BITCORA

Cuantificacin de protenas: una

revisin
Introduccin
n duda alguna una de las determinaciones
ms usadas en biotecnologa es la cuantificacin
de protenas. Estimar la concentracin de protena
es necesario no solo en los laboratorios de
investigacin, sino tambin en la industria
alimenticia, farmacutica y biotecnolgica en
general. Existen muchos mtodos para la
determinacin de protenas (Tabla I El antiguo
mtodo de Kjeldahl se basa en la determinacin
del nitrgeno total de la muestra. Las protenas
son digeridas en un medio cido y el nitrgeno
total determinado por titulacin. Existen otros
mtodos muy sencillos y poco especficos, como
la absorbancia de las soluciones de protena en la
regin de la radiacin ultravioleta. Los enlaces
peptdicos absorben a 205-210 nm, mienfras que
los triptofanos y tirosinas lo hacen a 280 nm. Los
coeficientes de extincin varan de acuerdo a la
protena, as, para la albrnina de suero bovino el
coeficiente de extincin a 280 nm es 10/0 8 280 =
6.3, mientras que para la inmunoglobulina de
ratn 10/08280 13.8. Aunado a este problema,
muchas sustancias no proteicas absorben
frertemente en laregin del ulfravioleta,
produciendo interferencias. Este es el caso de los
cidos nucleicos.
El uso del mtodo adecuado depende de cinco
criterios: 1) la cantidad total de protena presente
en la muestra, 2) la concentracin de la protena,
3) la especificidad del mtodo, 4) la presencia de
otras sustancias que pudieran interferir y 5) la
facilidad y reproducibilidad del mtodo,
En el presente trabajo se describen
detalladamente algunos mtodos para la
cuanficacin de protenas.
Cuantificacin de protena por
el mtodo de Lowry2
La cuantificacin de protena con cobre y el
reacvo Folin es un mtodo sensible que no
requieE digestin previa. Es mucho ms sensible
y especfica que la

77
BioTecn010ga 1998"01.
Tabla 1. Comparacin de reactivos para detectar y cuantificar protenas en solucin/
Ensayo Longitude Sensibilidad y Mecanismo de accin Notas
s de onda rango efectivo
para de aplicacin
deteccin

3
 Ensayo Nano 485/590 10 ng/ml a IO Se une a detergentes en la Alta sensibilidad-
Orange gg/m I superficie de las protenas y a Variacin protena a
regiones hidrofbicas de las protena mnima. Ensayo
protenas; el colorante no rpido y preciso con un
reaccionante no presenta nico ensayo. Compatible
fluorescencia. con agentes reductores.
Ensayo de 595 Igg/ml a 1.5 Reacciona directam ente con am Gran variacin protena a
Bradford inocidos especficos y protena. No compatible
(Azul estructuras terciarias de la con detergentes. Ensayo
brillante de protena; el colorante cam bia de rpido. Util cuando la
Co om asie) caf a azul. precisin no es muy
importante
562 0.5 gg/ml a 1.2 El Cu es reducido a Cu en Compatible con
mg/ml presencia de protenas a pH detergentes, catrofos Y
Mtodo
elevado; el cido bicinconnico solventes orgnicos. No
BCA
quela a iones de Cu form ando compatible con agentes
(cido
complejos color prpura. reductores. Las muestras
bicinconnico)
deben ser leidas dentro de
un intervalo de IO min.
Ensayo de 750 l_gg/ml a 1.5 El Cu es reducido a Cu en
Lowry mg/ml presencia de protenas a pH Procedimiento lento. NO
(R eactivos elevado; el reactivo Biuret quela compatible con
Biuret y a iones de Cu + y el reactivo detergentes o agentes
Folin- Folin-Ciocalteu potencia el color reductores.
Ciocalteu) azul-
Ensayo 450/550 IO ng/ml a 150 Reacciona con grupos amino La sensibilidad depende
cuantitativo gg/ml primarios en presencia de del nm ero de aminas
CBQA cianuro o tioles; el colorante no
presentes. Reacciona con
reaccionente no presenta
otras aminas prim arias.
fluorescencia No compatible con buffers
que contengan aminas o
tioles.
Fluorescamina 390/475 0.3 gg/ml a 13 Reacciona con grupos amino La sensibilidad depende
gg/m I prim arios; el colorante no del nm ero de aminas
reaccionante no presenta presentes. No compatible
fluorescencia con buffers que contengan
Tris o glicina- El reactivo
es inestable.
OPA 340/455 0.2 pg/ml a 25 Reacciona con grupos amino La sensibilidad depende
gg/m I primarios en presenciade del nm ero de am inas
ftaldehido) mercaptoetanol; el no pcolorante presentes. No compatible
reaccionante no
presenta con buffers que contengan
fluorescencia Tris o glicina. Su costo es
bajo.
Absorcin 205 IO gg/ml a 50 Absorcin del enlace La sensibilidad depende
UV 280 gg/m I peptdico.Absorcin de tirosi- del nmero de
50 pg/ml a 2 nas y triptofano aminocidos aromticos
presentes. No es
destructivo. Su costo es
bajo.
a
Mxima longitud de onda de emisin/exitacin de onda de de absorbancia en nm.

