LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Universidad Catlica Boliviana INGENIERA QUMICA

Docente: Alejandro Canaza Jorges Fecha de entrega: 14/03/17

Universitarios: Alejandra Pardo Pinto, Josue

Snchez Villarroel, Nataly Zuiga

Contenido
1 INTRODUCCIN ........................................................................................................... 3

1.1 CONCEPTO DE INMUNIDAD................................................................................. 3

1.2 TIPOS DE INMUNIDAD .......................................................................................... 4

1.2.1 Inmunidad natural ............................................................................................ 4

1.2.2 Inmunidad adquirida ........................................................................................ 5

1.2.3 Inmunidad artificial ........................................................................................... 5

2 MARCADORES MOLECULARES DE ENFERMEDADES ............................................. 5

2.1 Marcadores moleculares del tipo postranscripcin-traduccin ................................ 6

2.2 Marcadores moleculares del tipo pretranscripcin-traduccin ................................. 6

2.2.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphic) ............................................ 7

2.2.2 RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA) ................................................. 8

2.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .......................................... 9

2.3 Marcadores moleculares para el diagnstico temprano de la diabetes mellitus .... 10

3 TERAPIA CELULAR Y GENICA .................................................................................. 10

4 VACUNAS RECOMBINANTES.................................................................................... 12

4.1 Tipos de vacunas .................................................................................................. 13

4.1.1 Vacunas vivas o atenuadas ........................................................................... 13

4.1.2 Vacunas muertas o inactivadas ..................................................................... 13

4.1.3 Vacunas sintticas ......................................................................................... 13

4.1.4 Vacunas toxoides .......................................................................................... 13

4.1.5 Vacunas recombinantes ................................................................................ 13

5 OBTENCIN DE ANTICUERPOS MONO Y POLICLONALES .................................... 14

5.1 Obtencin de anticuerpos monoclonales .............................................................. 14

 5.2 Obtencin anticuerpos policlonales ....................................................................... 15

6 FARMACOGENMICA................................................................................................ 16

6.1 Beneficios previstos de la farmacogenmica ........................................................ 16

7 TOXICOGENMICA .................................................................................................... 17

7.1 Genmica estructural ............................................................................................ 18

7.2 Genmica funcional .............................................................................................. 19

8 HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL DIAGNSTICO ................................... 20

8.1 Diagnstico molecular en enfermedades infecciosas ............................................ 21

8.2 Tcnicas para el diagnstico molecular de enfermedades hereditarias................. 21

8.2.1 Mtodos de extraccin y purificacin del ADN y RNA .................................... 22

8.2.2 Mtodos para detectar mutaciones en el ADN ............................................... 22

8.2.3 Mtodos para detectar mutaciones en el ARN ............................................... 26

8.3 Limitaciones del diagnstico molecular ................................................................. 27

9 BIBLIOGRAFA ............................................................................................................ 27
1 INTRODUCCIN

El presente informe expondr la relacin de la biotecnologa en la medicina es decir sobre

la Biomdica. Se tocaran temas como la inmunidad, la clasificacin de estos, marcadores
moleculares y su uso en el estudio del genoma humano.

Tambin se hablara del mtodo de inmunizacin dada por la aplicacin de vacunas, las
diferencias del tipo de vacunas, la obtencin de los anticuerpos monoclonales,
policlonales y como la biotecnologa ha aportado para hacer mejoras y tengan mayor
eficiencia lo que nos lleva al estudio de la farmacognica que estudia la respuesta del
genoma en la aplicacin de los medicamentos.

As mismo la toxico genmica continuar explicando la respuesta del genoma humano

pero a diversos txicos o toxinas. Por ltimo se tratar las herramientas de diagnstico
molecular tanto mtodos clsicos como los modernos que implican la reaccin en cadena
de polimerasa o la secuenciacin de ADN, tambin se ver como los marcadores
moleculares se aplican en dichos mtodos

1. CONCEPTOS BASICOS DE INMUNOLOGIA

1.1 CONCEPTO DE INMUNIDAD

Es el conjunto de mecanismos que un individuo posee para enfrentarse a la invasin de

cualquier cuerpo extrao y para hacer frente a la aparicin de tumores. Esta cualidad se
adquiere antes del nacimiento y se madura y afianza en los primeros aos de vida. En los
vertebrados implica que los organismos diferencian lo propio de lo ajeno; es decir,
reconocen todos sus tipos celulares.

El Sistema Inmune es el responsable de conferir inmunidad. Este sistema, presente en

vertebrados, alcanza su mxima complejidad en los primates y seres humanos. La ciencia
encargada de estudiar estos procesos se denomina Inmunologa (Zarur, 2012).

El significado del trmino inmune se asocia histrica-mente a un mecanismo de

proteccin. Deriva de la palabra latina: immunis que significa: libre, exento de ciertos
oficios, obligaciones, impuestos y castigos. El trmino se extendi para aplicarlo a
personas que, despus de haber padecido una enfermedad infecciosa, como la peste o
la viruela, quedaban exentos de ataques ulteriores (Robledo, 2008).
1.2 TIPOS DE INMUNIDAD

1.2.1 Inmunidad natural

Esta inmunidad se conoce bajo el nombre de inmunidad innata o congnita. Con este tipo
de inmunidad se crea una lnea a la defensiva ante ciertos agentes patgenos, donde la
persona puede controlar estos agentes. Esta inmunidad se transmite por los genes, de
forma biolgica. Ejemplo: el moco, el cual atrapa pequeas partculas y bacterias, el reflejo
de la tos, el cido gstrico, etc. Se caracteriza por ser rpida y por desarrollarse a nivel
local (Equipo de redaccin, 2016).

Tipos de inmunidad natural

Inmunidad pasiva: Es la que se muestra de forma pasiva y dura muy poco. Suele
estar presente en el feto y en el recin nacido, ya que es suministrada por la madre
a travs de la leche y de la placenta. Esta inmunidad solo duran unos meses.
Ejemplo: el calostro de la madre (Equipo de redaccin, 2016).
Los anticuerpos no son sintetizados por el organismo hospedador, sino son
sintetizados por otro organismo e introducidos en el hospedador.

Inmunidad activa: Este tipo de inmunidad aparece tras una infeccin o una
inmunizacin activa, llegando a atacar a un agente patgeno en especfico. Esta
inmunidad suele durar mucho ms tiempo e inclusive llega a ser permanente
(Equipo de redaccin, 2016).

La inmunidad activa es la inmunidad adquirida mediante una enfermedad

determinada, ya sea por sus manifestaciones pre-clnicas, clnicas o, incluso de
naturaleza inaparente (sin manifestaciones); tambin puede clasificarse como
activa artificial cuando se obtiene mediante la aplicacin de vacunas (Jimnez,
2014).

