AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JUNIO 19 DE 2009

 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

TRABAJO DE GRADO
PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL
PARA OPTAR AL TTULO DE MICROBILOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR: FABIO ROLDN, Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JUNIO 19 DE 2009

 NOTA DE ADVERTENCIA

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.

Artculo 23 de la Resolucin No. 13 de julio de 1946

 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

APROBADO

__________________________ __________________________
Fabio Roldn, Ph.D. Ziv Arbeli, Ph.D.
Microbilogo Microbilogo
Director Codirector

__________________________ __________________________
Aura Marina Pedroza, Ph.D. Gloria Acosta, M.Sc
Bacteriloga Microbiloga
Jurado Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JUNIO DE 2009

 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

_________________________ _________________________

Ingrid Schuler Garca, Ph.D Janeth Arias Palacios, M.Sc

Decana Acadmica Directora

Facultad de Ciencias Carreras Microbiologa

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JUNIO 19 DE 2009

 AGRADECIMIENTOS

A Fabio Roldn, Erika Garca, Ziv Arbeli y Joaqun Benavidez por permitirme
participar en un proyecto de aspiraciones grandes, imponentes e importantes. A
Fabio por ser el ejemplo de una carrera exitosa y a Erika por ensearme a dar
pasos grandes. A Carlos por ser un compaero incondicional dentro y fuera del
laboratorio, porque gracias a su humor, serenidad y responsabilidad, este proceso
estuvo cobijado por una gran amistad. A todas las manos amigas que en momentos
de desesperacin nos brindaron su ayuda, Johan, Juan Pablo, Angela y Anglica,
espero que sigan haciendo parte de este proyecto y que sus logros se queden en
casa.

A INDUMIL por creer en el proyecto y motivar la respuesta de sus participantes

dndonos un ejemplo de palabra y eficiencia. A la Unidad de Saneamiento y
Biotecnologa Ambiental (USBA) por el espacio de trabajo y la formacin acadmica.

A Fabio Roldn y Erika Garca por la direccin de este proyecto, los aportes
acadmicos, la confianza, la comprensin y el apoyo en momentos difciles.

A mi familia por la confianza y la motivacin para hacer las cosas cada da mejor y a
mis amigos por ser cmplices y vctimas de este proceso.

vi

 TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS VI

TABLA DE CONTENIDO . VII

NDICE DE FIGURAS IX

NDICE DE TABLAS .. X

RESUMEN ... XI

1. INTRODUCCIN . 1

2. MARCO TERICO .. 2

2.1 DEGRADACIN MICROBIOLGICA DE TNT 5

2.2 RUTAS METABLICAS ... 7

2.2.1 VA I .. 8

2.2.2 VA II . 9

2.2.3 VA III ...... 11

2.3 MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE TNT .... 13

2.3.1 AISLAMIENTO . 13

2.3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO . 14

2.3.2 EVALUACIN DEL POTENCIAL DEGRADADOR .... 15

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN ..... 16

4. OBJETIVOS .... 17

5. MATERIALES Y MTODOS 18

vii

5.1 ANLISIS FSICO-QUMICO 18

5.2 AISLAMIENTO ........ 19

5.2.1 ETAPA I: PREENRIQUECIMIENTO . 20

5.2.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SLIDO ..... 21

5.2.3 ETAPA III: SEGUNDO CULTIVO Y SELECCIN MACROSCPICA DE

COLONIAS.. 21

5.2.4 ETAPA IV: MTODOS ANALTICOS: HPLC ... 22

6. RESULTADOS Y DISCUSIN .... 23

6.1 ETAPA I: PRE-ENRIQUECIMIENTO ... 24

6.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SLIDO .... 27

6.3 ETAPA III: SUBCULTIVO Y SELECCIN DE COLONIAS .. 33

6.4 ETAPA IV: MTODOS ANALTICOS: HPLC .. 35

7. CONCLUSIONES .. 43

8. RECOMENDACIONES ..... 44

9. REFERENCIAS .. 45

10. ANEXOS ... 48

viii

 NDICE DE FIGURAS

1. Estructura qumica del TNT .. 3

2. Reduccin de TNT mediante enzimas Nitroreductasas .. 10

3. Formacin del complejo Meisenheimer . 12

4. Transformacin del complejo Meisenheimer . 12

5. Diversidad de colonias obtenidas en T2 de la muestra No. 6 32

6. Subcultivo en medio lquido correspondiente a T2 .. 33

7. Coloraciones de Gram de las colonias T1, T100, T54 y T 137 .. 34

8. Cromatograma Estndar 100ppm TNT .. 36

9. Cromatograma Control No 1 .... 38

10. Cromatograma Control No 2 .. 39

11. Cromatograma Cepa T1 .... 41

12. Cromatograma Cepa T100 42

ix

 NDICE DE TABLAS

1. Propiedades fsico qumicas del TNT .. 3

2. Estudios que reportan microorganismos como potenciales degradadores

de TNT ... 6

3. Medios de cultivo ms reportados para el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT 14

4. Puntos de Muestreo seleccionados ... 18

5. Tratamientos utilizados en el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT ... 19

6. Caracterizacin fsico qumica de las muestras .. 23

7. Morfologa microscpica de los microorganismos desarrollados en los pre-

enriquecimientos .... 26

8. Nmero de colonias seleccionadas a partir de cada muestra 30

9. Cromatografa curva de calibracin de TNT 37

10. Cromatografa Control No 1 .. 38

11. Cromatografa Control No 2 .. 39

12. Cromatografa Cepa T1 .. 41

13. Cromatografa Cepa T100 . 42

 RESUMEN

El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un compuesto nitroaromtico con

propiedades explosivas y gran estabilidad qumica. Su produccin
increment desde la primera guerra mundial y actualmente supera los dos
millones de toneladas anuales. De la mano con su uso ha incrementado la
contaminacin generada por este compuesto, el cual tiene efectos
mutagnicos y carcinognicos. Estas caractersticas han generado la
necesidad de buscar estrategias para eliminarlo del ambiente; la
biorremediacin se ha perfilado como una de las ms efectivas debido a que
adems de ser ambientalmente amigable, logra la mineralizacin completa
del contaminante. Para llevar a cabo este mtodo es necesario conocer
microorganismos con capacidad metablica para degradarlo. Los sitios que
presentan contaminacin histrica con explosivos, son una excelente fuente
de aislamiento de microorganismos con potencial degradador, ya que estn
adaptados a su presencia y han adquirido la capacidad de incorporarlo a su
metabolismo y transformarlo. El aislamiento se realiz a partir de zonas
aledaas a una de las plantas de produccin y ensamblaje de explosivos
ms importante de Colombia, donde se presuma haba contaminacin
histrica de TNT. Se utilizaron tres medios de cultivo, diferenciados
bsicamente por la presencia o ausencia de fuentes adicionales de carbono
(glucosa, citrato, glicerol y acetato) y nitrgeno (NH4). El aislamiento se
realiz en tres fases diferentes, en las que se increment la concentracin
del explosivo en el medio de cultivo desde 50ppm hasta 100ppm. Se
seleccionaron de todos los medios, las colonias que presentaron diferencias
morfolgicas, y aquellas que en la ltima etapa se desarrollaron en el medio
de cultivo que no contena ninguna fuente adicional de carbono y nitrgeno.
La degradacin del explosivo por parte de los microorganismos aislados se
evalu mediante la tcnica de HPLC, la cual permiti comprobar el potencial
degradador de 31 cepas aparentemente diferentes.

 ABSTRACT

2,4,6Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound that has stand out

due to its explosive properties and its great chemical stability. Its production
has been increased since the World War II and now days it is over 2 million
tons per year. As well as the use of this product has been increase, the
contamination that it generates, which has mutagenic and carcinogenic
effects has also raised. These features have generated the need of strategies
that allow the elimination of this compound from the environment. The
bioremediation seems to be one of the most effective alternatives since it is
environmentally friendly and also it gets the whole mineralization of the
contaminant. In order to accomplish this method it is required to know
microorganisms metabolically capable to degrade this compound. Places that
present historic contamination with explosives or with some compounds of
similar chemical nature are an excellent isolation source of microorganisms
with degradation potential for these compounds. It occurs not only because
the microorganisms have adapted to the compound presence but also
because they have acquired the capability of incorporate it to its metabolism,
transforming it in simpler and less toxic compounds. The isolation was made
from zones near by the colombian more important explosive production and
assembly plant. Those places where presume to be contaminated with
nitroaromatics like TNT. Three different culture media were used, basically
differenced by the presence or absence of additional carbon sources
(glucose, citrate, glycerol and acetate) and nitrogen (NH4). The isolation was
made in three different phases in which the explosive concentration was
increased from 50ppm to 100 ppm. The colonies that were selected from all
the different media were those that presented morphological differences, and
those which in the last stage developed in the culture medium that has not
additional sources of carbon and nitrogen. The explosive degradation by the
microorganism was evaluated with the HPLC technique.

1. INTRODUCCIN

El TNT es uno de los explosivos ms importantes dentro de la industria

militar debido a que detona con gran potencia y por su estabilidad es fcil de
manipular. En Colombia, se viene utilizando en diversas actividades como la
minera, las excavaciones y las demoliciones, y esto ha provocado el
incremento de su produccin.