1998/Vol. 3
 78
BioTecnologa
determinacin por absorcin en el ultravioleta a
280 nm, as como relativamente sencilla y fcil de
adaptar a anlisis enpequeaescala. Sin embargo,
la cantidad de color producido vara con
diferentes protenas y en algunos casos el color no
es estrictamente proporcional a la concentracin.
Principio
Existen dos pasos que llevan al desarrollo de color
en las protenas, la reaccin con cobre en lcali y
la reduccin del reactivo fosfomolbdico-
fosfotngstico por el complej o protena-cobre.
El color natural de las protenas en ausencia de
cobre puede ser enteramente atribuido al
contenido de tirosinas y triptofano.3' 4 Sin
embargo, en presencia de cobre, el tratamiento
alcalino de las protenas resulta en un
incremento de 3 a 15 veces en el desarrollo del
color.4' 5 La reaccin con cobre toma de 5 a 10
minutos a temperatura ambiente, pero el
calentamiento a 100 0 C o el aumento en la
concentracin de lcali acelera la reaccin con
cobre en solucin alcalina. Se requiere muy
poco cobre para obtener un color final
completo. Cuando el reactivo Folin es
adicionado a la protena tratada con buffer a
pH 10 se obtiene un color mximo debido a la
reduccin del mismo por el complejo protena-
cobre. El cambio en la absorbancia producido
Tabla 2. Reactivos compatibles con el ensayo de
Lowry2
79
Bic Tecnologa 1998/VoL 3
por la reduccin del reactivo Folin es
monitoreado a 750 nm.
Interferencias
Reactivos como el cido rico, guanina y xantina
reaccionan con el reactivo Folin, produciendo
interferencias. La guaninaproduce 50% ms
color, peso por peso, que la protena a ser
probada. La mayora de los fenoles, excepto los
nitrofenoles reducen al reactivo, debido a esto, el
timol y el cido sulfosaliclico interfieren,
mientras que el cido pcrico arriba de 0. I % es
permisible. La glicina al O. 5% disminuye el color
con la protena en un 50%, mientras que la
hidrazina a rns de 0.5% incrementa el blanco. El
sulfato de amonio a una concentracin final arriba
de 0.15% retarda la aparicin de color, esto es
debido en parte a la disminucin en alcalinidad,
pero puede ser tolerado a concentraciones
superiores a 0.25% si se adiciona una cantidad
equivalente de lcali a la muestra.2
Procedimiento
Reactivos-
Reactivo A: N%C03 al 2% en NaOH O. IN.
Reactivo B: Cuso -5H en tartrato de sodio
y potasio al 1%.
 Acido tricloroactico 0,5% neutralizado
Urea 0.5%
Guanidina 0.5% Alcohol etlico 5%