Clulas que intervienen en la inmunidad natural

Fagocitos: Estas clulas fagocitan a los agentes infecciosos que llega a traspasar
las superficies epiteliales. Estos microorganismos son rodeados, engullidos y luego
digeridos por las clulas. Asesinas naturales: se presenta como un tipo de leucocito
que ante presencia de un virus se activa, al igual ocurre cuando se activan citocinas.
Tienen como funcin detectar y lisar las clulas que han sido infectadas por ciertos
virus, o a las clulas cancergenas (Equipo de redaccin, 2016).
1.2.2 Inmunidad adquirida

Es el tipo de inmunidad que poseen los animales vertebrados mandibulados. Esta

inmunidad luego de enfrentarse ante agentes patgenos evita que el organismo sea
afectado nuevamente por una segunda infeccin de este tipo, ya que posee una memoria
inmunolgica que le permite dar respuesta ante patgenos con una mayor rapidez. Esta
inmunidad dura mucho ms tiempo para responder ante patgenos que las inmunidad
natural. Caractersticas Al tener memoria ofrece respuestas ms energticas.
Especificidad, donde se crean reacciones distintas por diversas sustancias. Pueden volver
a su estado de reposo. Son tolerantes, por lo cual no atacan al propio organismo. Logran
responden ante una gran diversidad de anticuerpos. Esta se encarga de dar respuestas
ante patgenos de una forma puntual. Las respuestas en este tipo de inmunidad suelen
suceder en un tiempo prolongado, durando hasta das. Esta inmunidad tiene la capacidad
de volver a su estado de reposo, lo cual se conoce como homeostasis. Tipos de inmunidad
adquirida Inmunidad humoral: constituida por anticuerpos de la sangre que se enfrentan
ante los antgenos. Inmunidad celular: compuesta por linfocitos T que se enfrentan a los
microorganismos intracelulares (Equipo de redaccin, 2016).

1.2.3 Inmunidad artificial

Se trata de la inmunidad que logra conseguir un ser vivo tras el uso de ciertos tratamientos
o de terapia (Equipo de redaccin, 2016).

Tipos de inmunidad artificial

Inmunidad activa: Este tipo de inmunidad hace que el organismo cree anticuerpos que
logren combatir los agentes patgenos. Ejemplo de ello son las vacunas, las cuales
ofrecen sustancias con larga prolongacin o que estimulan al organismo de por vida,
siendo la misma un excelente procedimiento preventivo (Equipo de redaccin, 2016).

Inmunidad pasiva: Es el tipo de inmunidad que consigue el organismo por medio de la

sueroterapia, ya que a travs de un donante inmune ofrece suero sanguneo, el cual
ayuda a combatir los agentes cuando la respuesta inmunitaria activa no logra frenarlo
(Equipo de redaccin, 2016).

2 MARCADORES MOLECULARES DE ENFERMEDADES

Son segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el
anlisis del genoma. En 1996, Ferreira y Grattapaglia amplan el concepto definiendo los
marcadores moleculares como cualquier fenotipo molecular originado de la expresin de
un gen o un segmento especfico de ADN (Diaz, 2012).
 Tipos de Marcadores

Existen dos grandes clases de marcadores moleculares:

Los marcadores de postranscripcin-traduccin, que son aquellos determinados

por anlisis indirecto del DNA.
Los marcadores del tipo pretranscripcin-traduccin, que han revolucionado la
gentica vegetal a partir de la introduccin de novedosas tecnologas que
permiten el anlisis directo del DNA.

2.1 Marcadores moleculares del tipo postranscripcin-traduccin

Entre los marcadores moleculares del tipo postranscripcin-traduccin se encuentran las

isoenzimas; as se definen las mltiples formas moleculares de una misma enzima que
existen en una especie.

Brown y Moran (ao?), describen la tcnica isoenzimtica como el mejor mtodo corriente
para medir variaciones genticas cercanas al nivel del DNA, relativamente libres de
efectos ambientales y sobre un nmero de muestras manipulables.

La poca cantidad de tejido que se requiere para la elaboracin del ensayo, su

relativamente rpida ejecucin, el bajo costo del ensayo y la moderada facilidad para
obtener y analizar resultados, cuentan entre las principales ventajas de este marcador.

Los perfiles electroforticos se han empleado para varios sistemas enzimticos en la

clasificacin de especies y variedades, y han contribuido significativamente en diversos
aspectos del mejoramiento. Sin embargo, estos marcadores presentan algunas
limitaciones en particular cuando se requiere una cobertura ms amplia del genoma,
debido a la escasa disponibilidad de marcadores en el mismo y el bajo nmero de alelos
por locus. Adems de forma general, la especificidad de las formas isoenzimticas en
algunos tejidos vegetales, la influencia sobre la actividad enzimtica de las condiciones
ambientales y los diferentes estadios del desarrollo vegetal, cuentan entre sus
desventajas (Gomez, 2011).

2.2 Marcadores moleculares del tipo pretranscripcin-traduccin

Los marcadores moleculares de tipo ADN, son aquellos capaces de detectar el

polimorfismo gentico directamente a nivel de DNA. En este grupo se encuentran los
RFLP (Fragmentos Polimrficos de Restriccin), RAPD (DNA Polimrfico Amplificado al
Azar), AFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados), entre otros y
ocupan un peldao superior en la escala evolutiva de los marcadores genticos, por las
 nuevas perspectivas que brindan para identificar y mapear genes tiles, que pueden ser
posteriormente incorporados y expresados en el genoma vegetal (Mackenna, 2008).
2.2.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphic)

Se entiende por RFLP el polimorfismo de los fragmentos de restriccin, obtenidos por el

corte con una endonucleasa en la cadena doble del ADN, acoplado en el caso de ADN
genmico eucaritico, por hibridacin con sondas de secuencias homlogas de copia
nica (Diaz, 2012).
El empleo de los RFLP permite detectar variaciones producidas por procesos como las
deleciones, inserciones, o alteraciones en la secuencia diana de las endonucleasas de
restriccin (siendo esta su base gentica), tanto en poblaciones de la misma especie
como entre diferentes especies, lo cual resulta ventajoso atendiendo a que muy pocas
variaciones son expresadas en el fenotipo, mientras que muchas otras resultan silentes.
Se pueden distinguir dos campos principales de aplicacin de los RFLP en el
mejoramiento de las plantas. El primero est basado en la utilizacin de los mismos como
marcador gentico para determinar las relaciones genticas, incluyendo aspectos
esenciales como su uso en la identificacin de variedades, la proteccin de los derechos
del mejorador y las determinaciones de parentesco. La segunda rea de aplicacin, est
basada en el uso de stos como marcadores genticos para identificar y mapear
particularmente aquellos genes involucrados directamente en la determinacin de
caracteres cuantitativos, y el monitoreo de estos loci durante los programas de
introgresin y seleccin (Diaz, 2012).

El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado

usando la tcnica molecular Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR, luego tratado
con enzimas de restriccin especficas para producir fragmentos de ADN de diferentes
longitudes. Estas enzimas de restriccin hacen un proceso de digestin restrictiva en el
cual reconocen cortas secuencias especficas en el ADN donde cortan formando
fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restriccin se separan mediante
electroforesis en geles de agarosa a travs del cual corren debido a un campo elctrico
y su disociacin obedece a la masa o a la carga elctrica de las muestras segn la tcnica
utilizada. Esto proporciona un patrn de bandas que es nico para un ADN en particular
debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de
restriccin varan. Por tanto, se trata de un tcnica codominante ya que nos permite
distinguir individuos homocigotos de aquellos heterocigotos, es decir, nos permite
observar cada uno de los alelos que estudiamos. En el gel podemos observar que hay
 dos alelos de distinto tamao, y nos permite distinguir entre ambos individuos. Las
bandas pueden ser transferidas por Southern Blot a una membrana donde se hibridan
con una sonda que permite determinar la longitud y la separacin de los fragmentos. En
este paso las cadenas de ADN tienen que estar desnaturalizadas, es decir, en forma de
cadena sencilla para permitir la hibridacin con las sondas especficas. Las
endonucleasas de restriccin en su mayora cortan el ADN de cadena doble en
secuencias especficas y cada enzima reconoce un sitio en particular (Ramos, 2005).