Este compuesto es uno de los nitroaromticos ms conocidos y hace parte

de un grupo de xenobiticos recalcitrantes que generan efectos nocivos
sobre el medio ambiente. Dichas estructuras aromticas nitrogenadas, se
caracterizan por ser compuestos persistentes y altamente txicos, son
qumicos mutagnicos y carcingenicos, que estn clasificados por la
USEPA (del ingls United States Environmental Protection Agency) como
uno de los contaminantes de mayor prioridad, debido a su toxicidad con el
ambiente y el peligro que representan para la salud humana.

Estas caractersticas, han generado la necesidad de encontrar mtodos

efectivos y ambientalmente amigables que permitan tratar diversos
ambientes contaminados con TNT. Aunque la incineracin es el mtodo ms
utilizado a nivel mundial para tratar este tipo de contaminantes, en las ltimas
dcadas la biorremediacin se ha convertido en una de las mejores
alternativas para la eliminacin de contaminantes xenobiticos, debido a que
representa ventajas en cuanto a costos, seguridad, mineralizacin completa
y efectividad, frente a los otros mtodos.

La biorremediacin es definida como la degradacin biolgica de

compuestos orgnicos mediante el metabolismo de diversos organismos. Su
mecanismo de accin ha convertido al conocimiento de microorganismos con
potencial degradador de compuestos recalcitrantes como el TNT, en el
principal objetivo para su implementacin en ambientes contaminados con
compuestos de esta naturaleza.

Experiencias en biorremediacin basadas en la degradacin de compuestos

persistentes como explosivos, fenoles e hidrocarburos, reportan que los
microorganismos nativos presentes en estos ambientes contaminados son
los degradadores ms efectivos, pues estn adaptados a las condiciones del
ambiente y la presencia del contaminante. Esto lleva a pensar que los sitios
con presencia histrica de contaminacin por TNT son unas de las mejores
fuentes para buscar degradadores nativos con capacidad para utilizar este
compuesto en su crecimiento como fuente de carbono y/o nitrgeno

2. MARCO TERICO

A partir de 1830, con el desarrollo de la qumica orgnica, se empezaron a

sintetizar gran diversidad de compuestos, dentro de los que destacaron
gracias a su propiedad explosiva, los productos resultantes del proceso de
nitrificacin (Lewis et al., 2003). La Primera Guerra Mundial, trajo consigo
un gran avance en la produccin de estos compuestos, que logr consolidar
la industria militar como una de las industrias ms importantes durante el
siglo XX. El 2,4,6-trinitrotolueno, ms conocido como dinamita o TNT, ha sido
uno de los productos dominantes dentro de esta industria, siendo tambin
uno de los ms utilizados en el desarrollo de bombas, granadas, propulsores
y dispositivos detonantes empleados en demoliciones (Nyanhongo et al.,
2008), gracias a que por su estabilidad es fcilmente manipulable.

El TNT es el producto de la nitracin del tolueno (Figura 1), que se genera

mediante una reaccin llamada sustitucin electroflica, la cual requiere la
presencia de una mezcla de cidos ntricos y sulfricos altamente
concentrados (McMurry, 2004). Este compuesto posee una gran estabilidad
qumica, y esto permite que en la produccin de dispositivos detonantes
pueda utilizarse de forma pura, sin la presencia de ninguno de sus ismeros
(Unin Espaola de Explosivos, 1994). Sin embargo, en algunas ocasiones,
se generan mezclas con otro tipo de nitrocompuestos de igual naturaleza

como el pentaeritritol, con el objetivo de aumentar el potencial detonante de

los productos (Ballesteros 2006).

Figura 1: Estructura qumica del 2,4,6-Trinitrotolueno.

Tomada de: Lewis et al., 2003

Tabla No 1: Propiedades fsico qumicas del TNT

Propiedad Magnitud
Punto de solidificacin 80,6C
Punto de Degradacin 300C
Temperatura de Explosin 400C
Solubilidad Agua 20oC 120mg/L
Coeficiente Henry 0,0018
Presin de Vapor 20oC 150Pa
Densidad 1,65g/cm3
Velocidad de Detonacin 6900m/s
Peso Molecular 227,1 gmol

Tomada de: Unin Espaola de Explosivos, 1994

Byung-Hoon et al., 2008

Adems de ser un compuesto qumicamente estable, el TNT se caracteriza

por ser insoluble en agua, neutro y no corrosivo (Unin Espaola de
Explosivos, 1994). Forma cristales color amarillo plido y bajo la luz solar se
torna color rojizo. Su temperatura de fusin est cercana a los 80,6C y la de
explosin supera los 400 C (Tabla 1), por lo cual debe utilizarse un
detonador para ocasionarla. Parte de la estabilidad de este compuesto se
debe a la insensibilidad que posee hacia los golpes, la friccin y la agitacin

(Unin Espaola de Explosivos, 1994). Es importante tener en cuenta que

para mantener estables sus caractersticas a temperatura ambiente y
trabajarla sin peligro de explosin, la muestra debe estar disuelta en
compuestos como etanol y acetona (Ballesteros, 2006).

EL TNT es uno de los explosivos ms utilizados, su produccin supera los

dos millones de toneladas anuales (Byung-Hoon In et al., 2008), y esta es
una de las razones por las cuales se ha convertido en un contaminante de
gran prioridad dentro de la lista especial que maneja la EPA acerca de los
qumicos contaminantes txicos ms peligrosos. Adicionalmente, el TNT
hace parte de un grupo de xenobiticos recalcitrantes nocivos para el
ambiente (Bradley et al., 1994); razn que cual ha motivado diversas
investigaciones dirigidas hacia la bsqueda de tratamientos que permitan
recuperar las zonas afectadas con estos compuestos, las cuales
generalmente estn ubicadas alrededor de las plantas de produccin, y
ensamble de armamento (misiles) o de lugares de alta actividad militar. Estas
zonas se han caracterizado por presentar concentraciones superiores a los
200g TNT/Kg de Suelo (Zoe & Neil, 2006).

Muchos de los compuestos nitroaromticos, como los explosivos,

fertilizantes, insecticidas y solventes, han sido clasificados como compuestos
citotxicos y carcinognicos (Park et al., 2003). Por parte del TNT, se ha
reportado que tiene la capacidad de causar anomalas en los eritrocitos,
destruccin del hgado y diferentes tipos de cncer (Zoe & Neil, 2006), y es
esta otra de las razones por las cuales se clasifica como un contaminante
prioritario.

Debido a que su estructura qumica no es similar a la de algn compuesto

generado de forma natural, el TNT, y en general todos los nitroaromticos, se
han convertido en compuestos altamente persistentes, pues su constitucin

qumica artificial, limita el proceso de degradacin por microorganismos

nativos presentes en los suelos contaminados (Zoe & Neil, 2006). Estas
caractersticas y su persistencia en el ambiente afecta la integridad del
ecosistema provocando efectos mutagnicos en los humanos, peces, algas y
microorganismos (Park et al., 2003).

Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, fsicos, qumicos y

biolgicos para tratar ambientes contaminados con explosivos, entre los que
destacan la incineracin de suelos, el compostaje y la biorremediacin. Sin
embargo, algunos estudios demuestran que la degradacin biolgica de
compuestos nitroaromticos representa ventajas frente a las otras
soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable,
econmico, seguro para el personal que lo efecta y efectivo debido a que no
traslada el contaminante de un ambiente a otro, sino que realmente lo
trasforma en metabolitos simples e inocuos (Zoe & Neil, 2006).

Es as, como conocer el metabolismo de los microorganismos capaces de

degradar los explosivos en compuestos ms simples y menos txicos para el
entorno, ha tomado gran importancia, abriendo las puertas al desarrollo de
mtodos de remediacin biolgica.

2.1 Degradacin Microbiolgica de TNT

El hallazgo de microorganismos presentes en reas contaminadas con

compuestos nitroaromticos como TNT, solventes y fertilizantes, evidencia la
existencia de especies capaces de tolerar estos compuestos y utilizarlos en
su metabolismo, bien sea como fuente de carbono o nitrgeno. Esta
capacidad y la gran diversidad metablica de los microorganismos se ha
convertido en un potencial biotecnolgico para la biorremediacin de
compuestos xenobiticos como los nitroaromticos.

Numerosos estudios han reportado el aislamiento de microorganismos con

potencial degradador de TNT (Tabla 2), capaces incluso de mineralizar este
compuesto, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos

como potenciales degradadores de TNT.

FUENTE AO INVESTIGACIN
Desulfovibrio sp: Transformacin de TNT en
Boopathy R., et al. 1993 compuestos como 2,4-diamino-6-
nitrotolueno.
Mycobacterium vaccae: Degradacin de
TNT produciendo un compuesto marrn
Vanderberg L., et al. 1995
identificado como 4-amino-2,6-dinitrocido
benzico.
Actinomyces sp: Degradacin aerbica y
Pasti-Grigsby M., et al. 1996 anaerbica de TNT con produccin de
intermediarios hidroxilaminotoluenos.
Estudio sobre la transformacin de TNT en
Tope A., et al. 1999 aminonitrotoluenos por parte de una cepa
de Arthrobacter sp.
Anabaena sp: Transformacin de TNT en
Pavlostathis S., et al. 2002
productos solubles y metabolitos polares.
Evaluacin de la capacidad de Klebsiella
Kim H., et al. 2002 sp. Para degradar TNT en compuestos
menos txicos como amino-nitrotolueno.
Estimacin de la cintica de degradacin de
Park C., et al. 2002 TNT por parte de una cepa de
Pseudomonas putida.
Evaluacin de la capacidad metablica de
Escherichia coli para convertir TNT en
Yin H., et al. 2004
compuestos como Hidroxilamino-
dinitrotolueno.
Clostridium acetobutylicum: Degradacin de
Kutty R., et al. 2005
TNT mediante enzimas nitroreductasas.
Raoutella terrgena degradacin de TNT en
Claus H., et al. 2007
metabolitos ms sencillos
Aislamiento en suelos contaminados con
Claus H., et al 2007 TNT de una cepa de Raoultella terrgena
capaz de degradar este compuesto.

