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Scientia et Technica Ao XIII, No 37, Diciembre de 2007. Universidad Tecnolgica de Pereira.

ISSN 0122-1701 585

IDENTIFICACIN DE LA ESPECIE DE COLLETOTRICHUM RESPONSABLE DE LA


ANTRACNOSIS EN LA MORA DE CASTILLA EN LA REGIN CAFETERA

Identification of Colletotrichum specie responsable for antrhacnose of Andean blackberry in crops grown
in Colombia

RESUMEN MARTA L. MARULANDA A.


La antracnosis, causada por diferentes especies del gnero Colletotrichum, es Biloga, Ph.D.
una enfermedad que ocasiona prdidas entre 53% y 70% en cultivos de mora Profesora Titular
(Rubus glaucus) en Colombia. Para el control de esta enfermedad se requiere Universidad Tecnolgica de
conocer la sintomatologa en los cultivos e identificar y caracterizar el agente Pereira
causal. Se llev a cabo la colecta, cultivo y aislamiento del hongo, obtenido en ubioteve@utp.edu.co
cultivos de los departamentos de Risaralda, Caldas y Quindo, se inici la
caracterizacin de 7 aislamientos de Colletotrichum spp, mediante la LILIANA ISAZA V.
utilizacin de marcadores ITS (Internal Transcribed Spacers), y la evaluacin Administradora del Medio
de la patognicidad de los aislamientos. Ambiente, candidata a M.Sc.
Asistente de Investigacin
PALABRAS CLAVES: Antracnosis, Colletotrichum, mora de castilla (Rubus lilisaza@utp.edu.co
glaucus).
ANA MARIA RAMIREZ T.
ABSTRACT Ecloga, candidata a M. Sc
Anthracnose is a disease that affects 53% to 70% of the Andean blackberry juanamrato@gmail.com
(Rubus glaucus) crops grown in Colombia. It is caused by various species of
Colletotrichum spp. To generate an integrated control of the disease it is GRUPO DE BIODIVERSIDAD
necessary to know the symptoms among crops and to identified and Y BIOTECNOLOGA,
characterized the causal agent of Anthracnose. To obtain the monosporic FACULTAD DE CIENCIAS
fungus for culturing, storage and isolation, field samples were collected in AMBIENTALES,
Risaralda, Caldas and Quindo departments. The characterization of the seven UNIVERSIDAD
isolates of Collethotricum was conducted with molecular markers, ITS TECNOLGICA DE
(Internal Transcribed Spacers), and pathogenicity among isolates was PEREIRA.
evaluated.

KEYWORDS: Anthracnose, Colletotrichum spp, Andean raspberry (Rubus


glaucus).