2.2.2 RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA)

En 1990 dos grupos de investigadores desarrollaron prcticamente al unsono una

tecnologa basada en la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). En
esencia la idea consisti en utilizar un cebador corto y de secuencia arbitraria, que elimina
la necesidad de conocimiento previo de la secuencia. Estos dos grupos denominaron de
forma diferente esta tcnica: AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction o
reaccin de la polimerasa con cebadores arbitrarios) y RAPD (Ramdom Amplified
Polymorphic DNA o ADN polimrfico amplificado al azar) desarrollada por Williams y
colaboradores) (Ramos, 2005).
El polimorfismo gentico detectado con este marcador es binario lo que hace que la
naturaleza de la tcnica RAPD sea dominante, los individuos heterocigticos no pueden
ser diferenciadas directamente de los homocigticos, esta caracterstica constituye una
de sus principales limitaciones determinando un bajo contenido de informacin gentica
por locus. Sin embargo, las evidencias existentes, indican que los loci de los marcadores
RAPD estn distribuidos al azar a lo largo del genoma, lo que permite detectar una gran
cantidad de polimorfismo, incluso en regiones de DNA repetitivo.

Se usa una coleccin de decanucletidos para amplificar por PCR reas especficas
distribudas al azar por el genoma. Su pequeez y la baja temperatura de alineamiento
(36C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de
agarosa para obtener perfiles electroforticos que variarn segn el polimorfismo de los
distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarn una huella dactilar
caracterstica. Es muy cmoda, rpida, requiere poco DNA que adems no necesita estar
muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir
rpida y simultneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algn carcter, sino
 redundante, y que no da informacin sobre el nmero de copias que el DNA genmico
contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnologa ha sido utilizada para la
catalogacin de frutos, seleccin de variedades, y diferenciacin de lneas clonales.
Tambin se est utilizando para el anlisis de las variedades de apio, uva, limn y olivo
(Diaz, 2012).

2.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

La tcnica del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, se considera una

tcnica intermedia entre RFLP y RAPD, pues involucra una digestin del DNA con
enzimas de restriccin y la amplificacin de los fragmentos generados mediante un PCR
especfico. Los productos amplificados son usualmente separados sobre un gel de
secuenciacin y pueden ser revelados despus por radiografa o fluorescencia. El
polimorfismo creado ser el resultado de cambios en los sitios de corte de las
endonucleasas y de la variacin en nmero y longitud del amplicon seleccionado para la
amplificacin de los distintos segmento (Ramos, 2005).
Estos marcadores han encontrado un amplio uso en muchas aplicaciones de la biologa
molecular, especialmente en plantas, destacndose por la alta identificacin de genotipos
y evaluacin del germoplasma que permite.

Se usa una coleccin de decanucletidos para amplificar por PCR reas especficas
distribudas al azar por el genoma. Su pequeez y la baja temperatura de alineamiento
(36C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de
agarosa para obtener perfiles electroforticos que variarn segn el polimorfismo de los
distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarn una huella dactilar
caracterstica. Es muy cmoda, rpida, requiere poco DNA que adems no necesita estar
muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir
rpida y simultneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algn carcter, sino
redundante, y que no da informacin sobre el nmero de copias que el DNA genmico
contiene de la secuencia amplificada y olivo (Diaz, 2012).
2.3 Marcadores moleculares para el diagnstico temprano de la diabetes mellitus

La Diabetes Tipo 2 (DT2) pertenecea un grupo de alteraciones metablicas de carcter

heterogneo con grado variable de predisposicin hereditaria y participacin de diversos
factoresambientales. La DT2 se caracterizapor hiperglucemia persistente debida a la
resistencia a la accin de la insulina o por la deficiencia en la produccin de la misma,
afectando el metabolismo de los carbohidratos, protenas y grasas. La DT2 tiene un origen
complejo y multifactorial, asocindose principalmente con obesidad, concentracin elevada
de triacilgliceroles, baja concentracin de colesterol HDL y resistencia a la accin de la
insulina.

La participacin de factores genticos relacionados con la susceptibilidad a padecer la DT2,

se asocian fuertemente cuando existen antecedentes heredo-familiares de diabetes (Cruz,
2005).

Herramientas moleculares como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido

discernir los genes y sus variantes relacionados a la diabetes. estudios previos has
demostrado que los genes capn10 y ppr juegan un papel importante para el desarrollo de
la diabetes y en consecuencia pudieran ser genes candidatos para utilizarlos como
diagnstico molecular y proveer as la deteccin oportuna de esta enfermedad para evitar
complicaciones de la Diabetes como retinopatas, dao renal, daos en el SNC, entre otros
(Gomez, 2011).

3 TERAPIA CELULAR Y GENICA

Terapia celular: es una estrategia basada en el empleo de clulas como instrumentos

teraputicos. Su potencial, ya explorado desde hace dcadas con los trasplantes de
mdula sea para el tratamiento de enfermedades hematolgicas, se ha visto ampliado
con el descubrimiento y caracterizacin de clulas madre en otros tejidos del organismo,
denominadas clulas madre adultas . Las controversias ticas derivadas del empleo de
clulas madre embrionarias, se ha visto desbancado con el descubrimiento en la pasada
dcada de la reprogramacin como estrategia para disponer de clulas con potencial de
diferenciacin a casi cualquier tejido a partir de clulas adultas.
Cualquiera de estas estrategias permite su empleo en diferente extensin en medicina
reparadora, y regenerativa: transferir clulas funciones a tejidos de pacientes con
deficiencias funcionales que conducen a patologas concretas. La posibilidad de modificar
genticamente estas clulas (Terapia Gnica) para corregir sus deficiencias justifica la
difcil separacin de ambas estrategias teraputicas con un futuro cargado de expectacin
(Perez, 2016).

Terapia Gnica: Se puede definir como la transferencia de material gentico en un

individuo con finalidad teraputica, mientras que la terapia celular busca el mismo fin
administrando clulas. Ambas disciplinas pueden estar ntimamente asociadas. ste es
el caso del uso teraputico de clulas modificadas genticamente (Perez, 2016).

El material gentico que se utiliza en el campo de la terapia gnica puede ser de muy
diferentes tipos:

Es muy comn que se trate de ADN codificante de una protena, en cuyo caso es
necesario que llegue al ncleo de las clulas para dar lugar a un ARN mensajero
que posteriormente mediar la produccin de la protena teraputica (Perez,
2016).

El efecto teraputico tambin puede conseguirse inhibiendo la expresin de genes

endgenos responsables de una patologa. Esto se puede conseguir transfiriendo
ARN de interferencia o distintos tipos de oligonucletidos anti sentido (Perez,
2016).

En una aplicacin concreta de la terapia gnica se plantea la correccin de los

genes defectuosos en lugar de aportar copias adicionales que restauren su
funcin (Perez, 2016).