Tunstanato de sodio 0.5% Eter

Sulfato de sodio 1% Acetona 0.5%

Nitrato de sodio 1% Sulfato de zinc 0. I %

Acido perclrico 0-50/0 neutralizado Hidrxido de bario 0.1%

1998/Vol. 3
 Reactivo C: solucin alcalina de cobre,
mezclar 50 ml de reactivo A
con I ml de reactivo B; esta
solucin debe ser preparada
al momento de uso.
Reactivo D: solucin de carbonato de
cobre, es la misma que el
reactivo C pero omitiendo al
NaOH; es utilizada para
cuantificar protenas
insolubles.
Reactivo E: Reactivo Folin diluido a IN en
cido.2
Cuantificacin de protenas en solucin.
1. Pipetear en tubos de ensayo muestras que
contengan de 5 a 100 pg de protena en 0.2
ml o menos.
2. Adicionarl ml deractivo C, mezclarbienydejar
10 min o ms a temperatura ambiente.
Figura 1. Curva stndar de citrocromo (corazn de
caballo) por el mtodo Lowry.
1.4
o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Bic Tecnologa 1998/VoL 3
Protena (nmol/ml)
3. Adicionar rpidamente 0.1 ml de reactivo E,
mezclar en vortex durante 2 segundos y dejar
durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Leer absorbancia. Para concentraciones finales
de protena de 5 a 25 pg/ml, la lectura puede
hacerse a 750 nm. Para soluciones ms
concentradas la absorbancia puede leerse a 500
Cuantificacin de protenas insolubles. Esta
metodologa no es general, pero puede ser til
en algunos casos de precipitados cidos de
protenas.
l . Adicionar 0.1 ml de NaOH IN a 5-100 pg de
protena precipitada. Para muesfras ms grandes
puede ser necesario calentar por 10 min. o ms
a 100 0C en lcali IN. Esto puede disminuir las
lecturas, pero stas son muy reproducibles.
2. Despus de 30 minutos o ms, adicionar I ml de
reactivo D y dejar IO minutos a temperatura
ambiente.
3. Adicionar 0.1 ml de reactivo E, mezclar en
vortex durante 2 segundos y dejar durante 30
min a temperatura ambiente.
4. Leer absorbancia a 750 nmpara
concenfraciones
finales de protena de 5 a 25 pg/ml o a 500 nm
para soluciones ms concentradas.
Cuantificacin de protena por el
mtodo de Bradfcrd6
Este mtodo involucra la unin del colorante Azul
Brillante de Coomasie G-250 a las protenas,
provocando un cambio en el mximo de absorcin
de 465 a 595 nm y se monitorea midiendo el
81
incremento en la absorcin a 595 nrn. El ensayo es El color rojo pasa a azul cuando el colorante se
muy reproducible y rpido, puede ser empleado une a Ia protena. 7 La formacin del complejo
para procesar un gran nmero de muestras y es coloranteprotena toma aproximadamente 2
adaptable a la automatizacin. minutos y permanece estable por 1 hora, por Io

Tabla 3. Efecto de varios reactivos en Iaformacin del complejo Azul Brillante de Coomasie G-250-protend.
Reactivo Cambio en OD 595 nm (gg) Equivalentes de BSA