2.2 Rutas Metablicas de Degradacin de TNT:

Se conocen principalmente tres vas metablicas por las cuales algunos

microorganismos degradan el TNT, convirtindolo en compuestos
intermediarios menos txicos. La primera (Va I), se da en condiciones de
anaerobiosis y consiste en una transformacin secuencial de los grupos nitro
unidos al anillo aromtico hacia la correspondiente amina (Yin et al., 2004).
Esta va de transformacin, es generalmente realizada por microorganismos
anaerbicos, donde Clostridium sp es uno de los ms reportados, junto con
algunas bacterias sulfatoreductoras como Desulfovibrio sp (Zoe & Neil,
2006).

As mismo, se han descrito otras dos vas alternativas, que ocurren en

presencia de oxgeno, an cuando una de ellas no lo utiliza como aceptor
final de electrones. Precisamente, la segunda va (Va II), es aquella en la
que el TNT acta como un aceptor de electrones, debido a la gran facilidad
que existe para reducir los nitro-grupos formados por los enlaces nitrgeno-
oxgeno altamente electroflicos (Yin et al., 2004), con este metabolismo se
han reportado bacterias como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y
Pseudomonas putida (Zoe & Neil, 2006).

La tercera va (Va III) es una de las rutas metablicas ms complejas, que

se caracteriza por la formacin de un complejo llamado Meisenheimer, que
se genera cuando el microorganismo es capaz de atacar directamente los
enlaces que conforman el anillo aromtico. Esta es una de las vas ms difcil
y menos comn dentro de los microorganismos reportados (Zoe & Neil,
2006).

 2.2.1 Va I

La descripcin de esta ruta metablica es dada con claridad en el estudio

realizado por Preuss y col. (1992), donde utilizaron bacterias
sulfatoreductoras crecidas en un medio con sulfato y piruvato como fuente de
energa y TNT como nica fuente de nitrgeno.

Esta degradacin consiste, bsicamente, en una reduccin secuencial de los

grupos nitro del TNT hasta sus respectivas aminas (Yin et al., 2004). Algunos
autores reportan que la reduccin del primer nitro-sustituto del TNT, puede
darse bajo condiciones tanto de aerobiosis como anaerobiosis (Zoe & Neil,
2006). Cuando se lleva a cabo este paso se obtiene uno de los primeros
subproductos, denominado: 4-amino-2,6-dinitrotolueno (4-ADNT), y su
ismero: 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-ADNT) (Preuss et al., 1992). Una de
las caractersticas de esta secuencia de reacciones, es que el segundo grupo
nitrogenado no se reduce hasta que finaliza la reaccin anterior, por lo cual el
segundo paso est definido por la transformacin de 4-ADNT y 2-ADNT a
2,4-diamino-6-nitrotolueno (DANT) (Preuss et al., 1992).

La siguiente etapa es la reduccin total del TNT, produciendo finalmente

triaminotolueno (TAT). Esta reaccin requiere un donador de electrones
como el piruvato o el monxido de carbono y un conjunto de enzimas
encargadas de catalizar la reaccin, llamadas hidrogenasa, Piruvato:
ferredoxin oxidoreductasa y monxido de carbono dihidrogenasa (Preuss et
al., 1992).

Por lo general, este paso ocurre de manera directa sin la generacin de

ningn intermediario, sin embargo se han reportado casos en los que bajo la
accin de la enzima monxido de carbono dihidrogenasa se genera un
compuesto intermediario conocido como 2,4-diamino-6-hidroxilaminotolueno

(DAHAT) (Preuss et al., 1992). Los resultados obtenidos en este experimento

sugirieron que bajo estas condiciones, el monxido de carbono juega un
papel bifuncional dentro de la reaccin, donde adems de ser el donador de
electrones puede ser inhibidor de la reduccin de DAHAT a TAT (Preuss et
al., 1992).

2.2.2 Va II

Esta es una de las rutas metablicas que aunque no es estrictamente

aerbica, por lo general ocurre en presencia de oxgeno (Kim et al., 2002). El
proceso, consiste en una reaccin reductiva (Figura 2), a partir de la cual,
uno o mximo dos de los grupos nitro que componen el TNT son convertidos
en radicales nitroso e hidroxilamina, por accin de enzimas nitroreductasas
(Kim et al., 2002).

 TNT

NitrosoDinitrotolueno

HidroxilaminoDinitrotolueno

AminoDinitrotolueno

Figura 2: Reduccin de TNT mediante enzimas Nitroreductasas

(Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

10

 2.2.3 Va III

Esta ruta metablica corresponde a la degradacin aerbica del TNT. La

formacin del complejo Meisenheimer y la dependencia de oxgeno, son sus
principales caractersticas (Zoe & Neil, 2006). Actualmente no se reportan
muchos microorganismos capaces de llevar a cabo este mecanismo, sin
embargo se conoce con certeza que Pseudomonas fluorescens,
Enterobacter cloacae y Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar
compuestos nitroaromticos mediante esta va (Nes et al., 2001).

Este tipo de metabolismo, al ser uno de los ms complejos, es tambin el

menos conocido, aunque no se han determinado con seguridad todos los
metabolitos producidos, se cree que la etapa final de esta ruta es la
mineralizacin total del TNT (Vorbeck et al., 1994; Nes et al., 2001; Zoe &
Neil, 2006).

La formacin del complejo Meisenheimer (Figura 3), implica la prdida de las

propiedades aromticas del benceno. Aunque este compuesto es uno de los
mejores donadores de electrones, cuando se encuentra nitrogenado (como lo
es el TNT), pierde propiedades oxidativas, debido a la presencia de los
grupos nitro unidos a sus carbonos 2,4 y 6 (Zoe & Neil, 2006). En
consecuencia, el potencial redox del TNT disminuye, llevndose a cabo un
ataque reductivo que trae consigo la formacin NO2 y el complejo
anteriormente mencionado (Figura 4) (Nes et al., 2001; Zoe & Neil, 2006).

11

 Figura 3: Formacin del Complejo Meisenheimer

(Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

ComplejoHbridoMeisenheimer

ComplejoDihibridoMeisenheimer

Figura 4: Transformacin del complejo Meisenheimer

(Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

12

Aunque los ltimos productos de esta ruta metablica no se han podido

identificar, se ha confirmado que la transformacin del complejo dihbrido-
Meisenheimer ocurre mediante varias reacciones de reduccin que genera la
produccin de diversos metabolitos y NO2 (Zoe & Neil, 2006).

2.3 Microorganismos Degradadores de TNT

2.3.1 Aislamiento

Numerosos estudios reportan que los microorganismos nativos de ambientes

contaminados con explosivos, son los microorganismos que presentan mejor
potencial degradador de compuestos nitrogenados como el TNT.

Debido a la complejidad qumica que caracteriza a todos los compuestos

xenobiticos, la bsqueda de estos microorganismos implica la localizacin
de reas de contaminacin histrica, que son aquellos lugares en los que el
compuesto ha permanecido presente durante largos periodos de tiempo; con
el objetivo de encontrar microorganismos que han conseguido adaptarse a
su presencia, desarrollando potencial degradador, que les permite
aprovecharlo en su metabolismo como nica fuente de carbono o nitrgeno
(Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998).

Varias investigaciones reportan que el TNT es tomado por los

microorganismos como fuente nica de nitrgeno (Zaripov et al., 2004; Oh et
al., 1998). Por ese motivo, necesitan la presencia adicional de compuestos
que puedan consumir como fuente de carbono, bien sea materia orgnica
presente naturalmente en el suelo o carbohidratos simples de fcil
degradacin como glucosa, succinato y acetato (Gonnison et al., 1993)

13

2.3.1.2 Medios de Cultivo

El aislamiento de microorganismos con este potencial degradador, requiere

de un medio de cultivo que le brinde las condiciones nutricionales para
efectuar este metabolismo. En la Tabla No 3, se muestra el contenido de
cinco medios de cultivo diferentes, utilizados en estudios realizados con
microorganismos degradadores de compuestos nitroaromticos. En trminos
generales, adems del explosivo, los microorganismos deben contar con una
fuente de carbono, una solucin mnima de sales, fsforo, vitaminas y
elementos traza.

Tabla No 3: Medios de cultivo ms reportados para el aislamiento de

microorganismos degradadores de TNT.