1. INTRODUCCIN qumicos con un impacto negativo en el ambiente y en la


salud humana. De esta manera ya que el cultivo de la
Los frutales tropicales se perfilan como una de las mora constituye un rengln importante en la generacin
mejores opciones en la agricultura Colombiana por el de empleo en la regin, requiere de una demanda
crecimiento de la demanda nacional e internacional que permanente de tecnologa en el campo cientfico y socio
se ha reportado en 3.75% anual en los ltimos cuatro econmico [2, 4].
aos y por la activacin de la industria post-cosecha
(jugos, mermeladas, etc.), cuya demanda es suplida en la En los ltimos aos el cultivo de la mora ha presentado
actualidad por importaciones [1]. La especie Rubus numerosos problemas fitosanitarios. La antracnosis,
glaucus, conocida comnmente como mora de castilla, ha causada por Colletotrichum spp, ha alcanzado una
sido identificada como uno de los frutales con mayor incidencia promedio de 52,9% en los cultivos de la zona
potencial de desarrollo en la zona Andina colombiana, cafetera, seguida por el mildeo polvoso (Oidium sp.)
sin embargo este cultivo no ha adquirido el grado de 42,50% y el moho gris (Botrytis cinerea) 42,35% [2].
desarrollo deseado, debido a la falta de un sustento Estos problemas han afectado fuertemente la economa
tecnolgico adecuado y a la falta de esfuerzos de de los cultivadores de la zona.
mejoramiento. Los productores de mora en los
departamentos de Caldas, Risaralda y Quindo, estn La especie Glomerella cingulata, teleomorfo de
enmarcados dentro de una economa campesina, Colletotrichum gloeosporioides, fue identificada como la
empleando mano de obra familiar y contratacin de causante de la enfermedad de antracnosis que destruye
personal en poca de cosecha. Los cultivos se manejan en las caas de la mora de Castilla en la regin andina de
forma tradicional, generalmente con escasa aplicacin de Venezuela [3]. El patgeno produce lesiones de color
tecnologa, lo que se refleja en el alto uso de plaguicidas castao-claro encerradas por un borde castao-oscuro.
Fecha de Recepcin: 07 Septiembre de 2007
Fecha de Aceptacin: 07 Noviembre de 2007
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Las lesiones usualmente se inician en la porcin basal de muestreo se realiz en diferentes fincas de municipios del
las espinas y en los sitios de insercin de las ramas, los eje cafetero, conocidos por su produccin de mora de
pecolos y los pednculos[3], luego se produce el castilla, el material colectado incluy plantas de mora
secamiento y la muerte de la planta, esta enfermedad es con y sin aguijn, las muestras fueron marcadas y
tambin conocida en Colombia como Tuna negra [4]. preservadas en nevera. La tabla 1 muestra los municipios
Sin embargo, en Colombia no se tiene claridad sobre el con sus respectivas veredas, en donde se colectaron
verdadero agente causal de la enfermedad. Puede plantas afectadas por antracnosis.
encontrarse ms de una especie atacando frutos u otros
rganos de un mismo hospedante [5]. En condiciones de
invernadero tambin produce lesiones en el estoln y en
los frutos, causando importantes prdidas de la cosecha
[6]. Otras investigaciones en Rubus glaucus en el Valle
del Cauca [7] despus de analizar los aislados colectados,
con secuencias ITS (Internal Transcribed Spacers) de
manera preliminar concluyen que el agente causal de la
antracnosis es Colletotrichum acutatum.

Se han desarrollado muchos trabajos para determinar la


complejidad gentica de aislamientos de C.
gloeosporioides que infectan frutas tropicales y
subtropicales, hay diferentes mtodos moleculares
aplicados al estudio de este hongo, debido a que los Figura 1. Sntomas de antracnosis en tallos de mora.
criterios morfolgicos y taxonmicos no son lo
suficientemente precisos para discriminar entre especies No.
[8, 9, 10]. La secuencia GcpR1 repetitiva de AND AISLA
DEPARTA- MUNICIPIO OBSERVACIN
MIEN
nuclear de Colletotrichum lindemuthianum y la MENTO VEREDAS
TO.
secuencia A1T-rich de DNA han sido utilizadas para
agrupar varios aislamientos de C. gloeosporioides Caldas Salamina 1 Con aguijn
obtenidos en fresas [11]. El anlisis con primers-PCR
Pereira, La Con y sin
arbitrarios (AP-PCR) se ha utilizado tambin para Risaralda 2
Bella aguijn
diferenciar aislamientos de de C. gloeosporioides de
Santuario,
fresa [9, 11]; estos mismos marcadores se han usado en Con y sin
Risaralda Planes de San 3
aislamientos obtenidos en otras frutas tropicales como aguijn
Rafael
ctricos, aguacates, mangos y papayas [6, 9, 12, 13, 16]
Salento,
Quindo 4 Con aguijn
Navarco Alto
Los marcadores ITS -Internal Transcribed Spacers-
(ITS1 e ITS2) y el gen 5.8S rRNA fueron utilizados Villa Mara,
Caldas 5 Con aguijn
para identificar 80 aislamientos de Collethotricum La Paz
obtenidos en cultivos de fresa , tambin se reporta que el Santa Rosa,
uso de la enzima endonucleasa MvnI, permiti Risaralda La Paloma, 6 Sin aguijn
diferenciar entre Colletotrichum fragariae y San Jos
Colletotrichum gloeosporoides, ambos hongos son Desquebradas,
Risaralda 7 Sin aguijn
responsables de la antracnosis en fresa, los cuales son Rivera Alta
fenotpicamente indistinguibles [5, 9, 14]. Tabla 1. Sitios de colecta de Colletotrichum spp. en cultivos de
mora
Para el control de la enfermedad es necesario conocer la
sintomatologa y las caractersticas del agente causal, en 2.2. Aislamiento del hongo
vista de los pocos estudios realizados en el Eje cafetero
en mora de castilla, se pretende muestrear, aislar y En el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la
caracterizar morfolgica y genticamente el hongo en Facultad de Ciencias Ambientales de la UTP, se hicieron
diferentes cultivos de mora con y sin aguijn en los cortes de las manchas oscuras que indican la presencia
departamentos de Caldas, Quindo y Risaralda. del hongo, as como de los aguijones afectados, esto
fueron puestos en etanol al 70 % durante un minuto y
2. MATERIALES Y MTODOS lavados con agua destilada estril, los aislamientos se
obtuvieron por siembra directa en medio Papa Dextrosa
2.1. Coleccin de muestras Agar (PDA), acidificado con cido lctico. En caja de
petri fueron sembradas cinco partes de material vegetal
Se obtuvieron muestras de hojas, ramas y frutos con los infectado, puestas en incubadora a 23 C (Figura 2).
sntomas tpicos de la enfermedad (Figura 1). El
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d. Aspersin en fruto.