La introduccin del material gentico puede llevarse a cabo directamente en el individuo,

o puede realizarse en clulas aisladas que posteriormente son administradas en el
organismo. Por tanto, esta ltima modalidad se puede considerar tambin terapia celular.
El material gentico como tal tiene dificultades para penetrar en las clulas, y por eso
necesita unos vehculos que facilitan su introduccin.

Tambin se puede forzar la entrada en la clula utilizando mtodos fsicos como la

electroporacin o el bombardeo con partculas metlicas.
Las posibles aplicaciones de la terapia gnica son muy amplias. Siempre que se haya
identificado un gen como responsable de una enfermedad, ste se convierte en una diana
para la terapia gnica. Pero en otros muchos casos de enfermedades con origen
 multifactorial la transferencia gnica puede lograr efectos teraputicos. De hecho,
actualmente se llevan a cabo ensayos en pacientes con cncer, enfermedades
infecciosas, cardiovasculares, etc (Perez, 2016).

La terapia celular: Es una estrategia basada en el empleo de clulas como instrumentos

teraputicos. Su potencial, ya explorado desde hace dcadas con los trasplantes de
mdula sea para el tratamiento de enfermedades hematolgicas, se ha visto ampliado
con el descubrimiento y caracterizacin de clulas madre en otros tejidos del organismo,
denominadas clulas madre adultas . Las controversias ticas derivadas del empleo de
clulas madre embrionarias, se ha visto desbancado con el descubrimiento en la pasada
dcada de la reprogramacin como estrategia para disponer de clulas con potencial de
diferenciacin a casi cualquier tejido a partir de clulas adultas.
Cualquiera de estas estrategias permite su empleo en diferente extensin en medicina
reparadora, y regenerativa: transferir clulas funciones a tejidos de pacientes con
deficiencias funcionales que conducen a patologas concretas. La posibilidad de modificar
genticamente estas clulas (Terapia Gnica) para corregir sus deficiencias justifica la
difcil separacin de ambas estrategias teraputicas con un futuro cargado de expectacin
(Perez, 2016).

4 VACUNAS RECOMBINANTES

Una vacuna es un mtodo para crear inmunizacin o una respuesta inmunolgica que
proteja al cuerpo humano de agentes extraos tambin llamados antgenos, esta es
una inmunizacin pasiva. Una vacuna consiste en introducir el agente que causa la
enfermedad pero en un estado que no es patognico. La vacunacin dar como
resultado la produccin de anticuerpos especficos, dirigidos contra el agente
infeccioso.
Para la fabricacin de una vacuna hay tres pasos importantes: generacin de un
antgeno, que consiste en cultivar una bacteria o un virus, este paso e encarga de
que el virus pierda la capacidad de reproduccin pero aun as puede causar la
enfermedad. Luego est el aislamiento del antgeno, que consiste en separarlo del
medio en que se lo cultivo y por ltimo se aaden otros componentes a la vacuna para
que est listo para su uso, estos componentes pueden ser estabilizadores,
conservantes.
4.1 Tipos de vacunas

4.1.1 Vacunas vivas o atenuadas

Son aquellas que contienen a los microbios vivos que han sido debilitados en el laboratorio
para que no puedan causar la enfermedad. Dado que la vacuna viva atenuada es lo ms
parecido a una infeccin natural, estas vacunas son bastante efectivas. Provocan respuestas
celulares y de anticuerpos fuertes que son de muy larga duracin e intensas. Entre las
vacunas ms conocidas de este tipo se encuentran: Varicela, Fiebre amarilla, Polio oral,
Sarampin, Rubola

4.1.2 Vacunas muertas o inactivadas

Se componen de microorganismos inactivados, incapaces de reproducirse, a travs de

qumicos, calor o radiacin y por ello estos microorganismos son incapaces de producir la
enfermedad en el paciente. La respuesta inmunitaria es de menor intensidad y duracin que
con las vacunas vivas pero ya que son menos fuertes que las vacunas vivas son ms seguras
y de ms fcil fabricacin.

Las vacunas inactivadas son: rabia, Gripe, Hepatitis A, Encefalitis japonesa.

4.1.3 Vacunas sintticas

Compuestas por polipptidos que copian la secuencia primaria de aminocidos de los

determinantes antignicos con capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora.
Uno de sus principales obstculos es la escasa inmunogenicidad de estos pptidos sintticos.

4.1.4 Vacunas toxoides

Contienen una toxina o qumico producido por la bacteria o virus. Estas vacunas hacen que
la persona que las recibe sea inmune a los efectos dainos de la infeccin en lugar de a la
infeccin en s. Pueden considerarse como vacunas muertas o inactivas, pero a veces reciben
su propia categora para resaltar el hecho de que contienen una toxina inactiva. Existen dos
vacunas muy conocidas de las toxoides y estas son las que protegen contra el ttanos y la
difteria.

4.1.5 Vacunas recombinantes

Se entiende como vacuna recombinante a aquellas que son obtenidas utilizando la tecnologa
del ADN recombinante en alguna etapa de produccin. Presentan la misma eficacia de
vacunas vivas convencionales y la seguridad de vacunas inactivadas convencionales. Su
elaboracin se realiza a partir de la clonacin de genes codificados para una protena
antignica especfica en una clula husped recombinante. (Berdasquera Corcho D.; Cruz
Martnez G.; Surez Larreinaga, C., 2000)
Se requiere la identificacin previa del gen, su insercin en un vector (plsmido o clula Viva)
e introduccin del complejo gen-vector en la clula husped. Posteriormente, la protena
expresada en esta clula se extrae y se purifica.

Se emplea tecnologa gentica para transferir genes de diferentes patgenos en organismos

de fcil crecimiento como bacterias. De ello deriva el nombre de recombinantes, por la
combinacin de genes de dos organismos diferentes.

Estas vacunas atacan directamente el material gentico del microbio en lugar de hacerlo en
todo el organismo y sus partes

La vacuna de ADN no podra transmitir la enfermedad porque no contiene el microbio, sino

solo copias de algunos de sus genes

Los tipos de vacunas recombinantes incluye aquellas que utilizan virus o bacterias como
vectores (se incorpora el gen de inters en el genoma de un microorganismo atenuado), las
de DNA desnudo (plsmidos de DNA que contienen el gen de inters y cuya expresin ocurre
dentro de la clula receptora) y las comestibles (producidas a partir de plantas modificadas
genticamente).( Berdasquera Corcho D.; Cruz Martnez G.; Surez Larreinaga, C., 2000)

Los vectores ms utilizados en este tipo de vacunas son el virus vaccinia, algunas bacterias
lcticas de los gneros Lactobacillus y Lactococcus y variedades atenuadas de M.
tuberculosis y Salmonella typhi.

