Preparando LysatesMini Caja, Continuacin

Lisado de
sangre Use el protocolo siguiente para preparar lisado de muestras de sangre (nucleado o
No nucleado).
Nota: Si ests procesando >200 L sangre muestra, necesitas adquirir
Adicional PureLink Genmico Lysis/Obligatorio Buffer y Proteinase K
(Pgina 43).
1. Pone un bao de agua o bloque de calor en 55C.
A un tubo de microcentrifugacin estril, aade 200 L sangre fresca o congelada
2. muestra (si
Ests usando <200 L de sangre muestra, ajustar el volumen de muestra a 200 L
utilizando PBS).
Para procesar muestras de sangre >200 L y 1 mL, escala arriba todo reactivo
Volmenes consiguientemente.
3. Aade 20 L Proteinase K (suministrado con la caja) a la muestra.
4. Aade 20 L RNase Un (suministrado con la caja) a la muestra, mezcla bien
En el vortex, e incuba en temperatura de habitacin para 2 minutos.

5. Aade 200 L PureLink Genmico Lysis/Atando Buffer y mezcla bien por
El vrtex Para obtener una solucin homognea.
6. Incuba a 55C durante 10 minutos para promover digestin de protena.
7. Aade 200 L 96100% etanol al lisado. Mezcla bien en el vrtex durante
5 segundos para obtener una solucin homognea .
8. Procede inmediatamente a ADN Obligatorio (pgina 23).

Sitios de sangre Utilizan el protocolo siguiente para preparar lisado de sitios de sangre secada.
1. Pone un bao de agua o bloque de calor en 55C.
2. Sitio 25 perforadoras de sitio de sangre secada (23 mm en medida) en
un tubo estril para centrifugar.
3. Aade 180 L PureLink Digestin Genmica Buffer y 20 L Proteinase K
(suministrado con la caja) al tubo. Mezcla bien por vrtex. Asegurar las piezas son
completamente inmersas en buffer.
4. Incubar a 55C ocasionalmente mezclando en vrtex durante 20 minutos.
5. Centrifugue La muestra en velocidad mxima durante 23 minutos en
temperatura de habitacin a fibras de papel de la pelotita. Transfiera la muestra
a un tubo de micro centrifuga limpio.
6. Aade 20 L RNase Un (suministrado en la caja) al lisado, mezcla bien por el
vrtex, e incuba en temperatura de habitacin para 2 minutos.
7. Aade 200 L PureLink Genmico Lysis/Atando Buffer y mezcla bien por
vrtex para obtener una solucin homogenea.
8. Aade 200 L 96100% etanol al lisado. Mezcla bien por vrtex durante 5 segundos
para obtener una solucin homognea.
Nota: Cundo ests procesando muestras mltiples, puedes preparar un Buffer
maestro/ Mezcla de etanol por mezclar 200 L Lysis/Obligatorio Buffer y 200 L
96100% etanol para cada muestra.
9. Procede inmediatamente a ADN Obligatorio (pgina 23).
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Preparando LisadoMini Caja,

Lisado de Uso del protocolo seguro para preparar lisado de clulas de levadura.
Clulas de 1. Prepare 2 baos de agua o bloques de calor en 37C y 55C, respectivamente.
levadura
2. Prepara fresco Zymolase Buffer (ve pgina 15). Necesitas 500 L buffer por
muestra.
3. Cosecha hasta 5 107 levadura clulas por centrifugacin. Si ests utilizando una
pelotita de clula congelada, procede para Dar un paso 4.
4. Resuspend La pelotita de clula en 500 L Zymolase Buffer. Aade 15 unidades
Zymolase (lyticase) enzima e incubate en 37C para 1 hora para generar spheroplasts.
5. Centrifuge En 3000 g para 10 minutos en habitacin temperature a pelotita
el spheroplasts. Discard El supernatant.
6. Resuspend El spheroplasts en 180 L PureLink Digestin Genmica Buffer. Aade
20 L Proteinase K (suministrado con la caja). Mezcla bien por breve vortexing.
7. Incubate En 55C para 45 minutos.
8. Aade 20 L RNase Un (suministrado en la caja) al lysate, mezcla bien por
breve vortexing, e incubate en temperatura de habitacin para 2 minutos.
9. Aade 200 L PureLink Genmico Lysis/Atando Buffer y mezcla bien por breve
vortexing para obtener un homogenous solucin.
10. Aade 200 L 96100% etanol al lysate. Mezcla bien por vortexing para 5 segundos
para ceder un homogenous solucin.
Nota: Cundo procesando muestras mltiples, puedes preparar un maestro Buffer/
Mezcla de etanol por mezclar 200 L Lysis/Obligatorio Buffer y 200 L 96100%
etanol para cada sample.
11. Procede inmediatamente a ADN Obligatorio (pgina 23).