FUENTE AO MEDIO DE CULTIVO

FC: -
FN: 100ppm DNT
Medio Base: K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4,0.3
g/L;(NH4)2S04, 0.5 g/L; NaCl, 0.5 g/L; MgSO4 -
Spanggord R., et al. 1991 7H20, 0.05 g/L; CaCl2.2H20, 0.1 g/L; FeSO4
7H20, 0.003 g/L.
Elementos Traza: H3BO3, 0.1g/L; CaSO4 5H20,
0.05 g/L; ZnSO4. 7H20, 0.05 g/L; Na2MoO2
6H20, 0.05 g/L.
FC: Lactato o Piruvato 30mM
FN: TNT 100ppm
Medio Base: KH2PO4, 2.94 mM; K2HPO4, 1.15
Boopathy R., et al. 1993
mM; NH4Cl, 9.35 mM; NaCl, 10.27 mM; MgCl2,
0.5 mM; CaCl2, 0.34 mM; Na2SO4, 20.0 mM;
Na2S, 0.5 mM; Resarsurina 0,003 mM.
FC: 2,5g/L Glucosa
FN: 300ppm TNT; 1g/L Sulfato de Amonio
Kim H., et al. 2002
Medio Base: 0,1g/L MgSO4; 3,5g/L K2HPO4;
1,5g/L KH2PO4; 1g/L Extracto Levadura
FC: Glucosa 5g/L
FN: TNT 12-200 g/L
Zaripov S., et al. 2003 Medio Base: 0,25g/L MgSO4; 4,5 g/L Na2HPO4;
3 g/L KH2PO4; 1 g/L (NH4)SO4; 0,05 g/L
Extracto de Levadura
Agar Nutritivo Standard
Claus H., et al. 2007
Con adicin de 10mg/L TNT

14

Como se muestra en la tabla anterior (Tabla No 3), la concentracin de TNT

ptima para estimular la degradacin del compuesto por parte de los
microorganismos, vara en las investigaciones en un rango muy amplio, pues
abarca concentraciones que van desde 50ppm, hasta 200g/L (200.000ppm).
Sin embargo algunos estudios reportan que concentraciones por encima de
los 100ppm ejercen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de los
microorganismos con potencial degradador (Gonnison et al., 1993).

2.3.2 Evaluacin del Potencial Degradador

La evaluacin del potencial degradador de los microorganismos crecidos en

un medio, se da generalmente mediante el control de consumo del sustrato,
en este caso TNT. Los mtodos ms utilizados para esto son la
cromatografa de gases y la cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC)
(Nes et al., 2001), el objetivo es determinar la disminucin de la
concentracin inicial de TNT presente en el medio en un determinado
intervalo de tiempo.

En el anlisis por HPLC, un gran nmero de estudios reportan el etanol

(Lachance et al., 2004; Collie et al., 1995; Park et al., 2003) como la fase
lquida ms utilizada, sin embargo tambin se usan compuestos como
metanol y acetona. Aunque esta tcnica es la ms reportada para el estudio
de la degradacin de compuestos nitroaromticos, Bruns-Nagel y col (1996)
reportan que la cromatografa de gases fue el mtodo ms rpido y eficiente
para la deteccin de compuestos como TNT, 4-ADNT y 2-ADNT en muestras
provenientes de suelos contaminados.

Por otra parte, existen tcnicas ms especficas, en cuanto a que son tiles
para detectar uno de los posibles productos de la degradacin. La deteccin
de nitratos, mediante la tcnica colorimtrica de Nessler, es una alternativa
viable cuando se evala la degradacin de TNT por parte de un

15

microorganismo que lleva a cabo el metabolismo aerbico en el que se

produce el complejo de Meisenheimer (Vorbeck et al., 1994).

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

El uso de TNT ha incrementado con el desarrollo de la industria militar que

inici su progreso en la Primera Guerra Mundial. En Colombia, este
compuesto se utiliza en diversas actividades que incluyen la excavacin, la
minera y la milicia. De la mano de su utilizacin, ha incrementado la
contaminacin producida por la acumulacin de este compuesto en diversos
ambientes. La toxicidad de su composicin qumica y las propiedades
mutagnicas y carcinognicas que le son atribuidas, ha incentivado la
bsqueda de soluciones efectivas y econmicas, capaces de disminuir la
concentracin de este compuesto sin trasladarlo de un ambiente a otro.

Actualmente, la biorremediacin se perfila como una de las mejores

alternativas para remediar regiones contaminadas con compuestos
explosivos como TNT, debido a que es una solucin ambientalmente
amigable que requiere una baja inversin econmica. Sin embargo, en
Colombia no se reporta ninguna investigacin orientada a la biorremediacin
de explosivos y esto ha impedido el aprovechamiento de sus ventajas en
nuestro pas.

La biorremediacin, es una herramienta biolgica que busca la degradacin

de compuestos qumicos persistentes, por medio de organismos vivos que
son capaces de metabolizarlos. Esta alternativa exige el conocimiento previo
de microorganismos (en este caso) con una capacidad metablica para
degradar compuestos de naturaleza qumica similar al contaminante. Esta
necesidad y el hecho de que no existen estudios similares en Colombia, ha
motivado esta investigacin, cuyo objetivo principal fue aislar
microorganismos nativos de suelos contaminados con explosivos, capaces
de degradar TNT.

16

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Aislar microorganismos degradadores de TNT, a partir de ambientes

contaminados con explosivos.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

Identificar sitios contaminados en los que posiblemente se encuentren

microorganismos con potencial degradador de TNT.
Evaluar si el TNT es utilizado por los microorganismos degradadores
como fuente de carbono y/o nitrgeno, utilizando otras fuentes
adicionales fcilmente asimilables.
Realizar una caracterizacin macro y microscpica de los
microorganismos degradadores de TNT aislados.
Comprobar la degradacin de TNT por parte de los microorganismos
aislados mediante la tcnica de HPLC.

17

5. MATERIALES Y MTODOS

Las muestras de suelo, agua y lodos contaminados con residuos explosivos,

entre los que se encontraban grandes cantidades de TNT, fueron recogidas
en sitios aledaos a una de las principales plantas colombianas fabricadoras
de productos explosivos comerciales. Alrededor de sus instalaciones, se
definieron doce puntos de muestreo, que fueron elegidos por su proximidad
con las reas de manipulacin del compuesto de inters y las reas de
desechos y manejo de residuos resultantes de los procesos de produccin
fsicos y qumicos (Tabla 4). Las muestras se almacenaron en bolsas
estriles que se mantuvieron en refrigeracin hasta su anlisis en el
laboratorio de USBA (Unidad de Saneamiento y Biotecnologa Ambiental).

Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados

No rea Muestreada
1 Exterior
2 Canal Exterior
3 Trampa Taller Multiplicador
4 Canal de la Trampa
5 Caneca
6 Tanque de Transporte
7 Ex Caja de Captacin
8 Concentracin Tensoactivos
9 Campo de Prueba
Lodos de Planta Tratamiento
10
de Aguas Residuales (PTAR)
11 Fitorremediacin
12 Cao PTAR

5.1 Anlisis Fsico-Qumico

Inicialmente, se realiz una caracterizacin preliminar de las muestras

determinando pH y salinidad, estas propiedades se calcularon siguiendo los
POEs del laboratorio de USBA de la Universidad Javeriana. Estas
propiedades se eligieron por la facilidad y economa con la que pueden ser
calculadas y por ser las ms importantes a la hora de guiarnos en la

18

preparacin del medio de cultivo. A la muestra nmero 6, correspondiente a

los trozos de producto comercial tomados del tanque transportador de la
planta no se le midieron estas variables, debido a que por su composicin se
recomend evitar al mximo su manipulacin.

Incluir clculos sobre la concentracin inicial de explosivo y la presencia de

fuentes de carbono y nitrgeno, habra permitido realizar una caracterizacin
completa de las muestras, arrojando datos importantes para definir cul de
los sitios funcionara mejor como fuente de aislamiento de microorganismos
degradadores, sin embargo estos ensayos no se incluyeron en este proyecto
por limitantes de tiempo y presupuesto.

5.2 Aislamiento

La preparacin de los medios de cultivo que se utilizaron fueron tomadas de

estudios que reportaron aislamientos exitosos de microorganismos
degradadores de TNT (Zaripov et al., 2004; Kim et al., 2002). Para realizar el
aislamiento a partir de las muestras tomadas, se evalu el crecimiento de
microorganismos en tres tratamientos diferentes. La diferencia entre estos
tratamientos, fue bsicamente la presencia de carbono y nitrgeno, con el fin
de determinar si el TNT era metabolizado por los degradadores como una
fuente de carbono o nitrgeno. El medio de cultivo base para los tres,
contena una solucin mnima de sales, buffer fosfato, trazas, vitaminas y
TNT.

Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento

de microorganismos degradadores de TNT

Caractersticas
Tratamiento
Fuente Carbono Fuente Nitrgeno
T1 - -
T2 + -
T3 - +

19

Como fuente de carbono se utiliz una mezcla de glucosa, glicerol, citrato y

acetato a una concentracin final de 25 ppm, y como fuente de nitrgeno 10
ppm de nitrato de amonio (NH4NO3). El explosivo se adicion a los tres
tratamientos en solucin con acetona a una concentracin final de 50 ppm,
concentracin que fue seleccionada por ser la ms reportada en diversas
investigaciones, como una concentracin ptima para evaluar la
biodegradacin de este compuesto.

El proceso que se llev a cabo para el aislamiento de microorganismos

degradadores, se dividi en tres etapas, cada una con una duracin
aproximada de diez das.

