Pelculas de envasado de alimentos activas con actividad antimicrobiana sinrgica

Abstracto

Nanocompuestos de polmero de alta calidad que contienen una combinacin antimicrobiana

sinrgica de aceites (mezclas de carvacrol y timol) y su excelente rendimiento como embalaje
para hummus. Las propiedades interactivas de carvacrol y timol contra E. coli se estudian in
vitro, ya que la combinacin de estos aceites esenciales (OE), que proporciona un agente
antimicrobiano sinrgico accin, se carga en los nanotubos del halloysite (HNTs) por primera
vez. Esta ltima nanoescala los portadores minimizan la prdida de los EOs altamente voltiles
durante el procesamiento del polmero a alta temperatura, permitiendo la composicin en
fusin y posterior produccin de pelculas a escala semiindustrial. La resultante las pelculas
exhiben una actividad antimicrobiana sinrgica contra E. coli, superando las pelculas que
contienen el individuo EOs por la potencia y la vida til. Las pelculas tambin se integran en
los envases reales de alimentos, y se estudia su efecto sobre el crecimiento de E. coli en el
hummus inoculado. El crecimiento bacteriano se reduce en siete rdenes de magnitud, lo que
conduce a su completa erradicacin, mientras que el comportamiento antimicrobiano control
pelculas fue significativamente ms dbil. Estos resultados demuestran el inmenso potencial
de estas pelculas como materiales de envasado de alimentos para controlar eficientemente el
crecimiento de bacterias en sistemas alimentarios complejos.

1. Introduccin

El deterioro microbiano causado por microorganismos patgenos, incluyendo bacterias y

hongos, reduce la vida til de los alimentos y aumenta el riesgo de enfermedades transmitidas
por los alimentos y, por lo tanto, preocupacin global (Bohme et al., 2012, Gram y otros, 2002,
Quintavalla & Vicini, 2002). Como resultado, se buscan nuevas tecnologas para productos
alimenticios ms seguros y minimizar las prdidas y (Appendini y Hotchkiss, 2002, Irkin y
Esmer, 2015, Kenawy, Worley y Broughton, 2007; Otoni, Espitia, Avena-Bustillos, & McHugh,
2016; Scharff, 2012). Entre ellos, el envasado activo, que est diseado para controlar el
desarrollo de la caries y las enfermedades microorganismos, surge como una tecnologa
prometedora para extender la vida til, mantener la inocuidad de los alimentos, minimizando
los riesgos de las enfermedades transmitidas por los alimentos (Han, 2005; Labuza & Breene,
1989; Malhotra, Keshwani, & Kharkwal, 2015; Vermeiren, Devlieghere, van Beest, de Kruijf, &
Debevere, 1999). A pesar de su potencial inmenso, no se utiliza el envasado de alimentos
antimicrobianos, fecha, en gran escala. Los agentes antimicrobianos usados actualmente (por
ejemplo, iones oxidantes, tales como iones de cobre o de plata) proporcionan slo eficacia
contra microorganismos y sobre todo en contacto directo (Brandelli, 2015, Dallas, Sharma y
Zboril, 2011, Llorens, Lloret, Picouet, Trbojevich, & Fernandez, 2012; Rai, Yadav y Gade, 2009).

Por lo tanto, su eficacia limitada combinada con preocupaciones sobre su seguridad, y la

aparicin de bacterias resistentes, son principales factores que limitan su uso comn (Ahamed,
AlSalhi, & Siddiqui, 2010; AshaRani, Kah bajo Mun, Hande, y Valiyaveettil, 2008; Carbone,
Donia, Sabbatella, & Antiochia, 2016; Gaillet & Rouanet, 2015; Realini & Marcos, 2014).
Adems, estos antimicrobianos materiales no satisfacen la demanda reciente de los
consumidores y productos alimenticios seguros (Malhotra et al., 2015). Alternativamente,
aceites esenciales (OE), que son antimicrobianos naturales y altamente eficaces contra las
bacterias y los hongos, estn aprobados por el Administracin de Drogas (FDA) para uso
alimentario como GRAS (generalmente reconocido como seguro) (Burt, 2004; Dorman &
Deans, 2000; Moreira, lvarez, & Ponce, 2016; Vergis, Gokulakrishnan, Agarwal, & Kumar,
2013). Los OE son compuestos particularmente atractivos para incorporacin en los materiales
de envasado de alimentos, ya que como vapor en el espacio de cabeza del envase,
esterilizando tanto la superficie del alimento como el ambiente del espacio de cabeza (Bassole
& Juliani, 2012; Calo, Crandall, O'Bryan, & Ricke, 2015; Hyldgaard, Mygind, & Meyer, 2012;
Lpez, Snchez, Batlle y Nerin, 2005; MartnezGracia, Gonz alez-Bermdez, Cabellero-Valc
arcel, Santaella-Pascual, & Frontela-Saseta, 2015).