Uso el protocolo siguiente para preparar lysate de clula bucal humana swabs.
Humano Bucal 1. Pone un bao de agua o bloque de calor en 55C.
Swab Lysate 2. Sitio el bucal swab en un sterile, 2-mL microcentrifuge cubae. Aade 400 L (para
algodn y Dacron swab) o 600 L (para Omni Swab) PBS a la muestra.
3. Aade 20 L Proteinase K a un sterile microcentrifuge el tubo capaz de aguantar
tres tiempo el volumen de lysate (por ejemplo, si planeas procesar 600 L lysate,
uso un microcentrifuge el tubo capaz de aguantar 1800 L).
4. Transferencia 200600 L swab lysate al microcentrifuge el tubo que contiene
Proteinase K (Paso 3). Mezcla bien por pipetting.
5. Aadir un volumen igual de PureLink Genmico Lysis/Atando Buffer al lysate
y mezcla well por breve vortexing.
Por ejemplo, si ests procesando 200 L lysate, aade 200 L PureLink
Genmico Lysis/Atando Buffer.
6. Incubate En 55C para al menos 10 minutos.
7. Centrifuge Brevemente para recoger cualquier lysate de las gorras de tubo.
8. Aade 200 L 96100% ethanol al tubo. Mezcla bien por vortexing para 5 segundos
para ceder un homogenous solucin.
9. Procede inmediatamente a ADN Obligatorio (pgina 23).

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Procedimiento de purificacin que Utiliza Columnas de Espn

El procedimiento de purificacin esde firmado para purifying ADN genmico que utiliza
Introduccin un espn
Columna-procedimiento de centrifugacin basada en un tiempo total de 10 15 minutos.
Los materiales
Necesitaron Los componentes suministraron por el usuario
Lysates Prepar tan descrito en pginas 1621
Sterile, DNase-libre 1.5-mL microcentrifuge tubos para elution
Microcentrifuge Capaz de centrifuging >10,000 g
Opcional: sterile agua, pH 7.08.5, si ests utilizando agua para elution
Los componentes suministraron con la Caja
PureLink Lavado genmico Buffers 1 y 2
PureLink Genmico Elution Buffer
PureLink Columnas de espn en Tubos de Coleccin
PureLink Tubos de coleccin

Seguir las recomendaciones abajo para obtener los resultados mejores:

M E ND
Un
O
M T
Yo Actuar todo centrifugation pasos en temperatura de habitacin
C
E O
R N
Revisin Elution Parmetros encima pgina 13 para determinar el adecuado
elution volumen para vuestros requisitos
Actuar una 1 incubacin de minuto paso con PureLink Genmico Elution Buffer
Ser seguro para actuar los pasos de lavado recomendables to obtiene los resultados
mejores
Si ests utilizando agua para elution, siempre utilizar sterile agua, pH 7.08.5

Antes de Empezar Aade 96100% etanol a PureLink Lavado Genmico Buffer 1 y PureLink
Lavado genmico Buffer 2 segn instrucciones en cada etiqueta. Mix Bien. Mark
En las etiquetas que el etanol est aadido. Tienda tanto lavado buffers con etanol en
habitacin
Temperatura.

ADN obligatorio 1. Sacar un PureLink Columna de Espn en un Tubo de Coleccin del paquete.
2. Aadir el lysate (~640 L) prepar con PureLink Genmico Lysis/Atando
Buffer Y etanol al PureLink Columna de Espn.
3. Centrifuge La columna en 10,000 g para 1 minuto en temperatura de habitacin.
Nota: Si ests procesando >200 L empezando material como sangre, bucal
swabs, u Oragene preserved saliva, necesitas actuar mltiple cargando
Del lysate por transferir cualquier restante lysate al mismo PureLink Espn
Columna (encima) y centrifuge en 10,000 g para 1 minuto.
4. Discard El tubo de coleccin y colocar la columna de espn a un limpio PureLink
Tubo de coleccin suministrado con la caja.
5. Procede a Lavar ADN, pgina 24.
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Procedimiento de purificacin que Utiliza Columnas de
Espn, Continu

Lavando ADN 1. Aade 500 L Lavado Buffer 1 preparado con etanol (pedad 23) a la columna.
2. Centrifuge Columna en temperatura de habitacin en 10,000 g para 1 minuto.
3. Discard El tubo de coleccin y colocar la columna de espn a un limpio PureLink
tubo de coleccin suministrado con la caja.
4. Aade 500 L Lavado Buffer 2 preparado con etanol (pgina 23) a la columna.
5. Centrifuge La columna en velocidad mxima para 3 minutos en
temperatura de habitacin. Discard Tubo de coleccin.
6. Procede a Eluting ADN.

Eluting ADN 1. Sitio la columna de espn en un sterile 1.5-mL microcentrifuge tubo.

2. Aade 25200 L de PureLink Genmico Elution Buffer a la columna. Ve
Elution Parmetros (pgina 13) para escoger el adecuado elution volumen para
vuestras necesidades.

3. Incubate En temperatura de habitacin para 1 minuto. Centrifuge La columna en

mximo speed para 1 minuto en temperatura de habitacin. El tubo contiene
purified ADN genmico.
4. Para recuperar ms ADN, actuar un segundo elution el paso que utiliza el mismo
elution buffer volumen cuando primer elution en otro sterile, 1.5-mL microcentrifuge
tubo.
5. Centrifuge La columna en velocidad mxima para 1.5 minutos en
temperatura de habitacin.
El tubo contiene purified ADN. Saca y discard la columna.

Almacenando ADN Tienda el purified ADN en 20C o ADN de uso para el deseado ro abajo
Aplicacin.
Para almacenamiento de plazo largo, store el purified ADN en PureLink Genmico
Elution
Buffer En 20C cuando ADN almacenado en el agua es subject a hidrlisis de cido.
Para evitar repetido helado y derritiendo de ADN, tienda el purified ADN en
4C para uso inmediato o aliquot el ADN y tienda en 20C para largo-plazo
Almacenamiento.
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