5.2.1 Etapa I: Preenriquecimiento:

Se montaron en total 36 preenriquecimientos, tres tratamientos por cada una

de las 12 muestras, utilizando frascos de vidrio estriles (100 mL).

El montaje se realiz colocando inicialmente 1 g o mL de muestra y 125 L

de solucin de explosivo en acetona, solvente que se dej evaporar en la
cabina de flujo laminar durante dos horas, con el objetivo de volatilizar la
acetona y disminuir los residuos que pudieran interferir en los ensayos y
evitar que fuera utilizado como una fuente de carbono adicional para los
microorganismos, o ejerciera un efecto txico sobre los mismos.
Posteriormente, se agregaron 4 g o mL de muestra y 45 mL del medio de
cultivo correspondiente a cada tratamiento.

Los preenriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente (21,0 0,9

o
C) y agitacin constante de 115 rpm durante 10 das. Los frascos utilizados
para mantener estos microcosmos no se sellaron completamente, para
garantizar la presencia de oxgeno en el ambiente.

20

 5.2.2 Etapa II: Aislamiento en Medio de Cultivo Slido

A partir de los preenriquecimientos, se realizaron diluciones seriadas (10-2, a

10-5) en solucin salina al 0,85% p/v, utilizando la metodologa estandarizada
por Latorre (2007) en el laboratorio de USBA. Todos los preenriquecimientos,
fueron sembrados en superficie por duplicado en tres medios de cultivo
slidos, correspondientes a T1, T2 y T3 (Tabla 5).

Adicionalmente se realiz un ensayo en una de las rplicas del Tratamiento1

(T1) que consista en adicionar el explosivo en la superficie del medio ya
solidificado, mientras que en los otros tratamientos se manej disolviendo la
solucin de explosivo y acetona en el medio lquido estril justo antes de
servir las cajas.

Todos los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 0,9 oC)
en condiciones aerbicas, durante aproximadamente dos semanas.

5.2.3 Etapa III: Segundo cultivo y seleccin macroscpica de colonias.

La etapa III inici con la seleccin de todas las colonias que crecieron en los
tratamientos y presentaron diferencias macroscpicas, esperando tomar el
mayor nmero de posibles degradadores. El segundo cultivo se realiz en
medio slido de cada uno de los tratamientos con concentracin doble de
TNT (100ppm) para generar mayor presin selectiva sobre los
microorganismos. Para llevar a cabo el aislamiento de estas colonias se
utilizaron cajas de petri marcadas con una cuadrcula de 22 espacios (uno
para cada colonia).

Cada colonia seleccionada se repic con un palillo de madera estril en los

tres tratamientos, el cual se introdujo finalmente en un tubo para centrfuga
(50 mL) con 10 mL de T2 (100 ppm de TNT), medio de cultivo elegido para el

21

anlisis mediante HPLC, debido a que es reportado como el medio ms

favorable para la degradacin del compuesto evaluado.

Estos cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 0,9 oC)

durante 10 das. Finalizado este periodo, se evaluaron las caractersticas
macroscpicas y microscpicas de todas las colonias. Se defini como
primer criterio de seleccin el crecimiento positivo en T1, debido a que por
sus condiciones nutricionales este medio podra ser el ms selectivo.

Posteriormente se evaluaron las colonias crecidas en T2 y se seleccionaron

aquellas que presentaran morfologas macro y microscpicas diferentes.

5.2.4 Etapa IV: Mtodos Analticos: HPLC

El TNT residual de los tubos sembrados en la etapa anterior, fue evaluado

mediante cromatografa liquida de alta eficiencia (HPLC), basndose
principalmente en el mtodo 8330 descrito por la EPA (EPA, 1994). Para su
desarrollo se tomaron 1.2 ml de cada cultivo y se centrifugaron a 1200 rpm
durante 10 min; el sobrenadante obtenido se pas a travs de un filtro de
membrana 0.2 m (Advantec) de nitrato de celulosa. Posteriormente se
inyectaron 100 L de cada muestra al equipo de HPLC marca Shimatzu
prominence, que consta de un detector de diodos y una columna Restek C-
18. Se utiliz una solucin Metanol:Agua (50:50 v/v) como fase mvil con un
flujo de 1 ml/minuto y una temperatura de 35C. La longitud de onda
empleada para la deteccin de los picos de TNT fue 254 nm.

Una solucin estndar de TNT fue utilizada para validar el tiempo de

retencin de este compuesto y se proces bajo las mismas condiciones.

22

Para poder cuantificar la concentracin de TNT presente en los cultivos, se

elabor una curva patrn, utilizando soluciones estndar preparadas con
concentraciones conocidas de TNT (12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm).

Se definieron dos controles diferentes. El control No 1 correspondi al medio

de cultivo del Tratamiento 2 sin ser inoculado, el cual permiti cuantificar la
concentracin inicial de TNT presente en el medio. El segundo control fue
tomado del medio de cultivo T2 contenido por un palillo de madera estril,
igual a los que se utilizaron para inocular las cepas. Esto con el objetivo de
visualizar su efecto en el medio.

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

Se realiz una caracterizacin preliminar fsico-qumica de las muestras y se

obtuvieron los siguientes valores de pH y conductividad.

Tabla 6: Caracterizacin fsico-qumica de las muestras

Conductividad
Muestra No pH Dilucin
(deciSiemens/metro)
1 7,11 0,34 1:1
2 7,34 0,22 1:1
3 6,58 0,17 -
4 7,14 1,15 -
5 2,11 1,47 -
7 7,54 0,44 -
8 7,20 14,96 -
9 7,88 0,63 -
10 8,73 1,57 1:1
11 7,42 0,47 1:1
12 8,95 0,44 1:1

La conductividad de los ambientes muestreados se determin con el objetivo

de tener un indicio a cerca de las propiedades salinas de los mismos, para
as orientar la preparacin de los medios de cultivo. En general, los valores
de todas las muestras estuvieron entre 0 y 2 dS/m, valores entre los que se

23

consideran ambientes normales de baja salinidad. Sin embargo, la muestra

No. 8, procedente del tanque de concentracin de tensoactivos, obtuvo una
conductividad superior de 14,96 dS/m indicando caractersticas de fuerte
salinidad (Tabla No. 6). Este fenmeno, puede deberse a la presencia de
compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos, que junto con los
tensoactivos, pueden ser compuestos residuos de la produccin de los
explosivos comerciales.

Como se puede visualizar en la Tabla No 6, la mayora de las muestras

presentaron un pH cercano a la neutralidad, sin embargo algunas de ellas
arrojaron valores extremos de acidez y alcalinidad. Aunque es difcil pensar
que a partir de muestras con un pH de 2,11 se logren obtener
microorganismos nativos que puedan desarrollarse en un medio de cultivo
con pH neutro, no se considera una variable que pueda influir en el
aislamiento de microorganismos degradadores de TNT, ya que como lo
reportan Zaripov (2004) y Kim (2002) en sus estudios, la degradacin
biolgica de compuestos nitroaromticos ha sido posible en amplios rangos
de pH.

6.1 Etapa I: Pre-enriquecimiento

Todos los pre-enriquecimientos presentaron turbidez lo cual poda ser

considerado como indicador de crecimiento. Se comprob la presencia de
microorganismos mediante coloracin de Gram y se observaron
principalmente tres morfotipos: cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos
(GP) y bacilos Gram negativos (GN), siendo las dos ltimas las morfologas
ms predominantes. Un estudio realizado por Fuller y col (1996) demostr
que las bacterias Gram positivas son muchos ms sensibles al TNT que las
bacterias Gram negativas, las cuales tienden a tolerar concentraciones ms
altas de este compuesto y presentar velocidades de degradacin mucho ms

24

eficientes. Sin embargo, en la evaluacin microscpica que se hizo de los

pre-enriquecimientos, fue ms comn la presencia de bacterias GP que GN
(Tabla 7), lo que puede deberse a la ventaja que representa para estas
bacterias (GP) la esporulacin.

A pesar de que los pre-enriquecimientos preparados presentaban una

concentracin considerable de TNT (50 ppm), la presin selectiva que este
ejerci sobre los microorganismos no fue tan alta, debido a la posibilidad de
que las muestras (suelos, lagos y aguas) contuvieran algunas trazas de
carbono y nitrgeno fcilmente asimilables. Aunque habra sido bastante til
determinar la presencia de estas trazas y la concentracin inicial de TNT en
cada una de las muestras para conocer con certeza las condiciones
nutricionales bajo las cuales se desarrollaban los microorganismos nativos,
esta determinacin no se realiz por limitantes de tiempo y presupuesto.

En algunas muestras se observ la presencia de bacilos Gram negativos

curvos y en forma de S, muy similares a las bacterias caractersticas del
ciclo del azufre (Tabla 7). En un estudio realizado por Kulkarni y Chaudhari
(2007) se present una revisin general de los microorganismos capaces de
degradar compuestos nitroaromticos, donde encontraron que Desulfovibrio
sp y en general bacterias sulfato reductoras, presentan la capacidad de
degradar TNT. La morfologa caracterstica de estas bacterias se encontr en
los Tratamientos 1 y 2 (Tabla 7), los cuales tienen en comn la ausencia de
una fuente adicional de nitrgeno. El estudio mencionado, reporta que estas
bacterias utilizan el TNT como nica fuente de nitrgeno, convirtindolo en
triaminotolueno (TAT) y algunos otros compuestos no identificados.

Es importante tener en cuenta que al abrir los frascos de los pre-

enriquecimientos, el sonido y los olores percibidos evidenciaron la
acumulacin de gases, los cuales sugieren un metabolismo activo por
microorganismos dentro de los mismos.

25

Aunque inicialmente las condiciones de los microcosmos fueron aerbicas,

es probable que al finalizar el periodo de incubacin, la disponibilidad de
oxgeno haya disminuido y las condiciones finales fueran favorables para el
crecimiento de microorganismos anaerobios. La degradacin de TNT se
puede llevar a cabo en cualquiera de estas condiciones, de hecho
microorganismos estrictamente anaerbicos como Clostridium sp.y
Acetobacterium sp han sido reportados como potenciales degradadores de
compuestos nitroaromticos como TNT (Neal & Arnett, 2004; Kutty &
Bennett, 2005).

Tabla 7: Morfologa microscpica de los microorganismos desarrollados en

los pre-enriquecimientos.

Bacilos Bacilos Cocos

Otra
Mtra. Tto Gram Gram Gram
Morfologa
Positivos Negativos Positivos
T1 x - x -
BGN en
1 T2 x - x
forma de S
T3 x - - -
T1 x - x -
2 T2 x - x BGN curvo
T3 x x - -
T1 x x x -
3 T2 x - x -
T3 x - x -
BGN en
T1 x - x
forma de S
4 BGN en
T2 x - x
forma de S
T3 x - x -
T1 x x - -
5 T2 x - - -
T3 - - x -
T1 x - x -
6 T2 x - x -
T3 x - x -

26

 Bacilos Bacilos Cocos

Otra
Mtra. Tto. Gram Gram Gram
Morfologa
Positivos Negativos Positivos
T1 x - x -
BGN en
7 T2 x x x
forma de S
T3 x - - -
T1 x - - -
8 T2 x - - BGN curvo
T3 x - - -
T1 x x - -
9 T2 x - - -
T3 x - - -
T1 - - - -
10 T2 x - - -
T3 - - - -
T1 x x - -
11 T2 x x - -
T3 - x - -
BGN en
T1 x - -
forma de S
12
T2 x x x -
T3 x - - -

6.2 Etapa II: Aislamiento en medio de cultivo slido

El crecimiento de colonias en los medios de cultivo correspondientes a los

tres tratamientos fue muy diverso, sin embargo no se observ ninguna
caracterstica particular de las colonias conocidas de los microorganismos
degradadores de TNT que son descritas en estudios anteriores.

Nyanhongo y col (2008) por ejemplo, realizaron un estudio en el que lograron

identificar el potencial degradador de microorganismos como Pseudomonas
putida y Bacillus SF en medio de cultivo slido, gracias a las caractersticas
macroscpicas y el viraje del color del medio provocado por las colonias.
Segn los resultados de esta investigacin, cuando los microorganismos
degradan los cristales de TNT, forman colonias color rojo oscuro y viran el
color del medio a rojo o amarillo, dependiendo del metabolito que produzcan.

27

Con el objetivo de evidenciar un efecto parecido, se realizaron dos ensayos

sobre la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, en superficie y
en solucin. Aunque se encontraron diferencias importantes en el
crecimiento de microorganismos adicionando la solucin de TNT en la
superficie del medio, es necesario estandarizar la concentracin de TNT bajo
la cual se logra opacidad en el medio de cultivo, de tal forma que se puedan
observar los halos de degradacin, o se logre visualizar el cambio de color
provocado por la produccin de metabolitos como 2-aminodinitrotolueno y
sus ismeros.

En este ensayo, en el que el TNT fue adicionado en la superficie del medio

una vez solidificado, el nmero de colonias obtenidas fue mucho ms
pequeo y la diversidad morfolgica que se apreci en estas cajas fue
menor, probablemente debido a que la concentracin final de TNT que se
consigui sobre la superficie del medio fue mayor que la que result con la
disolucin del explosivo en el medio lquido, ensayos en los que el nmero
de colonias fue mucho mayor y con una distribucin en el medio mucho ms
homognea.

La adicin del explosivo en la superficie, form una mancha blanca opaca

sobre el medio, que se difumin al adicionar el inculo. Sin embargo, en una
de las cajas fue posible observar el crecimiento de dos colonias circulares,
pequeas, blancas, convexas y de borde regular sobre la mancha de TNT.
Alrededor de las colonias se identific la formacin de una zona de
aclaramiento, que sin ser totalmente translcida, fue posible diferenciarla en
la superficie del medio. Aunque no se puede afirmar que dicha zona
corresponde a un halo de degradacin, es importante tener en cuenta, que
estas dos colonias adems de presentar la morfologa ms abundante
encontrada en los diferentes ensayos, fueron seleccionadas para pasarlas al
subcultivo de la Etapa III. De igual forma presentaron un crecimiento
abundante en el Tratamiento 2, que segn la teora se ha reportado como el

28

medio de cultivo ptimo para el crecimiento de los microorganismos con

potencial degradador de TNT.

Diversos estudios (Gonnison et al., 1993; Zaripov et al., 2003; Stenuit et al.,
2006; Kulkarni M. & Chaudhari A., 2007), han demostrado que dichos
microorganismos utilizan el explosivo como nica fuente de nitrgeno, por lo
cual recomiendan agregar al medio de cultivo una fuente adicional de
carbono fcilmente asimilable como la glucosa o el acetato (Gonnison et al.,
1993), para generar un balance de nutrientes favorable para la degradacin.
En este estudio, el tratamiento con estas caractersticas (T2) no solo
present el mayor nmero de colonias, sino que fue donde mayor diversidad
morfolgica se observ.

Como parte de los resultados, se esperaba que el crecimiento en los otros

tratamientos, en los que no se adicionaba ninguna fuente de carbono, fuera
bajo; sin embargo en T3, por ejemplo, la mayora de las muestras
presentaron crecimiento masivo de una colonia puntiforme, trasparente y
regular. Mientras que en T1, a pesar de ser el tratamiento con menor
recuperacin de biomasa, fue bastante diverso.

Es posible suponer que todos los microorganismos capaces de desarrollarse

bajo las condiciones nutricionales de estos medios, son potenciales
degradadores de TNT, sin embargo es importante tener en cuenta, que al ser
muestras procedentes de suelos y lodos, las suspensiones inoculadas,
podran contener algunas trazas importantes de carbono orgnico y
nitrgeno fcilmente asimilable, suficientes para permitir su desarrollo; razn
por la cual se realizaron pases sucesivos de las colonias en medios de
cultivo con mayor concentracin de explosivo (100ppm), esperando ejercer
una presin selectiva sobre los microorganismos no degradadores de TNT.

29

 Tabla 8: Nmero de colonias seleccionadas

a partir de cada muestra.

Muestra Origen No Colonias

1 Exterior 22
2 Canal Exterior 22
3 Trampa Taller Multiplicador 20
4 Canal de la Trampa 18
5 Caneca 16
6 Tanque de Transporte 14
7 Ex Caja de Captacin 14
8 Concentracin Tensoactivos 8
9 Campo de Prueba 15
10 Lodos de PTAR 6
11 Fitorremediacin 4
12 Cao PTAR 5

El crecimiento de microorganismos fue muy diferente en todas las muestras.

Aunque en trminos generales, fue positivo para todas, se obtuvo un mayor
nmero de colonias potencialmente degradadoras, a partir de los cultivos
procedentes de las muestras 1, 2 y 3 (Tabla 8). Estas muestras se
caracterizaron por estar constituidas de lodo y agua procedentes del pantano
que rodeaba la planta de cristalizacin del explosivo (Muestra No 1) y los
canales de desage ubicados alrededor de ella (Muestras No 2 y 3). La
carga microbiana puede deberse a la alta disponibilidad de nutrientes de
estos ambientes y la lejana de los mismos con fuentes de contaminacin por
sustancias qumicas que puedan ejercer algn efecto txico.

La muestra No 10 y la Muestra No 12, presentaron el pH ms alto de todas

las muestras obtenidas, 8,73 y 8,95, respectivamente (Tabla 6). La primera
corresponde a los lodos de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales
(PTAR) caracterizados por contener altas concentraciones de aluminio, y la
segunda al cao ubicado alrededor de sta. Probablemente el pH alto,
influy en que a partir de estas muestras la recuperacin de colonias no haya
sido muy abundante, pues como se muestra en la Tabla 8 fueron las

30

muestras a partir de las cuales se seleccionaron menos colonias

aparentemente degradadoras de TNT. El impacto qumico caracterstico de
estas zonas es la causa de la carga microbiana reducida presente en estos
ambientes.

Contrario a esto, la Muestra No 5, que tambin se caracteriz por tener un

pH extremo, pero en este caso cido con un valor de 2,11, present en
comparacin con las muestras 10 y 12, un crecimiento abundante. Mientras
en T2 se obtuvo gran diversidad morfolgica (Figura 5), en T1 y T3, las
colonias, aunque abundantes fueron todas muy similares: trasparentes,
pequeas, convexas y circulares. Debido a que el pH del medio utilizado se
encontraba cercano a la neutralidad, no se esperaba crecimiento microbiano
a partir de estas muestras, pues se dio un cambio drstico en las condiciones
ambientales, y se esperara que esto generara estrs en los
microorganismos inhibiendo su crecimiento. Estos resultados abren dos
nuevos interrogantes, el primero dirigido a la razn por la cual a partir de una
muestra con un pH extremadamente cido como lo es 2,11, lograron aislarse
un gran nmero de microorganismos en un medio con condiciones
nutricionales especiales y un pH cercano a la neutralidad. Y el segundo,
dirigido hacia la evaluacin de la eficiencia de microorganismos acidfilos
para degradar compuestos nitroaromticos como los explosivos.