5 OBTENCIN DE ANTICUERPOS MONO Y POLICLONALES

5.1 Obtencin de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales, son anticuerpos idnticos porque son producidos por un solo
tipo de clula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una sola clula
madre. Los responsables de esta produccin son los linfocitos B

Se inyecta en ratones el antgeno, aun cuando no est puro. Luego de un perodo de espera
que permite un aumento de los linfocitos B especficos, se sacrifica el ratn y se extrae el
bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se
mezclan con clulas mielomatosas (clulas de un tumor de linfocitos), agregando adems
poli etilenglicol, un agente que facilita la fusin. Con esto se consigue que algunas clulas
mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma.
Se logra as una clula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos,
con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la clula mielomatosa. Los hibridomas
son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas
colonias (Fernando Mnckeberg, 1988).
La etapa final, es separar los distintos hibridomas
resultantes, con el fin de obtener una poblacin
proveniente de una sola clula (clon). Para ello,
las clulas se diluyen hasta lograr que una clula
quede en un micro pocillo de cultivo. El
anticuerpo producido por esta clula y sus
progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclonal.
De all en adelante estas clulas se pueden
guardar congeladas o cultivar y multiplicar por
siempre( Fernando Mnckeberg, 1988).(ver
cuadro adjunto)

Figura 1:Produccin de anticuerpos monoclonales

5.2 Obtencin anticuerpos policlonales

Se inyecta un conjugado antgeno o adyuvante en un animal de eleccin para iniciar una

respuesta inmune amplificada. Despus de una serie de inyecciones durante un periodo de
tiempo especfico, se espera que el animal cree anticuerpos contra el conjugado. Luego se
extrae sangre del animal y despus se purifica para obtener el anticuerpo de inters.

La inoculacin se realiza en un mamfero adecuado, tal como un ratn, conejo o cabra. A

menudo se prefieren mamferos mayores, ya que la cantidad de suero que se puede recoger
es mayor. Se inyecta un antgeno en el mamfero. Esto induce a los linfocitos B a producir
inmunoglobulinas IgG especficas para el antgeno. Esta IgG policlonales se purifica a partir
del suero del mamfero (Wikipedia, Polyclonal antibodies, s.f.).

Existen muchas metodologas para la produccin de anticuerpos policlonales en animales de

laboratorio. Las directrices institucionales que rigen el uso de los animales y los
procedimientos relativos a estas metodologas se orientan generalmente hacia
consideraciones humanas y conducta apropiada para los adyuvantes (agentes que modifican
el efecto de otros agentes mientras que tienen pocos o ningn efecto directo cuando se
administran por s mismos). Esto incluye la seleccin adyuvante, rutas y sitios de
administracin, volmenes de inyeccin por sitio y nmero de sitios por animal. Las polticas
institucionales generalmente incluyen volmenes de sangre permitidos por coleccin y
precauciones de seguridad incluyendo restriccin apropiada y sedacin o anestesia de
animales para la prevencin de lesiones a animales o personal (Wikipedia, Polyclonal
antibodies, s.f.).

El objetivo principal de la produccin de anticuerpos en animales de laboratorio es obtener

antisueros de alta afinidad para su uso en experimentos o pruebas de diagnstico. Los
adyuvantes se usan para mejorar o mejorar una respuesta inmune a los antgenos. La
mayora de los adyuvantes proporcionan un sitio de inyeccin, depsito de antgeno que
permite una liberacin lenta de antgeno en los ganglios linfticos drenantes (Wikipedia,
Polyclonal antibodies, s.f.).

El uso de anticuerpos policlonales (PAbs) sobre anticuerpos monoclonales tiene sus ventajas.
Las habilidades tcnicas necesarias para producir anticuerpos policlonales no son tan
exigentes. Son baratos de hacer y pueden ser generados con bastante rapidez, tardando
varios meses en producir. Los PAbs son heterogneos, lo que les permite unirse a una amplia
gama de eptopos antignicos. Debido a que los PAbs se producen a partir de un gran nmero
de clones de clulas B, es ms probable que se unan con xito a un antgeno especfico
(Wikipedia, Polyclonal antibodies, s.f.).

6 FARMACOGENMICA

La Farmacogenmica es el trmino que se utiliza para describir al estudio de la contribucin

de las diferencias en los genes de un individuo a la variacin en las respuestas a los
medicamentos entre la poblacin (Funes, 2013).

Tales diferencias en los genes tienen que ver con la produccin de protenas especficas que
participan en los distintos procesos del paso de los medicamentos por el organismo, desde
su absorcin, su acceso al torrente sanguneo, su distribucin en los tejidos donde se busca
que tengan su efecto teraputico, su desintegracin y su posterior eliminacin del cuerpo
(Funes, 2013).

6.1 Beneficios previstos de la farmacogenmica

Frmacos ms potentes. Las compaas farmacuticas sern capaces de producir

terapias ms precisas contra enfermedades especficas, maximizando los efectos
teraputicos y minimizando la lesin a las clulas vecinas sanas (Gimnez, 2007).

Frmacos mejores y ms seguros, desde la primera toma. El tiempo de

recuperacin de la enfermedad se acortar y la seguridad ser mayor, puesto que la
 probabilidad de efectos secundarios disminuir o desaparecer por
completo (Gimnez, 2007).

Mtodos ms precisos para la determinacin de la dosis apropiada. Los mtodos

actuales de determinacin de dosis segn el peso y la edad sern reemplazados por
dosificaciones basadas en la gentica de la persona: la forma en que su cuerpo
metaboliza el frmaco y el tiempo que tarda en metabolizarlo (Gimnez, 2007).

Vacunas mejores. Las vacunas hechas de material gentico, sea ADN o ARN,
prometen los beneficios de las vacunas ya existentes sin ninguno de sus riesgos.
Tericamente podran activar el sistema inmunitario pero seran incapaces de causar
infecciones (Gimnez, 2007).

7 TOXICOGENMICA

Es interesante notar que slo el 0.1% de todas las pares de bases del DNA que forman
el genoma humano varan entre los individuos; al mismo tiempo se debe aceptar que este
bajo porcentaje tiene efectos muy importantes para explicar las muchas diferencias que
existen entre todos nosotros. Este hecho llega a su extremo con las enfermedades
hereditarias, donde muy pequeos cambios pueden dar lugar a muerte prematura o
deficiencias muy importantes (VERICAT, s.f.).

La genmica emergi hace ms de una dcada concurrentemente con la secuenciacin

del genoma humano. La identificacin de la secuencia del DNA es muy poco til si no se
sabe nada sobre la funcin de los genes y de su regulacin. Consideremos que cualquier
organismo superior est formado por muchos tipos celulares diferentes, cada uno con
funciones diferentes e integrados en un sistema de complejidad mucho superior a lo que
representara una mezcla desorganizada de los mismos tipos celulares. Si bien cada
clula contiene los mismos genes, su expresin diferencial da lugar a la diversidad
necesaria para dar lugar a esa complejidad tan impresionante, y que crece desde el tejido,
al rgano, para llegar al organismo. En cada nivel de complejidad, la transcripcin de los
genes y la traduccin a protenas da lugar a la funcin propia de la estructura determinada
(funcin de un tejido, funcin de un rgano). El mantenimiento de esta especializacin se
mantiene de una forma muy controlada, con el objetivo de evitar la prdida de la funcin.
Los sistemas biolgicos aplicados en toxicologa se denominan sistemas toxicolgicos,
los cuales se pueden definir como el estudio de las interacciones de todos los elementos
en un sistema biolgico determinado, bajo estrs o perturbacin txica, para alcanzar el
entendimiento mecanstico de la respuesta txica. Con el objetivo de entender todos los
 elementos que cambian posterior a la exposicin de un txico se realizan anlisis
integrales de todas las tecnologas toxicogenmicas por ejemplo trascriptmica (perfil de
expresin gentica), protemica, y metabolmica en combinacin con las medidas de
toxicidad tradicionales. Cada sustancia generar una serie de datos de expresin de
genes que funciona como una firma y que puede emplearse para identificar
biomarcadores especficos que permitan evaluar el riesgo y predecir efectos txicos de
nuevas frmacos en desarrollo (VERICAT, s.f.).