Mucho esfuerzo se dirige hacia la incorporacin de estos compuestos sensibles en los

productos bsicos mediante tcnicas de fabricacin convencionales, al mismo su prdida
durante el procesamiento a alta temperatura y el mantenimiento su funcin antimicrobiana
(Malhotra et al., 2015, Ramos, Jimnez, Peltzer, & Garrigos, 2012; Sung et al., 2013; Suppakul,

Miltz, Sonneveld, & Bigger, 2006; Valdes et al., 2015). Recientemente, hemos demostrado el
uso de nanotubos de Halloysite (HNTs), que son minerales naturales de arcilla de
aluminosilicato (Liu, Jia, Jia, & Zhou, 2014; Lvov, Wang, Zhang, y Fakhrullin, 2015), como
portadores a nanoescala para carvacrol utilizado como modelo EO. Entrapment de carvacrol
dentro HNTs permite la incorporacin de esta EO altamente voltil diferentes matrices
polimricas a temperaturas elevadas de hasta 250 C (Shemesh, Krepker, Nitzan, Vaxman y
Segal, 2016). La resultante los nanocompuestos se caracterizan por un mayor contenido de
carvacrol dentro de las pelculas finales adems del perfil de liberacin sostenida de los EOs
atrapados en comparacin con las pelculas de control sin HNTs (Shemesh et al., 2016,
Shemesh et al., 2015b). Sin embargo, las posibles interacciones de EO con diversos
componentes alimenticios (por ejemplo, grasas, protenas y azcares) y otros factores
extrnsecos (tales como temperatura y microorganismos especficos) a menudo resultan en
una actividad antimicrobiana inferior, que requieren el uso de dosificaciones ms altas de
agentes antimicrobianos (Burt, 2004). Esto, a su vez, puede dar como resultado efectos
organolpticos (Calo et al., 2015; Martnez-Gracia et al., 2015).

As, explotando interacciones sinrgicas entre varios OE o sus componentes principales pueden
aumentar su eficacia a concentraciones y minimizar los cambios organolpticos en como el
hummus, que fue elegido como modelo alimentario en este estudio (Martnez-Gracia et al.,
2015).

Hummus es uno de los platos ms comunes en el Medio Oriente, y su popularidad en el

Estados Unidos y Europa ha aumentado significativamente en el pasado dcada. Se prepara a
partir de garbanzos cocidos y triturados (u otros frijoles), mezclado con algunos de los
ingredientes de eleccin como el limn jugo, ajo, aceite de oliva, etc Hummus es un alimento
de alta humedad con un valor de la actividad del agua alrededor de 0,98 y pH cido 5.4. Es rico
en nutrientes que promueven fcilmente los microorganismos el crecimiento de Listeria
monocytogenes, Salmonella y E. coli (Ashenafi & Busse, 1991; Ashenafi, 1991). Adems, se
demostr que el humus inactivar varios agentes antimicrobianos, tales como nisina y cido
ctrico, a pesar de su actividad in vitro (Al-Holy, Al-Qadiri, Lin, & Rasco, 2006). Recuerdos
recientes de productos de humus debido a bacterias contaminacin fueron registrados
recientemente por Food and Drug Administracin (FDA), destacando la necesidad de su
suministro seguro (FDA, 2015; 2016).En el presente documento, nuestro objetivo es
desarrollar pelculas de LDPE antimicrobianas que contengan una combinacin sinrgica de
carvacrol (CV) y timol (TY) y demostrando que tales sistemas pueden ejercer un efecto
antimicrobiano superior accin (Campos-Requena, Rivas, Prez, Figueroa, Sanfuentes, 2015;
Cosentino et al., 1999; Didry, Dubreuil, & Pinkas, 1993; Guarda, Rubilar, Miltz, y Galotto, 2011).
Siguiendo la evaluacin de las propiedades interactivas de CV puro y TY contra E. coli in vitro,
se cargan combinaciones de estos OE en la nanocarriers, produciendo por primera vez un
aditivo basado en HNTs para la composicin de polmeros que contiene dos compuestos
activos diferentes, que proporcionan una accin antimicrobiana sinrgica. Despus, los HNTs
cargados se incorporaron a la matriz de LDPE mediante compounding de fusin convencional
usando equipo semi-industrial, y la capacidad de los EO voltiles atrapados por HNT para
soportar la procesamiento a temperaturas elevadas mientras se preservan los antimicrobianos
actividad. La actividad antimicrobiana de CV-TY que contienen pelculas de LDPE (en trminos
tanto de larga duracin como de potencia) se caracteriz in vitro y en un sistema alimentario
real (hummus propagacin) y en comparacin con pelculas de LDPE que contienen los EO
individuales.