M KCI 0.000 0.00

M NaCl 0.000 0.00

M MgC12 0.00
0.000
M Tris 0.026 2.34

0.1 M EDTA 0.004 0.36

M (NH4)2S04 0.000 0.00

990/0 Glicerol 0.012 1.08

M 2-Mercaptoetanol 0.004 0.36

M Sacarosa 0.013 1.17

95% Etanol 0,000 0.00

Acetona 0.069 6.21

5% Fenol 0.046 4.14

0.1% Triton X-100 0.013 1.17

Triton X-100 0.590 53.10

0.1% SDS 0.01 1 0.99

SDS 0.495 44.55

O. 1 Hemosol 0.004 0.36
% Hemosol 0.108 9.72
a

Los valores anteriores fueron obtenidos cuando se agreg O. I ml de cada sustancia al ensayo.
Principio que el procedimiento es muy rpido y el tiempo
para el ensayo no es limitante.
El mtodo est basado en Ia observacin de que
el colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 El complejo colorante-protena tiene un alto
presenta dos formas coloreadas, azul y rojo. 7 coeficiente de extincin, Io que hace al ensayo

82
BjoTecno/oga 3
aproximadamente cuatro veces mas sensible que el
ensayo de Lovvry.
Interferencias
Buffers altamente alcalinos presentan
interferencia, pero puede ser contrarrestada
corriendo blancos apropiados. Reactivos
como cloruro de magnesio, cloruro de potasio,
cloruro de sodio, etanol y sulfato de amonio
no tienen efecto sobre el ensayo. Otros
reactivos como Tris, cido actico,
2mercaptoetanol, sacarosa, glicerol, EDTA y
trazas
de los detergentes Triton X- 100, dodecil sulfato de
sodio (SDS) y Hemosol tienen ligeros efectos que
pueden ser fcilmente eliminados preparando
buffers adecuados. La presencia de grandes
cantidades de detergentes presenta una gran
interferencia.
Procedimiento
El ensayo es muy reproducible y rpido, con el
desarrollo completo de color en intervalo de 2
minutos y una estabilidad de aproximadanente 1
hora.
Microensayo
I. Preparacin de reactivo- Disolver 100 mg
del Colorante Azul Brillante de Coomasie
G-250 en 50 ml de etanol al 95%. Adicionar
a esta solucin 100 ml de cido fosfrico al
85% (w/ v). Diluir la solucin resultante a I
litro. Las concentraciones finales en el
reactivo son: Azul Brillante de Coomasie
G-250 0.01 % (w/v), etanol
Bic Tecnologa 1998/VoL 3
1
25 50 75 125
Protena g g
Figura 2. Curva estndar de Albumina de suero bovino
(BSA) por el mtodo de Bradford.
4.7% (w/v), cido fosfrico 8.5% (w/v)- 7
2. Pipetear en tubos de ensayo soluciones de
protena que contengan de I O a 100 mg de
prote-
3. Ajustar el volumen a 0. I ml con el buffer
apropiado.
4. Agregar un mililitro del reactivo Azul Brillante
de Coomasie G-250 preparado como se
describe anterionnente.
5. Mezclar en vortex y leer absorbancia a 595
nm despus de 2 minutos de agregar el
colorante y antes de I hora de iniciada la
reaccin.
Cuantificacin de protena por el
mtodo BCN
La deterrninacin de protena por BCA es un
mtodo altamente sensible .8 Este mtodo
combina la reaccin de las protenas con Cu+2
en un medio alcalino (produciendo Cu+) con
un reactivo para la deteccin de Cu* altamente
83
selectivo y sensitivo denominado cido
bicinconnico.
Este ensayo muestra menos variacin de una
protena a otra. La variabilidad es similar a
aquella obtenida con el mtodo de Lowry , pero
puede ser reducida efectuando el ensayo a 600C
por 30 minutos (procedimiento mejorado).
Principio
El cido bicinconnico (BCA), en la forma de
su sal de sodio soluble en agua, es un reactivo
altamente sensible y especfico para el in
Cu+. Se ha reportado que la estructura
macromolecular de la protena y cuatro
pptidos especficos (cistena, cistina,
triptofano y tirosina) son los responsables de
la formacin de color en muestras de protena
cuando son ensayadas con BCA.9

1998/1/01
.