En todos los tratamientos se hicieron controles con


material vegetal con y sin herida, asperjados solo con
agua estril. Los cuatro tratamientos fueron puestos en
cmara hmeda a 23 C, bajo condiciones de oscuridad
durante 15 das.

Figura 2. Aislamientos de Colletotrichum sp provenientes de


cultivos de mora, cultivados en medio PDA

Posteriormente, para obtener cultivos monospricos, con


un sacabocados se tomaron esporas del aislamiento puro
y se sembraron por agotamiento en tubos de ensayo con
medio PDA (Figura 3).

Los tubos fueron puestos en incubadora a 23C en Figura 4. Mtodo de puncin de estacas
completa oscuridad.
Para la evaluacin de las pruebas de patogenicidad, se
realiz una escala con el grado de lesin presentada
(manchas de coloracin caf) as:
0 Sin sntomas.
1 Sntomas leves.
2 Varios lesiones (Coalescencia).
3 Deterioro total (Muerte de tejidos).

Las evaluaciones para todas las pruebas se realizaron


cada dos das durante 15 das.

2.4 Caracterizacin de los aislamientos con


Figura 3. Crecimiento del hongo por agotamiento marcadores ITS (Internal Transcribed Spacers)
2.3 Pruebas de patogenicidad La caracterizacin de la diversidad gentica de los
aislamientos de Colletotrichum se realiz siguiendo la
Se prepar una suspensin de esporas agregando agua metodologa descrita por [14, 15, 16]
destilada estril a las cajas petri para resuspender las
esporas, posteriormente es filtrado en gasa para evitar el 2.5 Amplificacin de la regin ITS
paso de micelio y de medio.
Se realizar la amplificacin con los cebadores
Para la inoculacin se utilizaron estacas de 15 cm., hojas universales de la regin conservada del gen ADNr
y frutos de plantas de mora sanos con y sin aguijn, se [16,17] y la cual involucrar tres cebadores ITS 1, ITS 4
realizaron tres repeticiones por tratamiento, los e ITS 2. Para identificar el patgeno se utilizarn los
tratamientos efectuaron fueron: cebadores especficos CgInt y CaInt2, estos ltimos
combinados con la secuencia ITS, ITS4 [16].
a. Puncin de estacas: Mediante aguja
hipodrmica, se realizaron ocho punciones, 2.6 Caracterizacin de Cepas
seguidamente se asperj con la suspensin del
hongo (Fotografa 4). Finalmente se har un anlisis con enzimas de restriccin
b. Mtodo de herida: Se realiz un corte con (PCR-RFLP) [7, 8, 15, 16], la visualizacin de los
bistur, all fueron puestos fragmento de medio fragmentos se realizar en geles de agarosa al 2%,
PDA con hongo, finalmente fueron sellados con teidos con bromuro de etidio.
papel vinilpel.
c. Puncin en hojas: Se realizaron ocho punciones
a los tres foliolos igual que a las estacas ya
descritas anteriormente.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIN hongo colectados con el fin de determinar cul de ellos