Es probable que la diferencia existente entre la recuperacin de la biomasa

que se logr en las muestras con pH bsico y cido, no se deba
necesariamente a la influencia del pH sobre la capacidad degradadora de los
microorganismos, sino que es importante tener en cuenta que las muestras
de pH bsico fueron tomadas de zonas que con el objetivo de eliminar
residuos del contaminante, haban sido sometidas a diversos tratamientos
por los cuales podran estar presentes algunas sustancias qumicamente
txicas, afectando directamente la carga microbiana de estos ambientes.

31

 Figura
a 5: Diversid
dad de colo
onias obten
nidas en T2 de la Muestra No 5

En cuanto a la Mue
estra No 6,
6 que corresponde al bloque de produccto
c
comercial tomado
t dirrectamente del tanque de transsporte, no se esperab
ba
e
encontrar crecimiento
c o. Sin emb
bargo, a pa
artir de estta muestra
a se lograro
on
i
identificar 14
1 morfolog
gas diferen
ntes (Tabla
a No 8). Au
unque el crrecimiento no
n
f
fue tan ab
bundante como
c en la
as Muestra
as 1 y 2, hubo creciimiento y se
s
l
lograron ide
entificar m
s coloniass diferentess que a parttir de muesstras con alto
i
impacto qumico como
o la 10 y la 12.

Por otra pa
arte, en las Muestras 8 y 11, tom
madas del ta
anque de concentraci
c n
d
de tensoa
activos y el camp
po de tra
atamiento por fitorrremediaci
n,
r
respectivam
mente, el crecimientto fue mu
uy bajo; probablemente por la
c
concentrac
cin de aluminio provveniente de
e la PTAR y la conccentracin de
d
c
compuesto
os tensoacttivos, los cuales
c adem
ms de se
er molcula
as complejas
d
difciles de degradar, tienen un efecto emu
ulsionante, que puede
e provocar la
f
floculacin de los nutrrientes, hacciendo ms difcil su assimilacin.

e 14 y 16 colonias co
A partir de las Muesttras 4, 7 y 9 se obtuvvieron entre on
a
aparente potencial de
egradador, cifra
c muy prxima
p a la
a que se ob
btuvo a parrtir
d las primeras muesttras (Tabla 8).
de

32

6 Etapa III:
6.3 I Subculttivo y selec
ccin de colonias
c

En total se
e seleccion
naron a pa
artir de lass 12 muestras, 165 colonias
c qu
ue
p
presentaron morfolog
gas apare
entemente diferentess. Estas colonias se
s
s
subcultivaro
on en los tres medioss de cultivo
o y se coloccaron en su
uspensin en
e
T con con
T2 ncentracin
n doble de TNT (100
0ppm), med
dio que fue
e elegido por
p
f
favorecer la
a degradaccin del exp
plosivo.

Despus del periodo de incubaccin, todos los tubos eppendorf

e e los que se
en s
s
sembraron las colonia
as presenta
aron turbide
ez y un color amarillo ms intensso
q el del medio de cultivo
que c iniciial (Figura 6). Investig
gaciones re
ealizadas por
p
Nyanhongo
o y col (200
08), mostra
aron que essta coloraciin se pressenta cuand
do
s acumulan en el medio subproducto
se os de la degradaci
n como 2-
A
Aminodinitr
rotolueno y 4-Aminod
dinitrotoluen
no, los cuales son pro
oducidos por
p
B
Bacillus, Desulfovibrio
o sp. (Kulka
arni et al., 2007), Pse
eudomonass sp. (Park et
a 2002) y algunos consorcioss microbian
al., nos de baccterias Gram Negativas
(
(Kulkarni ett al., 2007)..

Figu
ura 6: Subc
cultivo en medio lqu
uido corres
spondiente
e a T2.

33

A
Aunque la mayora de
d las colo
onias que se sometie
eron a este subcultivvo,
l
lograron re
ecuperarse en T2, no todas pressentaron crecimiento
c en T1 y T3.
T
Por este motivo,
m se utiliz el crecimiento
o en T1 como prime
er criterio de
d
s
seleccin para elegirr las colon
nias de los cultivos que sera
an evaluado
os
m
mediante HPLC,
H debido a que la presin selectiva a la que se
e sometiero
on
e
estos micro
oorganismo
os fue muccho ms altta al increm
mentar la concentraci
c n
d TNT.
de

L
Las coloraciones de Gram que se realiza
aron a los subcultivoss lquidos de
d
c
colonias qu
ue se analizzaron mediante HPLC
C, revelaron
n que en su mayora, los
m
microorgan
nismos capa ecer en un medio de cultivo con
aces de cre n condiciones
a
altamente selectivas
s c
como las de
d T1, son bacterias GN,
G las cua
ales son ms
r
resistentes a conce
entraciones altas de TNT y poseen una tasa de
d
d
degradaci
n mucho ms
m rpida que
q la de bacterias
b GP
P (Zaripov et al., 2004
4).

F
Figura 7: Coloracion
C nes de Gram
m de las colonias T1, T100, T54
4 y T137

34

Finalmente tras diez das de incubacin de los subcultivos, fueron

seleccionadas 31 colonias, a las cuales les fue evaluada la capacidad
degradadora de TNT, mediante la tcnica de HPLC.

6.4 Etapa IV: Mtodos Analticos: HPLC

Para evaluar la degradacin de TNT por parte de las cepas seleccionadas,

se realiz una curva patrn preliminar con una solucin estndar de TNT de
concentracin conocida, que permitiera trazar un punto de comparacin para
determinar si la concentracin del explosivo en los diferentes cultivos haba
disminuido o no (Cromatograma, Figura 8). Como se muestra en la Tabla No
9, no fue posible realizar una relacin del rea bajo la curva, con la
concentracin de explosivo, debido a que la curva, adems de contener muy
pocos puntos, no fue del todo precisa. La zona sombreada en las tablas que
acompaan todos los cromatogramas, representa los datos correspondientes
a TNT. Como es posible verlo en la Tabla No 9, el tiempo de retencin para
el TNT fue de 5,9 minutos con un rea correspondiente a 100ppm de
aproximadamente 14678057,9 mm2.

Adicional a esto, se analizaron dos controles diferentes que permitieron

evaluar la presencia de TNT en el medio de cultivo T2 sin ser inoculado. El
primer control, correspondi nicamente al medio de cultivo y arroj un
tiempo de retencin para el TNT de 6,2 minutos (Cromatograma, Figura 9;
Tabla No 10). El segundo control se analiz diez das despus de introducir
en el medio un palillo con los cuales se estaba inoculando cada muestra.
Como se puede observar en el Cromatograma correspondiente a la figura 10
(Tabla no 11), es probable que el control se haya contaminado y la
concentracin de TNT haya disminuido, pues el rea bajo la curva
correspondiente al tiempo 6,2, que es proporcional a la concentracin del

35

explosivo, es diez veces ms pequea que la de los estndares, lo que

sugiere que la concentracin de TNT presente fue mucho menor a 100ppm.

mAU

/76.301
210nm,4nm (1.00)

400

350

300

250

200

150

100
/17.410
RT3.320/1.925
RT2.365/0.995
/1.619

50
/1.661
/0.049
/0.040

-50

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

Figura 8: Cromatograma Estndar 100ppm TNT

36

 Tabla 9: Cromatografa Curva de Calibracin de TNT

ABS 254 nm
T. RETENCIN REA ALTURA
12,5 ppm
1,307 33432,4 2159,3
1,631 133276,8 12081,8
1,755 225116,9 15220,5
2,358 438400,4 16521,1
3,371 65185,9 1824,7
5,954 1728559,7 21870,3
9,197 100731,7 1307
25 ppm
1,331 21065,7 1319,1
1,765 265919,5 16862,5
2,348 947950,5 32981,3
5,949 3421050,0 45787,6
50 ppm
0,162 14685,5 2534
0,523 1029,3 170
0,797 1809,8 141,7
2,138 2037,3 145,5
2,549 4070,1 270,6
3,406 64397,5 1899,4
100 ppm
1,463 21826,7 1962,3
1,765 62188,5 4901,7
2,318 4221569,5 207254
4,183 2284,6 133,3
5,914 14678057,9 308678,2

37

 mAU

/24.798
/17.033
210nm,4nm (1.00)
325

/55.858
300

275

250

225

200

175

150

125

100
RT2.365/0.457

75
RT3.320/0.448

50

/0.763
/0.315
/0.220

25
/0.108

-25

-50
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

Figura 9: Cromatograma Control No 1

Tabla 10: Cromatografa Control No 1

ABS 254 nm
T. RETENCIN REA ALTURA
1,694 2839784,9 115919,4
2,426 3458913,2 318677,4
3,408 5395,8 403
4,075 20630,8 1239,7
4,382 34827,2 1504,8
6,227 7966096,8 207288,9

38

 mAU

/96.315

RT2.365/1.968
210nm,4nm (1.00)

350

300

250

200

150

100

/0.978
50

/0.068

/0.179

/0.493
0

-50

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min

Figura 10: Cromatograma Control No 2

Tabla 11: Cromatografa Control No 2

ABS 254 nm
T. RETENCIN REA ALTURA
1,818 11441883,7 1004096,7
2,417 6378743,2 363018,5
6,159 140842,1 4185,1
7,322 366834,7 9964,6
7,986 225687,2 5188,2

El resultado para todas las cepas analizadas fue muy similar a los
cromatogramas que se muestran a continuacin, correspondientes a las
cepas T1 y T100. Las curvas de mayor altura que aparecen en el extremo
izquierdo de las grficas (Figuras 11 y 12), antes del tiempo de retencin del
explosivo, corresponde quizs a la presencia de azcares simples como
glucosa, acetato, glicerol y citrato, los cuales fueron la fuente de carbono

39

adicionada al medio y se caracterizan por tener tiempos de retencin

pequeos.

Para los dos casos, la curva que corresponde al TNT (probablemente situada
entre los tiempo 6-6,1) es mucho ms pequea que la del control No 1, el
cual puede considerarse la concentracin inicial de TNT en el medio, antes
de ser inoculado.

Las curvas que aparecen en el extremo derecho de los cromatogramas,

mostrando tiempos de retencin ms altos, indican la presencia de
compuestos menos polares que el TNT, pues la fase mvil utilizada fue
metanol y ste al ser un compuesto polar, hace que los compuestos no
polares, con los cuales no tiene afinidad, se demoren ms en atravesarla y
muestren un tiempo de retencin ms alto.

Diversos estudios en los que han caracterizado el metabolismo de los

microorganismos degradadores de TNT, se ha encontrado la produccin de
metabolitos menos polares como el 4-Amino-2,6-Dinitrotolueno, su ismero
2-Amino-4,6-Dinitrotolueno (Stenuit et al., 2006) y el Triainotolueno (TAT), el
cual es producido junto con otros subproductos desconocidos, pero se
resumen como la ruta ms eficiente en la degradacin del TNT (Kulkarni et
al., 2007).

El rea bajo la curva correspondiente a la concentracin de TNT presente en

el medio disminuy en todas las cepas analizadas. Aunque aparentemente,
todas tienen un potencial degradador de TNT, para poder concluir esto con
certeza es necesario hacer un seguimiento en intervalos de tiempo ms
cortos, para evaluar la reduccin del compuesto en el medio.

En vista que el control No 2 no pudo ser utilizado como un blanco de

comparacin por la presencia de contaminantes, podra evaluarse otro

40

material diferente a la madera para inocular los medios de cultivo y as

eliminar una posible fuente de contaminacin.

mAU

/97.069

RT2.365/1.879
210nm,4nm (1.00)
400

350

300

250

200

150

100
/0.089

50
/0.021

/0.443

/0.452
/0.035

/0.010

/0.003
0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Tabla 12: Cromatografa Cepa T1

ABS 254 nm
T. RETENCIN REA ALTURA
1,789 11971153,5 932139,5
2,427 5137177,1 318568
3,706 71319,2 4202,9
4,619 27899,9 1403,1
5,323 4478,1 205
6,133 2960,3 130,4
7,313 150230,8 4256,9
8,054 187625,3 3853,2

41

 mAU

/45.513
210nm,4nm (1.00)

RT2.066/10.834
350

300

/5.441
250

RT2.365/8.546
RT2.365/25.756
200

150

100

50

/1.538

/0.571
/0.979
/0.633
/0.099

/0.039
/0.052

-50
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Tabla 13: Cromatografa Cepa No 100

ABS 254 nm
T. RETENCIN REA ALTURA
1,746 3479490 316794,9
2,003 357736 46789
2,418 3380758 194810,4
4,088 16003,7 1061,7
4,593 13040,4 686,2
6,077 167444,4 4817,9
7,28 196788 5403,3

42

7. CONCLUSIONES

Los sitios ubicados alrededor de la planta de cristalizacin de TNT, a

partir de los cuales se tomaron sedimentos, fueron los ambientes a
partir de los cuales se logr aislar un mayor nmero de
microorganismos (colonias) potencialmente degradadores de TNT.

La mayor variabilidad de morfotipos se obtuvo a partir del tratamiento

2, indicando la importancia de adicionar al medio una fuente de
carbono, para favorecer la degradacin.

La mayora de las cepas que presentaron potencial degradador de

TNT son bacilos Gram negativos.

La degradacin de TNT por parte de los microorganismos aislados se

comprob mediante la tcnica de HPLC, la cual permiti comprobar la
disminucin de la concentracin de TNT presente en el medio y la
aparicin de otros metabolitos, posiblemente subproductos de la
degradacin del explosivo.

43

8. RECOMENDACIONES

Es necesario estandarizar la forma de adicionar el explosivo al medio

de cultivo, de tal forma que resulte ms fcil visualizar la degradacin
del compuesto y as realizar el seguimiento del metabolismo.

Debido a que el control No 2 (Medio de cultivo + Palillo estril)

present contaminacin, es importante probar materiales diferentes
para realizar esta siembra, con el objetivo de eliminar una posible
fuente de contaminacin.

Es necesario conseguir estndares de HPLC para diferentes

subproductos del metabolismo de TNT como aminodinitrotolueno y
triaminotolueno. Y evaluar cul sera la mejor tcnica para identificar
estas sustancias.

El aislamiento de microorganismos degradadores de TNT requiere la

elaboracin de pases sucesivos en medios de cultivo con explosivo,
para eliminar trazas de compuestos orgnicos de fcil asimilacin
provenientes de la muestra, y ejercer una presin selectiva importante
sobre los microorganismos no degradadores.

La concentracin de explosivo adicionada al medio de cultivo debe ser

superior a 50 ppm, ya que bajo esta concentracin no hay una presin
selectiva importante sobre los microorganismos nativos.

44

 8. REFERENCIAS

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47

 ANEXOS

ANEXO 1: Caractersticas macro y microscpicas de las colonias

seleccionadas para el anlisis mediante HPLC
# Origen Caract. Macroscpicas Caract. Microscpicas
Regular, mucosa, convexa
T4 Muestra 1 BGN
color crema
Irregular, cncava, seca, color
T9 Muestra 1 BGN
amarillo claro
Circular, cncava, bordes
T17 Muestra 1 regulares y claros, color BGN
amarillo
Irregular, cncava, cremosa,
T12 Muestra 1 color amarillo plido con el BGN largos
centro ms oscuro
Irregular, cremosa, cncava,
T21 Muestra 1 BGN y levaduras
color amarillo oscuro
Regular, ovalada, plana,
T24 Muestra 2 BGP
cremosa, amarillo plido.
Regular, cncava, cremosa y
T27 Muestra 2 BGP
blanca
Irregular, cremosa, bordes
T39 Muestra 2 BGP
dentados, cncava, blanca.
Regular, convexa, cremosa,
T40 Muestra 2 amarillo plido con centro BGP
oscuro.
Irregular, plana, blanca con
T42 Muestra 2 BGN
bordes oscuros.
Regular, convexa, mucosa,
T43 Muestra 2 amarilla plida y centro BGN
oscuro.
Irregular, convexa, cremosa y
T50 Muestra 3 BGN cortos
amarilla
Regular, cncava, cremosa
T52 Muestra 3 BGN delgados
color beige.
Irregular, plana, cremosa de
T58 Muestra 3 BGP
centro ms oscuro.
Irregular, convexa, cremosa,
T62 Muestra 3 BGN delgados y levaduras.
blanca con bordes oscuros.
Regular, convexa, cremosa,
T63 Muestra 3 BGN cortos
opaca y de centro oscuro.
Regular, cncava, cremosa,
T64 Muestra 3 BGN cortos y levaduras
amarillo plido.
Regular, cncava, cremosa,
T65 Muestra 4 BGN cortos.
beige de centro oscuro.
Irregular, cremosa, plana y
T68 Muestra 4 BGN cortos.
blanca

48

 # Origen Caract. Macroscpicas Caract. Microscpicas

Circular, bordes irregulares,
T69 Muestra 4 BGN cortos.
cremosa, convexa, blanca.
Circular, regular, cncava,
T73 Muestra 4 BGN cortos y levaduras.
cremosa, beige.
Irregular, convexa, cremosa,
T74 Muestra 4 BGP y BGN cortos
blanca con centro oscuro.
Irregular, seca, plana, opaca,
T87 Muestra 5 BGN cortos
transparente.
Circular, convexa, cremosa,
T89 Muestra 5 BGN
brillante, color crema.
Regular, cncava, cremosa,
T96 Muestra 5 BGN
blanca.
Circular, convexa, cremosa,
T98 Muestra 5 amarillo plido con centro BGN y BGP
oscuro.
Regular, plana, cremosa,
T99 Muestra 6 CGP y BGN
opaca, blanca
Irregular, convexa, brillante,
T100 Muestra 6 BGN
cremosa, blanca
Circular, regular, convexa,
T105 Muestra 6 BGP
cremosa y brillante
Circular, cncava, cremosa,
T107 Muestra 6 BGP
blanca
Regular, convexa, cremosa,
T111 Muestra 6 BGP
brillante, blanca, traslcida.

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