84
BjoTecno/oga 3
Tabla 4. Reactivos compatibles con el ensayo BCA.

Detergentes Buffers/sales Otros reactivos

Triton X-100 1 0/0 O. IM Trisa 0.1 N HCI

SDS 1% 0. IM Fosfato de sodio 0.1 N NaOH

Brij 35 0. IM Bicarbonato de sodio 10 mM EDTAb

Lubr01PX I .OM Cloruro de sodio 3.0 M Urea

CHAPS 1.0 M Glicina pH 1 1 a 40% Sacarosac

CHAPSO 02 M Acetato de sodio pH 5.5 0.2% Azida de sodio

Octil glucsido 1% 0. IM Asparagina pH 7.25 10 mM GlucosaC

Triton X-114 1% 0. IM Bicarbonato de cesio 1 mM DTTd

Nonidet NP-40 O.IM HEPES pH 7.25 1 DTEd

a
Buffers de Tris a concentraciones superiores de 0.1 M pueden usarse efectivamente si se ajusta el pH a 11.0 - 11.25. Los buffers de glicina
deben ajustase a pH 1 1 .O - 1 1.25 para evitar errores serios en la determinacin.
b
EDTA (a concentraciones superiores a 10 mM) y otros agentes quelantes fuertes pueden disminuir los iones disponibles de cobre necesarios
para el ensayo reduciendo la sensibilidad del mismo.
'Los azcares reductores pueden causar error si los tiempos de incubacin y la temperatura son elevados. La sacarosa y la glucosa, siendo
reductores dbiles, resultan en una ligera absorbancia, pero los resultados lineales pueden ser mantenidos aunque la sensibilidad del ensayo
puede verse reducida.
d
Los agentes reductores como DTT y DTE, resultan en altas interferencias que reducen la sensibilidad del ensayo. Se ha encontrado que
los siguientes compuestos interfienen en el mtodo estandar resultando en blancos excesivamente altos: 0.01 % Thimerosal, 1.0 %
Mercaptoetanol y cido ascrbico 0.1 M. Interferencias

La cuantificacin por B CA combina la reaccin Este ensayo esta tamponado a un pH ptimo de

de Biuret (reaccin de la protena con Cu+2 en un
1 1.25. Cualquier reactivo en la muestra que
medio alcalino para producir Cu+). El producto de
disminuya el pH de la formulacin a menos de 1
la reaccin presenta un color prpura, formado por
1 0 Io eleve a ms de 1 1 puede afectar la
la interaccin de dos molculas de BCA con el in
sensibilidad o reproducibilidad del ensayo. En
Cu+, es soluble en agua y exhibe una fuerte
muchos casos, ajustar el pH de la muestra a 1 1
absorbancia a 562 nm. Esto permite la antes de realizar la determinacin puede evitar
cuantificacin especfrofotomtrica de protenas en variaciones.
solucin acuosa.

3
El reactivo BCA tiene gran tolerancia a 0.8
compuestos que se encuenfran rutinariamente
0.6
en soluciones de protena. Un caso particular
es la ausencia de interferencias en concen-
aciones relativamente altas (1 %) de
0.4
detergentes inicos y no inicos. Los o

83
BioTecnologa 1998/Vo/.
reactivos listados en la tabla 4, han sido
probados con una solucin de protena de 500
mg/ml de B SA con el mtodo estndar (37
o
c/30 min). Las concentraciones listadas para
cada reactivo no interfieren con el ensayo
(error relativo menor al 3

Protocolos
El ensayo de protena por el mtodo de BCA es
flexible y permite elegir el mejor procedimiento
para una situacin dada. Es posible incrementar 0.2
la sensibilidad del ensayo aumentando el
tiempo de incubacin, aumentando la
temperatura de incubacin, o ambos. La o 20 40 60 80 100 120
estabilidad del color despus de enfriar a Protena (mg/ml)
temperatura ambiente es suficiente para
permitir las lecturas de absorbancia de
Figura 3. Curva estndar de BS por el mtodo del
mltiples muestms.
cido bicinconnico (BCA).

Procedimiento estndar. Rango aplicable de por microgramo (pg) de protena combinado

concentracin de protena = 20 - 1200 con un rpido anlisis. Temperatura 37 oc;
gg/ml. Este protocolo proporciona excelente Tiempo = 30 min.
sensibilidad de cerca de 0.012 Unidades de
Absorbancia (UA) Procedimiento a temperatura ambiente.
Rango aplicable de concentracin de protena
1.2 20 1200 mg/ml. El desarrollo del color
proceder normalmente a temperatura
86
BioTecnologa 1998/Vol. 3
ambiente. Despus de 2 horas a esta
temperatura, la sensibilidad es de 0.010
(UA)/pg de protena- Despus de 21 horas, la
sen sibilidad se duplica Temperatura
Tiempo = 2 horas.
Procedimiento mejorado. Rango aplicable de
concentracin de protena = 5 - 250 pg/ml.
Este protocolo es aplicable para aquellas
situaciones donde se espera que la
concentracin de las muestras sea baja o si se
desea emplear solo una pequea cantidad de
muestra, La sensibilidad es excelente cerca de
0.032 (UA)/gg de protena. Temperatura 600
C; Tiempo 30 minutos-
Procedimiento
Debido a que la relacin de colorante a
volumen de la muestra es la misma, todas las
tcnicas son idnticas excepto por los tiempos
y temperaturas de incubacin.
1. Preparacin del reactivo de trabajo.
Mezclar
50 partes del "reactivo A" con una parte
del "reactivo B" (Pierce BCA catlogo No.
23225). Reactivo A: contiene carbonato de
sodio, bicarbonato de sodio, reactivo BCA
para deteccin y tartrato de sodio en una
solucin de NaOH 0.2 N.
Reactivo B: solucin de sulfato de cobre
4%.
2. Preparar un grupo de estndares de
protenas de concentracin conocida,
diluyendo la pro-
87
BjoTecno/oga
tena a ensayar en el mismo diluyente de las
muestras desconocidas. El grupo de
estndares de protena debe cubrir el rango
de concentraciones indicadas en el protocolo
a seguir.
3. Pipetear 0. I ml de cada estndar o muestra
de concentracin desconocida en tubos
previamente marcados. Para blancos,
utilizar O, I ml de diluyente.
4. Adicionar 2.0 ml de reactivo de trabajo a
cada tubo y mezclar en vortex.
5. Incubar todos los tubos a la temperatura y
tiempo seleccionados.
Procedimiento estndar: 37 0 C; 30 minutos.
Procedimiento a temperatura ambiente:
temperatura ambiente; 2 horas.
Procedimiento mejorado: 60 0C; 30 minutos.
6. Despus de la incubacin, enfriar todos los
tubos a temperatura arnbiente.
7. Medir la absorbancia a 562 nm.
0.7
o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Protena (mg/ml)
3
 Figura 4. Curva estndar de BSA por el mtodo de
BioRad (microensayo).
Determinacin de protena por
Bio-Rad
Este ensayo, basado en el mtodo de Bradford,
es un procedimiento simple y preciso para la
determinacin de la concentracin de protenas
solubles. Involucra la adicin de un colorante
cido a una solucin de protena y la
subsecuente medicin a 595 nm con un
espectrofotmetro o un lector de microplatos.
La comparacin con una curva estndar
proporciona una medida relativa de la
concentracin de protena.
Principio
La cuantificacin de protena por Bio-Rad
consiste en un cambio diferencial de color en
respuesta a varias concentraciones de proteina6. El
mximo de absorbancia para una solucin cida
del colorante azul brillante de Coomassie G-250
cambia de 465 nm a 595 nm cuando se une a la
protena El colorante azul de Coomasie reacciona
principalmente con residuos de amino cidos
bsicos y aromticos, especialmente argininan .
Spector13 encontr que el coeficiente de extincin
molar de una solucin de complejo albmina-
colorante era constante sobre un amplio rango de
concentraciones. De esta forma, la Ley de
Lambert y Beer puede aplicarse para la
cuantificacin precisa de protena seleccionando
una relacin apropiada de volumen de colorante a
concentracin de la muestra.
Interferencias
Las interferencias con este ensayo pueden ser
ocasionadas por interacciones qumicas con la
protena o por interacciones qumicas con el
colorante (condiciones alcalinas o detergentes
interfieren con este ensayo). A continuacin se
enlistan reactivos