2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y cultivos bacterianos

Los nanotubos de Halloysite (HNT) fueron suministrados por NaturalNano (EE.UU.) y se sec a
150 C durante 3 h antes de su uso. Polietileno de baja densidad (LDPE), Ipethene 320, fue
suministrado por Carmel Olefins Ltd. (Haifa, Israel) con un caudal de fusin de 2 g / 10 min.
Carvacrol (98%), timol (98%), agar Bacto, medio Luria-Bertani (LB), nutriente El medio de caldo
(NB), Tween - 80 se adquiri de Sigma Aldrich (Israel). NB bacto-agar se adquiri de Becton
Dickinson (ESTADOS UNIDOS). Garbanzos enteros en conserva sin conservantes (Pri Galil Ltd,
Israel) fueron comprados en un supermercado local.

Escherichia coli (E. coli, ATCC 8739), se mantuvieron sobre poliestireno perlas a -80C. Para la
susceptibilidad antimicrobiana y agar difusin, se prepararon cultivos bacterianos incubando
una en 5 ml de medio LB durante 16 h a 37C bajo agitacin (250 rpm).

Posteriormente, el cultivo se diluy 1: 100 en medio LB fresco y se incub durante un ~ 1,5 h

adicional, permitiendo que las clulas para entrar su etapa logartmica. El crecimiento
bacteriano fue monitoreado fotomtricamente midiendo la densidad ptica a una longitud de
onda de 600 nm (OD600). El nmero de clulas es directamente proporcional al Mediciones
OD600 (1 OD600= 1 x 108 clulas mL-1, siguiendo curva de calibracin, datos no mostrados) y la
concentracin de bacterias fue calculado a partir de los valores de OD600 obtenidos. Para
experimentos de almacenamiento, una perla se cultiv durante la noche en 3 ml de medio NB
a 37C bajo agitacin (250 rpm). Al da siguiente, la cultura se diluy 1: 100 en medio NB fresco
y se incub durante un tiempo adicional ~ 1,5 h, permitiendo a las clulas para entrar en su
etapa logartmica. Como el cultivo alcanz un valor de OD600 de 0,6, se diluy con 1% de NB a
obtener una suspensin de material bacteriano a una concentracin de 104 colonias unidades
de formacin (CFU) mL-1.
 2.2. Susceptibilidad antimicrobiana al carvacrol puro, timol y sus ensayos de
combinaciones

La susceptibilidad bacteriana al carvacrol puro, el timol y sus mezclas se caracteriz por el

procedimiento de tablero para la susceptibilidad antimicrobiana para la combinacin de
antimicrobianos (Franzot y Casadevall, 1997, Pei, Zhou, Ji, & Xu, 2009).

Por consiguiente, las emulsiones acuosas de contenido de timol y carvacrol (a concentracin

de 6400 mg L-1 en agua de MillyQ (18,2 m U-cm) preparado por ultrasonicacin (Vibra cell
VCX 750, Sonics & Materials Inc., EE.UU.). Las diluciones en serie del stock de carvacrol y timol
emulsiones se prepararon en una placa de 96 pocillos en medio LB a concentracin de 0e350
mg L1 y 0e400 mg L-1 para carvacrol (CV) y timol (TY), respectivamente. E. coli en un estadio
logartmico se aadi a cada pozo para contener aproximadamente 106 CFU mL-1 y el volumen
en cada pocillo hasta un valor total de 200 L.

Los pocillos de control se prepararon de forma similar (en la misma placa) a incluyen medio LB
fresco en lugar de cultivo de E. coli. La placa estaba sellado con SealPlate (Excel Scientific Inc.,
Victorville, CV, EE.UU.) y se incubaron a 37 C durante 16 h bajo agitacin suave en una
microplaca lector (Varioskan Flash, Thermo Scientific, EE.UU.). Absorbancia las mediciones se
registraron a 600 nm cada 3 min. Las MIC de CV y TY fueron considerados como la
concentracin ms baja que inhibi completamente el crecimiento bacteriano despus de 16 h
(Gutirrez, BarryRyan, & Bourke, 2008). La concentracin inhibidora fraccionada sumada (SFIC)
(Lambert, Skandamis, Coote, & Nychas, 2001) de CV y TY en una combinacin se defini como
la suma de ndices FIC de CV y TY: