Microbiologa del agua

Dr. Flix Daniel Andueza

Facultad de Farmacia y Bioanlisis
Universidad de los Andes
Mrida. Venezuela
Prometeo SENESCYT
Escuela de Bioqumica y Farmacia
ESPOCH. Riobamba. Ecuador

San Jos de Costa Rica, Octubre 2014

Anlisis Microbiolgico
 Mtodos de determinacin de
microorganismos

Siembra en profundidad.
Siembra por extensin.
Mtodos del nmero ms probable
(NMP).
Mtodo por filtracin.
Impedancia
Biologa molecular
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
TOTALES Y VIVOS
10 ml 1 ml de naranja de acridina o
0,2 ml del kit Baclight live/dead

5 min en la oscuridad
filtrar

Bacterias vivas:

Bacterias muertas:
Microscopio de
epifluorescencia
MICROORGANISMOS
TOTALES Y VIVOS
Bacterias aerobias mesfilas
 RECUENTO DE BACTERIAS
AEROBIAS MESOFILAS
1 mL

AGAR R2A AGAR PCA

INCUBAR A 22 C POR 5 DAS INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS
MESFILAS
1 ml c/u 1 ml c/u

PETRIFILM PETRIFILM

INCUBAR A 30 C POR 2 DAS INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

 RECUENTO DE BACTERIAS
HETERTROFAS
50 mL

AGAR R2A AGAR PCA

INCUBAR A 22 C POR 5 DAS INCUBAR A 37 C POR 2 DAS

 RECUENTO DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES
250 mL

AGAR CHAPMAN-LACTOSA- AGAR CHAPMAN-LACTOSA-

TRIFENIL-TETRAZOLIO TRIFENIL-TETRAZOLIO

INCUBAR A 30 C POR 24 - 48 h INCUBAR A 44,5 C POR 24 - 48 h

 RECUENTO DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES
1 ml c/u 1 ml c/u

PETRIFILM PETRIFILM

INCUBAR A 37 C POR 2 DAS INCUBAR A 44 C POR 2 DAS

 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml 1 ml

Caldo Lactosa Lauril sulfato

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo Bilis Verde Brillante

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS y SE BUSCA EL
NMP EN LA TABLA
 RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml 1 ml

Caldo Lactosa Lauril sulfato

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS
RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo E.C

INCUBAR A 44,5 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE GAS y SE BUSCA EL
NMP EN LA TABLA
RECUENTO DE ENTEROCOCOS

250 ML

AGAR GLUCOSA-FOSFATO-
AZIDA-TRIFENIL TRIAZOLIO

INCUBAR A 37 C
POR 48 HORAS

COLONIAS MARRONES
O NEGRAS (+)

CONFIRMAR
COLONIAS
INCUBAR A 44 C
POR 2 HORAS
AGAR BILIS ESCULINA
PRECALENTADO A 44 C
 RECUENTO DE ENTEROCOCOS
POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

1 ml 1 ml

CALDO AZIDA DEXTROSA

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE TURBIDEZ O
PRECIPITADO
RECUENTO DE ENTEROCOCOS
PRUEBA CONFIRMATORIA

0,1 ml

Caldo Azida violeta de etilo

INCUBAR A 37 C POR 24-48 horas

SE REALIZA EL RECUENTO
DE TUBOS CON PRESENCIA
DE PRECIPITADO AZUL
 RECUENTO DE ESPORAS DE
CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES

CALENTAR INCUBAR A 37 C
A 80 C POR 72 HORAS
POR 10
MINUTOS
10 ml c/u

INCUBAR A 45 C
POR 48 HORAS
(+)
AGAR SULFITO DE HIERRO
A DOBLE CONCENTRACIN
 DETECCIN DE AEROMONAS

250 mL

AGAR ALMIDN-AMPICILINA AGAR ALMIDN-AMPICILINA

INCUBAR A 37 C POR 24 - 48 h INCUBAR A 37 C POR 24 - 48 h

INVESTIGACIN DE Campylobacter

250 mL

Caldo Preston de enriquecimiento

AISLAR E IDENTIFICAR
INCUBAR A 42 C
POR 12 HORAS. MICROAEROFILIA

AGAR PRESTON
INCUBAR A 42 C POR 48 HORAS. MICROAEROFILIA
 INVESTIGACIN DE Legionella
pneumophila

100 mL
AISLAR
E
IDENTIFICAR

Incubar a 37 C
por 15 das
(filtro)
Tratamiento
cido
Lavar con 2 ml
de agua estril

Tratamiento
trmico
Agar BCYE-
 INVESTIGACIN DE Pseudomonas
aeruginosa
250 mL

AISLAR AGAR CETRIMIDA

E INCUBAR A 42 C
IDENTIFICAR POR 24 HORAS
INVESTIGACIN DE Staphylococcus
aureus

muestra

1 ml de la muestra
AISLAR E IDENTIFICAR

AGAR BAIRD PARKER

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS
INVESTIGACIN DE Staphylococcus
aureus