Sin tener en cuenta la expresin de genes, est completamente aceptado que los
mecanismos de accin son muy complejos y tienen ms efectos que los simples cambios
en algunas macromolculas intracelulares. Muchos compuestos txicos afectan la
actividad enzimtica, la integridad del DNA y de las membranas, el potencial redox, as
como muchos otros procesos complejos (Cap M. A.; Frejo M T, 2007).

Desde la secuenciacin del genoma humano hemos asistido a la aparicin de las

denominadas ciencias omicas impulsadas por los recientes avances en el proyecto del
genoma humano y los desarrollos tecnolgicos asociados. La genmica consiste en la
caracterizacin molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la
secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de
desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, as como de los mecanismos
implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica (Cap M. A.; Frejo M T,
2007).

La Toxicogenmica usa las metodologas e informacin de la ciencia genmica y de la

informtica para mejorar nuestra comprensin sobre las bases biolgicas de las
respuestas a los agentes txicos, por lo tanto, es una disciplina que nos permite entender
por ejemplo, el rol de las interacciones entre genes y medio ambiente en el desarrollo de
las enfermedades (Cap M. A.; Frejo M T, 2007).

La genmica se divide en dos grandes reas: Genmica estructural y genmica funcional

7.1 Genmica estructural

Se ocupa de la caracterizacin fsica de genomas enteros, es decir, descifrar el nmero,

orden y secuencia de los pilares (nucletidos) de la molcula de ADN. Cuando esta
secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades:

- Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y

comprender el papel de dichas secuencias.
- Realizar predicciones acerca de todas las protenas codificadas por una especie.
 - Establecer las variaciones genticas entre distintas poblaciones de una misma
especie.
- Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos.

Catalogar las variaciones genticas entre individuos ayudar a identificar aquellos

cambios que conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y
establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores (Cap M. A.; Frejo M T,
2007).

7.2 Genmica funcional

Consiste en la recoleccin sistemtica de informacin sobre la funcin de los genes,

mediante la aplicacin de aproximaciones experimentales globales que evalen la funcin
de los genes haciendo uso de la informacin y elementos de la genmica estructural.

Dentro de la genmica funcional existen varios campos de investigacin:

Transcriptmica: Puede definirse como la genmica funcional a nivel de la transcripcin,

es decir a nivel de la formacin del ARN mensajero a partir del ADN. Las tcnicas que
utilizan fundamentalmente son el microarray o microplataformas de ADN, que permite el
anlisis simultneo de miles de genes. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos
de hibridacin con muestras marcadas radiactivamente o con fluor- foro apropiados y los
resultados se cuantifican mediante anlisis con microscopia confocal.

Proteonmica: Se define como la parte de la genmica funcional que se ocupa del estudio
del conjunto total de protenas expresadas por un genoma completo, incluyendo las
modificadas despus de la traduccin. El mtodo mas utilizado para estudiar la
abundancia de protenas es la electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida.

Metabolmica: : Con este trmino denominamos al conjunto total de metabolitos de una

clula, consecuencia de la funcin de ARNm y protenas. Permite identificar metabolitos
en la clula y determinar perfiles de abundancia en relacin a los estudios del
trasnscriptoma y el proteoma (Cap M. A.; Frejo M T, 2007).

La tecnologa toxicogenmica nos da la posibilidad de analizar miles de genes

simultneamente de un organismo expuesto a agentes txicos o con un padecimiento
definido, para la bsqueda de:

a) Genes de susceptibilidad al dao

b) Deteccin de patrones y mecanismos de toxicidad.

c) Determinar molculas endgenas susceptibles al ataque de agentes txicos.

 d) Perfiles especficos de expresin de genes que resulten en la generacin de
biomarcadores de exposicin y de riesgo.

e) Biomarcadores de efecto temprano, que identifiquen el desarrollo precoz de una

enfermedad antes de que sean evidentes cambios clnicos tpicos, identificando adems,
factores de susceptibilidad que influyen en la respuesta individual frente a las distintas
exposiciones txicas, as como las diferencias tnicas de susceptibilidad (Cap M. A.;
Frejo M T, 2007).

8 HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL DIAGNSTICO

El concepto de diagnstico molecular es un trmino amplio que incluye tcnicas de

biologa molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando
secuencias genticas especficas de cido desoxirribonucleico (ADN), cido ribonucleico
(ARN) o protenas. Inicialmente, el concepto de Biologa Molecular se aplic a los
trabajos realizados sobre el ADN. Esta molcula, descubierta por el bilogo y mdico
suizo Johan Friedrich Miescher en el ao 1869, captur la atencin de la comunidad
cientfica, luego que los investigadores James D. Watson, Francis Crick y Rosalind
Franklin descubrieran la estructura del ADN en el ao 1953 (Watson y Crick, 1953). Este
descubrimiento abri un nuevo horizonte para futuras generaciones en diferentes reas
de la ciencia, incluida la investigacin biomdica (Farfn, 2015).

El campo del diagnstico molecular ha tenido un sostenido crecimiento en los ltimos

aos, sobre el 12% anual, esperando que para el 2017 alcance un mercado por sobre los
US$60 billones. En la actualidad, el diagnstico molecular se ha enfocado principalmente
en el diagnstico de enfermedades infecciosas (50-60%), sin embargo, existe un aumento
progresivo de tcnicas moleculares en el rea de cncer y enfermedades genticas,
convirtiendo al diagnstico molecular en una de las reas de diagnstico de mayor
dinamismo y crecimiento, revolucionando las estrategias para el tratamiento de diversas
patologas y condiciones de salud, ofreciendo tcnicas con altos estndares de calidad
que entregan al equipo clnico informacin crtica para el cuidado de los pacientes (Farfn,
2015).

En el caso del diagnstico molecular, la deteccin de segmentos de ADN en una muestra

problema fue la primera estrategia utilizada en clnica. Mediante tcnicas de hibridacin
de Southern blot, utilizando fragmentos de ADN denominadas sondas, fue posible
detectar la presencia de una regin de ADN que contena una secuencia complementaria
a la sonda en una muestra problema. Posteriormente, la utilizacin de enzimas de
restriccin, tijeras moleculares que cortan el ADN en regiones especficas, junto con el
 desarrollo de mtodos de secuenciacin simples, ampli el nmero de tcnicas
disponibles para su uso en clnica (Farfn, 2015).

La reaccin de la polimerasa en cadena (RPC), quizs el mayor aporte en la era del

diagnstico molecular. De forma general, esta tcnica permite la amplificacin de una
regin especfica de ADN utilizando partidores o secuencias de ADN que delimitan la zona
de amplificacin. A partir de una copia de la regin a amplificar se obtienen millones de
copias, lo que permite su deteccin y de esta forma se evidencia la presencia de la regin
de ADN en una muestra determinada. Dada la naturaleza de la tcnica, la alta
especificidad de la RPC viene dada por la hibridacin de los partidores complementarios
a la secuencia blanco y su elevada sensibilidad a la baja cantidad de ADN que requiere
para iniciar la amplificacin. (Farfn, 2015)

8.1 Diagnstico molecular en enfermedades infecciosas

Las enfermedades infecciosas se han transformado en la punta de lanza para el

desarrollo de test de diagnstico molecular, siendo ms del 50% de las tcnicas
disponibles hoy en da. La principal explicacin a este desarrollo se debe a la dificultad de
detectar un patgeno mediante la microbiologa clsica. Los largos periodos de
crecimiento, las condiciones de cultivo y la obtencin de una muestra adecuada son los
mayores factores que afectan el diagnstico microbiolgico tradicional. Considerando que
las tcnicas de biologa molecular se basan en la deteccin de segmentos de ADN, no es
necesaria la presencia de un microorganismo viable en la muestra, sino que solo su
material gentico. Los altos valores de sensibilidad de especificidad de la tcnicas de
diagnstico molecular, junto con lo rapidez con la que se pueden obtener los resultados
las han transformado en las tcnicas de eleccin para el diagnstico de enfermedades
infecciosas y en muchos casos se consideran los estndares de oro (gold standard) para
el diagnstico de patologas infecciosas, sobre todo en infecciones virales, desplazando
al cultivo como mtodo de referencia. Esta situacin ha llevado a desarrollar tcnicas que
presenten certificaciones que entregan al equipo clnico seguridad en la calidad de los
resultados, ya que en muchos casos estas tcnicas definirn el manejo del paciente.
Muchas de las tcnicas disponibles han evolucionado desde test de uso exclusivo para
investigacin (RUO: research use only) a productos para el diagnstico in vivo (IVD: in
vitro diagnosis) con certificacin de la comunidad europea (marcados como CE) y la Food
and Drug Administration (FDA) en EEUU (marcados como FDA-cleared). (Farfn, 2015)

8.2 Tcnicas para el diagnstico molecular de enfermedades hereditarias

Como se puede ver en la siguiente figura, hay un gran nmero de enfermedades que
pueden ser diagnosticadas con herramientas moleculares.
 Figura 2: Diagnstico de enfermedades hereditarias

8.2.1 Mtodos de extraccin y purificacin del ADN y RNA

Mediante distintas tcnicas se puede purificar, con relativa facilidad, el DNA o RNA de
diversas muestras biolgicas, entre ellas la sangre de nuestros pacientes. De entre los
distintos mtodos a utilizar, el ms sencillo, rpido y limpio es el uso de columnas que
capturan de forma especfica el cido nucleico de inters para nuestro estudio. Para ello
se procede a la lisis controlada de las clulas sanguneas nucleadas (linfocitos) con el fin
de liberar el contenido celular al medio. Seguidamente, los extractos celulares se hacen
pasar, mediante centrifugacin, por las columnas especficas que capturan el DNA o RNA.
Una vez adheridos a la superficie de estas columnas, se llevan a cabo diversos pasos de
lavado para eliminar el resto de sustancias no deseadas. Finalmente, se lleva a cabo la
elucin de la columna del DNA o RNA y su recogida para posteriores procesos analticos.

8.2.2 Mtodos para detectar mutaciones en el ADN

En todos ellos el DNA que se va a analizar es primero amplificado mediante la reaccin

en cadena de la DNA polimerasa (PCR), que a su vez ya es un mtodo de deteccin si la
mutacin afecta al tamao del fragmento (insercin o delecin).
Figura 3: mtodos de secuenciacin

Reaccin en cadena de la polimerasa

Utilizando la reaccin en cadena de la DNA polimerasa podemos obtener cantidades

adecuadas de un fragmento de DNA para poder analizarlo. Este procedimiento ha
revolucionado el diagnstico molecular ya que, partiendo de una cantidad pequea de
DNA genmico del paciente, podemos amplificar distintas partes de genes en un par de
horas. Primero tenemos que sintetizar un par de cebadores (oligonucletidos de 15-25
nucletidos) que reconocen los extremos del fragmento que queremos amplificar. Luego
tenemos que favorecer que ocurra la sntesis de DNA. Para ello, lo primero que debemos
hacer es facilitar la separacin de las cadenas (desnaturalizacin) del DNA molde. A
continuacin, permitir el apareamiento de los cebadores a su regin complementaria en
el DNA molde y, por ltimo, facilitar que una DNA polimerasa resistente a altas
temperaturas (como la DNA polimerasa Taq) lleve a cabo la sntesis (extensin) de DNA
a partir de los cuatro desoxirribonucletidos trifosfatos (dATP, dGTP, dTTP y dCTP). Estos
tres pasos constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40 veces permite obtener,
como resultado de un experimento de amplificacin, millones de copias del fragmento de
inters. Todo esto se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reaccin se
introducen en un termociclador que de forma automtica realiza los 40 ciclos de
amplificacin.
Figura 4:Reaccin en cadena de polimerasa

Secuenciacin del DNA

La secuenciacin del DNA consiste en determinar el orden exacto de los nucletidos

(bases, G, A, T y C) a lo largo de un segmento de DNA. De esta secuencia se deduce la
secuencia de aminocidos de la protena codificada. El mtodo que ms bsico es el de
Sanger de sntesis de DNA. El DNA que se va a secuenciar se desnaturaliza y se mezcla
con un cebador (complementario a un sitio en una de las hebras), polimerasa de DNA y
los cuatro nucletidos (dNTPs). Tambin se aaden pequeas cantidades de los cuatro
terminadores de la sntesis (ddNTPs) marcados cada uno con un fluorforo distinto. Cada
vez que uno de ellos se incorpora previene la incorporacin de otros nucletidos a la
cadena. De esa manera se genera un conjunto de fragmentos de DNA marcados con
fluorescencia que difieren en tamao solo en un nucletido. Los fragmentos se separan
mediante electroforesis en un capilar de un analizador automtico. Cuando los fragmentos
van migrando por el capilar pasan por un rayo lser que los hace fluorescer. Un detector
de fluorescencia graba el orden del color de las bandas que luego se traduce en la
secuencia. Finalmente, la secuencia de los fragmentos del gen de pacientes se compara
con la secuencia normal para determinar la presencia de mutaciones.
Figura 5: Secuenciacin de ADN, mtodo sanger

Micromatrices de oligonucletidos

Las micromatrices (microarrays) permiten el anlisis en paralelo de ms de cien mil

biomolculas en volmenes de reaccin muy pequeos. Una de sus aplicaciones es la
deteccin de mutaciones causantes de enfermedad o mutaciones que predisponen a
enfermedad para diagnstico. Sobre la superficie de una placa de cristal se sintetizan en
un orden determinado miles de oligonucletidos (fragmentos cortos de DNA, 20-50
nucletidos) que contienen todas las mutaciones conocidas de un gen o todas las
variaciones posibles en la regin codificante del gen. El DNA de los pacientes y controles
sanos se amplifica y se marca con fluorescencia utilizando PCR, y luego se aade a la
micromatriz. La fluorescencia en una posicin determinada indica que el DNA se ha unido
al oligonucletido.
 Figura 6: Three basic types of microarrays: (A) Spotted arrays on glass, (B) self assembled arrays and (C) in-
situ synthesized arrays.