1998/1/01.
Tabla 5. Reactivos compatibles con el ensayo Bio-Rad (procedimiento
estndar)-

Acetona Fenol 5% Mercaptoetanol I M rRNA 0,25 mg/ml

Aminocidos Fosfatos I M Metanol tRNA 0,4 mg/ml

Ditiotreitol IM Glicerol NaC1 5 M SDS

Etanol Glucosa Peptonas Triton X-100 0,

Fructosa pH cido Urea 6 M

88
BioTecnologa 1998/Vol. 3
y agentes qumicos que no interfieren con este
ensayo.
Algunos de estos reactivos pueden causar
interferencias en combinacin con ciertas
protenas, sin embargo, con respecto a protenas
tales como albmina de suero bovino y
globulina, los
agentes listados muestra poca o nula interferencia.
Las concentraciones equivalentes de estos reactivos
para el microensayo corresponden a 1/40 de las
Protena ( pg/ml)
Figura 5. Determinacin de protena BSA utilizando el
mtodo Nano Orange. El recuadro corresponde al rea
marcada en la esquina inferior izquierda de la grfica
(O a 500 ng de protena por ml) e ilustra el lmite de
deteccin de IO ng/ml.
listadas en la tabla 5, esto se debe a la
diferencia en la relacin muestra a reactivo
entre el procedimiento estndar y el
microensayo.
89
BjoTecno/oga
Procedimiento (microensayo)
1. Preparar 3 0 5 diluciones de una solucin
estndar de protena, las cuales deben ser
representativas de la solucin que va a ser
analizada. El rango lineal para BSA es I
.2 a 10.0 pg/ml, mientras que para IgG el
rango lineal va de 1.2 a 25 pg/ml.
2. Adicionar 800 BI de cada muestra estndar
en tubos de ensayo. Las soluciones de
protena son normalmente ensayadas en
duplicado o (riplicado.
3. Adicionar 200 ml del colorante reactivo
Protein Assay Dye Reagent Concentrate
(Bio Rad Catlogo No. 500-0006) a cada
tubo y agitar en vortex.
4- Incubar a temperatura ambiente por al
menos 5 minutos- La
absorbanciaincrementa con el tiempo por
lo que las muestras deben incubarse a
temperatura ambiente por no ms de I
hora.
5. Medir la absorbancia a 595 nm-
Cuantificacin de protena por
el mtodo Nano Orange
Los mtodos reportados por Lowry2 y
Bradford6 as como el ensayo descrito por Smith,
que utiliza cido bicinconnico (BCA)8 , son
pruebas basadas en medidas de absorcin, lo que
hace a estos mtodos limitados en sensibilidad y
rango efectivo de anlisis. El mtodo Nano
3
Orange permite un ensayo de alta sensibilidad
para la determinacin de protenas en solucin.
Principio
La interaccin de la protena con el reactivo
diludo produce un gran aumento en la
fluorescencia que puede ser empleado para
generar una curva estndar para la
determinacin de protena mediante su
lectura a 485/590 nm. La fluorescencia del
reactivo en ausencia de la protena es
despreciable.
El ensayo de Nano Orange puede detectar
prote-
Tabla 6. Niveles de tolerancia para contaminantes en el mtodo Nano Orange para cuantificacin de protena. 'i
Glicerol
Polietilnglicol (PEG)
Urea
Ditiotreitol (DTT), 13-mercaptoetanol
KCI, NaCl, acetato de sodio, fosfato de sodio
Sulfato de amonio, cido ascrbico,
bufferHEPES, HCI, NaOH, azida de sodio,
sacarosa.
EDTA
Cloruro de calcio, cloruro de raagnesio
Amino cidos
90
BioTecnologa 1998/Vol. 3
na a concentraciones finales de 10 ng/ml cuando se
utiliza un espectrofluormetro estndar o un
minifluormetro equipado con flitro. Un slo
ensayo es suficiente para cuantificar
concenfraciones de protena entre 10 ng/ml y 10
pg/ml, un intervalo de tres rdenes de magnitud-
En contraste con los mtodos de Bradford y
BCA, el ensayo con el reactivo Nano Orange y
su complejo con la protena presentan gran
estabilidad qumica. De esta forma, la
cuantificacin puede efectuarse hasta seis horas
despus de la prepara cin de la muestra sin
prdida de seal, considerando que las muestras
se encuentran protegidas de la luz. Otra ventaja
que presenta este mtodo es una menor
variacin de protena a protena en la
cuantificacin.
10% por volumen
I % por volumen
1 OO mrvl
20 mM
IO mM
5 mM
lmM
100 pg/ml
 DNA 100 ng/ml