250 mL

CALDO CASEINA- SOJA

AISLAR E IDENTIFICAR
INCUBAR A 37 C
POR 24 HORAS

AGAR BAIRD PARKER

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS
 INVESTIGACIN DE Salmonella

250 mL
INCUBAR A 37C
POR 24 HORAS

CALDO CASEINA- SOJA

INCUBAR A 37 C POR 48 HORAS

tetrationato selenito
Incubar a 37 C por 24 horas
AISLAR E IDENTIFICAR

Incubar a 37 C
por 24 horas
Agar bilis Agar Agar
verde brillante SS bismuto
sulfito
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

FILTRAR FILTRAR
100 ml 10 ml

AGAR SABOURAUD

IDENTIFICACIN
 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

1 ml c/u 1 ml c/u

PETRIFILM MOHOS Y LEVADURAS PETRIFILM MOHOS Y LEVADURAS

INCUBAR A 25 C POR 7 DIAS INCUBAR A 25 C POR 7 DIAS

ESPECIES DE MOHOS ENCONTRADAS
EN AGUAS

Penicillium spp. Cladosporium spp. Curvularia spp. Fusarium spp.

Aspergillus spp. Chrysosporium spp. Cladosporium spp. Acremonium spp.

Microscopio de contraste
de fase. Objetivo 40 x
 RECUENTO DE
MICROORGANISMOS HALFILOS
MODERADOS

10 ml
INCUBAR A 30 C
POR 10 DAS

AGAR HALFILO

100 ml AISLAR E
IDENTIFICAR
INVESTIGACIN DE ALGAS Y
CIANOBACTERIAS

100 mL

MEDIO PARA ALGAS

Y CIANOBACTERIAS

INCUBAR A 24 C
POR 30 DAS CON
ILUMINACIN

OBSERVAR E
IDENTIFICAR
CIANOBACTERIAS Y ALGAS

Synechocystis spp

Chlorococcum spp

Microscopio de contraste
de fase y de fluorescencia.
Objetivo 40 x
 TAPETES Y BIOFILMES
5m

Science 2000; 290

5m

Adaptacin fisiolgica inespecfica:

secreccin exopolmeros
capacidad de dividirse
(SVNC)

LTSEM-BSE, Microscopa Electronica de

patogenicidad
Barrido a Bajas Temperaturas en la
modalidad de Electrones Retrodispersados
Secuenciamiento genes ARN 16S
PCR
Of 16S 16S Ligation Transformation
rDNA genes
rDNA
amplicons

Total DNA:

Insert
Sequencing PCR

(Giuseppe dAuria)
Analysis
 DIVERSIDAD MICROBIANA Y ESPECIFICIDAD
Ecosistemas de las aguas minerales muestran elevada diversidad microbiana
fenotpica y genotpica

Microbiota autctona de
aguas minerales 16S rRNA

RFLP
890 cepas: 378 ribotipos Restriction Fragment Length Polimorphism

no de polimorfismos con inequvoca resolucin de bandas en todos

grupos, sp en cepas productoras pigmentos fluorescentes: 174 cepas: 72 rbt
Cabina de flujo laminar
Identificacin de cepas microbianas
Observaciones de cultivo
Observaciones microscpicas
Evaluacin bioqumica
Evaluacin fisiolgica
Aguas de uso farmacutico
Agua para uso farmacutico
Se basan en las farmacopeas
Buenas prcticas de manufactura (GMP)
Aseguramiento de la calidad
Tipos de agua de uso farmacutico
Agua purificada
Agua altamente purificada
Agua para inyectables
Limites microbiolgicos
Agua purificada
BH Menor de 100 UFC/ml (USP 30-FE-2007)
Endotoxina menor 0,25 EU/ml (FE-2007)
Agua para inyectables
Menor de 10 UFC/ml (USP 30-FE-2007)
Endotoxinas menor 0,25 EU/ml (USP 30-FE-2007)
Agua altamente purificada
Menor 10 UFC/ml (FE-2007)
Endotoxina menor 0,25 EU/ml (FE-2007)
Pirogenos

Prueba del LAL

Test de coagulacin
a 37 C por 1 hora
Serie de diluciones
reactivo LAL
(Lymulus amebocite
lysate)
Test Pyrosate,
Combrex y Pirgeno
Limites microbiolgicos del agua en la
industria farmacutica

Ufc/ml
 Tratamiento del agua
Agua
cruda
Cmara de
mezcla del
Cribado Sedimentacin floculante

Clarificador Canales de Cmara de

sedimentacin floculacin

Cloracin Almacenamiento Distribucin

Desinfeccin de los sistemas de agua en
la industria farmacutica
Bibliografa
OMS (2004). Gua European
para la calidad del Pharmacopeia. 6th
agua potable. OMS edition, 2007
WHO (2005). Good
manufacturing
practices. Serie
(Report 39)
USP (2007).
Pharmacopeia.