en condiciones esteriles son los

siguientes:

Limpieza

Descontaminacion

Inspeccion

Preparacion y empaque

Esterilizacion

Almacenamiento

Entrega de materiales

5. Qu otros mtodos de esterilizacin se emplean para los medios de cultivo? Qu

ventajas otorgan?

ESTERILIZACIN POR CALOR HUMEDO.

Principios de la esterilizacin

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La esterilizacin es el conjunto de operaciones destinadas a eliminar cualquier forma de vida

microbiana en un material. Es una de las tareas en que se apoya la seguridad de los pacientes,

ya que para su atencin se necesitan elementos estriles. El trabajo en la central de

esterilizacin, es importantes en cada una de las etapas en las que se llevan a cabo cada uno

de los procesos. Es fundamental que las personas encargadas de estas tareas conozcan todo lo

relacionado con este proceso, para que as puedan dirigir sus esfuerzos a garantizar que el

producto termine y se mantenga con la condicin de esterilidad.

El proceso de esterilizacin se da por el contacto del vapor saturado que produce el agua,

por lo tanto es el calor hmedo lo que causa la destruccin de los organismos mediante la

coagulacin y desnaturalizacin de las protenas. Necesita de la relacin entre tiempo, presin

y temperatura que son fundamentales en la destruccin de los microorganismos.

Cuando se eleva la presin del vapor contenido en un compartimiento cerrado su temperatura

se eleva tambin siempre y cuando el volumen del compartimiento permanezca igual el tempo

de exposicin se seleccionara de acuerdo a los materiales y equipos a esterilizar. Las esporas

bacterianas son las ms resistentes de los organismos vivos a causa de soportar agentes

destructores externos.

El proceso qumico o fsico por el cual se destruyen todas las formas de vida microbiana

patgeno o no patgeno incluyendo las esporas no es absoluto.

Ventajas y desventajas

ventajas

Rpido desplazamiento del calor, calentamiento y penetracin del mismo

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Hay destruccin de las bacterias y esporas en corto tiempo.

No deja residuos txicos.

Bajo deterioro de los materiales y equipos

Es el mtodo ms usado seguro y econmico.

Desventajas

Se puede presentar corrosin en los elementos metlicos

No permite la esterilizacin de elementos termo sensibles

No se puede utilizar para esterilizar soluciones que formen emulsin con el agua.

Ebullicin

Se utilizaba y fue un medio eficaz, con el descubrimiento de otros mtodos que do abolido,

pero es conveniente conocerlo ya que podemos encontrarlo en alguna institucin o utilizarlo de

manera domestica Esterilizacin por ebullicin (solo se trata de desinfeccin)

ESTERILIZACIN POR RAYOS GAMMA

Principios de la esterilizacin

La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de los tomos estos electrones

se desprenden con tanta violencia que chocan con tomos adyacentes y se unen a ellos, o bien

desprenden otro electrono del segundo tomo. La energa liberada se transforma en energa

trmica o qumica, esta energa causa la muerte de los microorganismos al romper la molcula

de DNA, e impide la divisin celular y la prolongacin de la vida.

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La fuente principal de radiacin ionizante son las partculas beta y los rayos gamma. La

mayora de los equipos disponibles pre envasados por el fabricante son esterilizados por

radiacin ionizante, (cobalto 60): este proceso esta limitado al uso comercial debido a sus altos

costos.

Ventajas;

La radiacin ionizante penetra en la mayor parte de los materiales para esterilizarlos

con confiabilidad

Es el mtodo de esterilizacin ms eficaz

Los rayos producen un efecto de temperatura muy reducido en los materiales y el

proceso en seco, por lo que la radiacin puede utilizase para esterilizar la mayor

parte de los equipos sensibles al calor y a la humedad

No genera radiacin residual

Desventajas

La esterilizacin con rayos gamma o beta se limita al uso comercial e industrial

Las propiedades fsicas de algunos materiales se alteran por la exposicin a radiacin

ionizante y por lo tanto su uso se limita.

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8. Bibliografa

Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. American Society for
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Standards of Sterilization. 2001. Monitoring the Sterilization Process. Online Education.

URL: http://education.sterra .com/c3/c3_monitoring.htm

The Pharmacopeia of the United States of America. Sterilization and Sterility Assurance of
Compendial Articles. Cap 1211. 32 Edition. Rockville: USP; 2008.

Tchnique de Sterilisation. (texto en Francs) Ern. Grard, Paris, Vigot frres, 1950.

A manual of Bacteriology H. Williams- Blakistons son & Co, 1919.-

Catlogo Cat-Lab. Editorial Elefantre, 2003-2005

https://youtu.be/gIMgwuOCans

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