Dodecil-sulfato de sodio (SDS) 0.010/0

Tween 20, Triton X-100 0.001%

a
Los compuestos presentes en la solucinfinal a ensayar a concentraciones iguales o menores a las indicadas no intepfieren apreciablemente
con la determinacin. Siempre que sea posible, el blanco y estndares de protena debern ser preparados en soluciones a condiciones
similares a aquellas de las muestras experimentales.

1998/1/01.

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BjoTecno/oga 3
Interferencias
Este mtodo es compatible con la presencia de
agentes reductores- Adems, la alta
sensibilidad y estabilidad del ensayo permite
la dilucin de los contaminantes potenciales,
incluyendo sales y detergentes. Los cidos
nuclicos no interfieren con la cuantificacin.
Procedimiento
La cuantificacin de protena es ms fcil de
desarrollar que otros mtodos. Las muestras de
protena simplemente son adicionadas al reactivo
diluido NanoOrange (Molecular Probes Catlogo
NoN6666) y las mezclas son calentadas a 95 0C
por 10 min. Despus de enfriar las muestras a
temperatura ambiente, sus emisiones de
fluorescencia se miden directamente. La
fluorescencia se mide utilizando filtros para
emisin/exitacin a 485/590 nm.
Conclusiones
El mejor mtodo para la determinacin de
protenas depender de varios factores, unos
dependen de la muestra a analizar y otros de la
infraestructura con que se cuente. En todos los
casos siempre se prefieren los mtodos
sencillos y rpidos.
La sensibilidad del mtodo es muy importante
cuando la cantidad total de la muestra es limitada
o bien cuando la concentracin de protena en ella
sea muy baja. La especificidad del mtodo es
importante cuando se analizan muestras de
diferente naturaleza, es decir, la respuesta del
mtodo no presentar grandes variaciones
dependiendo del tipo de protena presente. De otra
manera sera necesario la realizacin de varias
curvas estndar, una para cada tipo de protena a
cuantificar. Las interferencias al mtodo son
importantes cuando se trata de muestras no muy
puras, obtenidas de medios complejos,
conteniendo concentraciones elevadas de otros
compuestos o a condiciones de pH o fuerza inica
especiales.
Todos los mtodos presentados aqu son
reproducibles y varan en la sencillez de la
deterrninacin, en la sensibilidad y en el costo.
Nosotros recomendarnos como el mej or mtodo
aquel que es lo suficientemente sensible para
detectar las concentraciones que se tienen en las
muestras, que es sencillo y rpido, y finalmente el
ms econmico.
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Tecnologa

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