8.2.3 Mtodos para detectar mutaciones en el ARN

Transcripcin inversa seguida de amplificacin por PCR (RT-PCR)

La presencia de mutaciones puede tambin detectarse en el RNA de los pacientes. Una

vez aislado este RNA de sangre u otros tejidos, se emplea la tcnica de transcripcin
inversa seguida de amplificacin mediante PCR. Posteriormente, los productos de la
reaccin son analizados mediante secuenciacin de DNA para determinar si existen
mutaciones en la regin codificante del gen. La transcripcin inversa utiliza el mRNA como
molde para sintetizar una hebra de DNA complementaria (denominada cDNA). Dicha
molcula es idntica a la hebra de DNA del correspondiente gen pero carente de los
intrones presentes en el DNA genmico. Seguidamente, se usa el cDNA como molde para
una PCR convencional. Mediante esta tcnica, se pueden distinguir alteraciones en el
procesamiento de RNA durante su maduracin, presencia de trnscritos alternativos del
gen, etc.

Sistemas de minigenes

La manera idnea de determinar el verdadero efecto de una mutacin causante de

enfermedad sobre el procesamiento del pre-RNA mensajero es el anlisis directo del RNA
procedente de tejido del individuo afectado mediante RT-PCR. Sin embargo, no siempre
es posible obtener la muestra de tejido y su RNA correspondiente. La solucin en estos
casos es construir en un vector plasmdico parte de un gen con algunos de sus exones e
 intrones (sistemas de minigenes). Estos minigenes se introducen en lneas celulares,
donde se expresarn de manera transitoria. El RNA procedente de cultivos celulares es
extrado y analizado mediante RT-PCR. La comparacin de los patrones de splicing
resultantes de un minign con la secuencia normal del exn de inters con el de un
minign portador de la secuencia exnica mutada permitir detectar el efecto de esta
mutacin a nivel del procesamiento del pre-RNA mensajero.

8.3 Limitaciones del diagnstico molecular

Una de las grandes limitaciones del diagnstico molecular es el costo de los test utilizados.
De forma general, estos test superan los valores de los ensayos comnmente utilizados
en clnica para el mismo propsito y en la mayora de ellos no es posible obtener un
reembolso por compaas aseguradoras, siendo el paciente el responsable de costear
estos exmenes. Esta situacin se ve mayormente reflejada en los hospitales pblicos,
donde no existe un presupuesto que contemple la implementacin de tcnicas
moleculares. Sin embargo, esta situacin ha cambiado en los ltimos aos, la
competencia de mercado y el desarrollo de plataformas ms econmicas, ha impulsado
la implementacin de laboratorios de biologa molecular tanto en centros privados como
pblico (Farfn, 2015).

9 BIBLIOGRAFA

Cruz, M. (2005, Septiembre 13). Genes candidatos como posiblesmarcadores de suceptibibilidad a

diabetes tipo 2. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.facmed.unam.mx/bmnd/publicaciones/ampb/numeros/2005/03/g_81-
86_GenesDT2.pdf
Equipo de redaccin, R. e. (2016, Septiembre 6). Tipos de inmunidad. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.mastiposde.com/inmunidad.html
Farfn, M. J. (2015, octubre 13).
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0716864015001546.
Gomez, A. (2011, Octubre 21). MARCADORES MOLECULARES PARA EL DIAGNSTICO TEMPRANO DE
LA DIABETES MELLITUS . Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://mecanismosbiologicosdediabetes.blogspot.com/2011/10/marcadores-moleculares-
para-el.html
Jimnez, F. T. (2014, Diciembre 15). PREVENCION DE ENFERMEDADES. Retrieved Febrero 20, 2017,
from https://prezi.com/jrh4hnjmspcx/prevencion-de-enfermedades/
Mackenna, V. (2008, Abril 1). Monitoreo gentico en programas de repoblamiento de peces mediante
marcadores moleculares. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-
16202008000100001&script=sci_arttext&tlng=pt
Prez, I. G. (2016, Diciembre 5). Introduccin a la Terapia Gnica y la Terapia Celular. Retrieved
Febrero 20, 2017, from http://www.setgyc.es/Informaci%C3%B3n-de-
Inter%C3%A9s/Introducci%C3%B3n-a-la-Terapia-G%C3%A9nica-y-la-Terapia-Celular.aspx
Ramos, L. Y. (2005, Abril 1). Marcadores moleculares. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.uv.mx/cienciahombre/revistae/vol18num1/articulos/moleculares/
Robledo, G. B. (2008, Mayo 03). La respuesta inmune. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.ejournal.unam.mx/rfm/no51-3/RFM051000310.pdf
Zarur, S. B. (2012, Agosto 14). Actualizaciones de enfermeria y salud. Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://actualixaciones.blogspot.com/2012/08/inmunidad-concepto-de-inmunidad-de.html

D., B. C., G., C. M., & Surez Larreinaga, C. (16 de 4 de 2000). OTRA UTILIDAD DE LA INGENIERIA
GENTICA: HISTORIA DE LA VACUNA RECOMBINANTE. Obtenido de
https://biotecnologia.fundaciontelefonica.com/2011/07/16/otra-utilidad-de-la-ingenieria-
genetica-historia-de-la-vacuna-recombinante/
Funes, J. A. (12 de Marzo de 2013). Qu es la farmacogenmica? Obtenido de
http://www.innsz.mx/opencms/contenido/investigacion/comiteEtica/farmacogenomica.htm
l
Gimnez. (2007).
Gimnez, D. S. (4 de Enero de 2007). La Farmacogenmica. Obtenido de
http://www.medicina21.com/Articulos/V2394/La-Farmacogenomica.html
Kaneshiro, N. K. (01 de 09 de 2016). Informacin general sobre las vacunas . Obtenido de
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/002024.htm
Mnckeberg, F. (1988). Anticuerpos monoclonales. Obtenido de "La Revolucin de la Bioingeniera":
http://www.creces.cl/new/index.asp?imat=++%3E++13&tc=3&nc=5&art=652
Wikipedia. (s.f.). Polyclonal Antibodies. Obtenido de
https://en.wikipedia.org/wiki/Polyclonal_antibodies

https://espanol.vaccines.gov/b%C3%A1sicos/tipos/eskw/%C3%ADndice.html
Vericat Joan Albert (sf), Toxicogenomica: una aproximacin integradora para explorar efectos
txicos de nuevas molculas y agilizar la seleccin de candidatos a desarrollo farmacutico
Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/view/558/576
Cap M. A.; Frejo M T. (2007), Toxicogenomica: Toxicogenmica: Una nueva rama de la toxicologa
Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://ibdigital.uib.es/greenstone/collect/medicinaBalear/archives/Medicina/_Balear2/007v
22n3/p025.dir/Medicina_Balear2007v22n3p025.pdf
Farfn BQ. Mauricio J. (2015, Octubre 13) Molecular biology in clinical diagnosis
Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0716864015001546
Claverie Martn F., . Ramos Trujillo E., Gonzlez Paredes F.J. (2008) Tcnicas para el diagnstico
molecular de enfermedades hereditarias Retrieved Febrero 20, 2017, from
http://sccalp.org/documents/0000/0154/BolPediatr2008_48_235-241.pdf
Mardis Elaine R. (2008, Junio) Next-Generation DNA Sequencing Methods Retrieved febrero 22, 2017,
from http://moscow.sci-
hub.bz/e6aaa15cf160f8496fd5fc8483fad915/10.1146%40annurev.genom.9.081307.164359.
pdf
Bumgarner Roger (2014, Mayo) DNA microarrays: Types, Applications and their future Retrieved febrero

22, 2017, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4011503/