tienen una mayor patogenicidad sobre la planta.
3.1 Aislamiento y cultivo del hongo, y caracterizacin
morfolgica. 3.3 Caracterizacin de los aislamientos con
marcadores ITS (Internal Transcribed Spacers)
Se obtuvieron 14 aislamientos de diferentes sitios del eje
cafetero, luego de 72 horas de incubacin se observa el De acuerdo con la descripcin de [15,16]., la
inicio de crecimiento del hongo, al cabo de ocho das se amplificacin directa de secuencias de ADN ribosamal
observ un completo crecimiento del hongo, de hongos, tiene importantes aplicaciones para aclarar
identificndose sus estructuras reproductivas. problemas filogenticos y taxonmicos, esta tcnica ha
sido utilizada para la caracterizacin de aislamientos de
Se identificaron dos tipos de crecimiento del hongo, Colletotrichum asociados a antracnosis en muchas frutas
crecimiento rpido y micelio gris con relieve ondulado y tropicales y subtropicales.
crecimiento lento con micelio blanco grisceo, abundante
y esponjoso; estos tipos de crecimiento coinciden con los En este trabajo se realiz la extraccin de ADN de los
descritos por [17] en estudios sobre la infeccin de aislamientos de Colletotrichum spp obtenidos en cultivos
Colletotrichum gloeosporoides en guanbana en el Valle de mora de la regin, se evalu la calidad y
del Cauca, aunque la autora menciona otro tipo de concentracin del ADN de cada una de las muestras, se
crecimiento con esporulacin rpida de color naranja, al obtuvo ADN de buena calidad y en concentracin
parecer asociado a otra especie de Colletotrichum. Es suficiente para la evaluacin con los ITS.
frecuente encontrar asociacin de dos especies de
Colletotrichum, (C. gloeosporiodes y C. acutatum) como Se realizaron pruebas preliminares con los cebadores
es el caso de Olivo [18], en el que encontraron las dos ITS 1 e ITS 2, segn lo descrito por [7, 15], en estas
especies. As mismo, [7, 21] en estudios realizados en pruebas se han obtenido amplificaciones positiva con
Colombia se han encontrado las dos especies del hongo, todas las muestras, y con los dos cebadores ITS.
en 83 aislamientos monospricos de Colletotrichum spp.
procedentes de cultivos de mora de 10 municipios del Conjuntamente con la caracterizacin morfolgica y
Valle del Cauca. microscpica, la caracterizacin molecular permitir
determinar el agente causal de la antracnosis en mora.
3.2 Pruebas de Patogenicidad
La evaluacin molecular aportar informacin muy
La primera evaluacin realizada a los dos das (48 H) de valiosa sobre la variabilidad gentica del hongo en la
la inoculacin no muestra sntomas ni signos de la regin cafetera, para lo cual la colecta de los aislamientos
enfermedad en los tejidos analizados; al cabo de cuatro del hongo se realiz tomando datos geo-referenciados.
das (96 H), se empiezan a notar los primeros sntomas
de enfermedad, como lesiones necrticas en todos los Todos los resultados que se obtengan en esta
ensayos realizados, con los diferentes tipos de tejido, investigacin servirn para sentarn las bases de un
como tallos, hojas y frutos. En pecolos de fresa programa de control ms efectivo de la antracnosis, es
inoculados con C. fragariae, la germinacin de conidios probable que se identifiquen tambin hongos
y formacin de apresorios ocurri entre 6-16 h y 12-24 h antagonistas asociados, que en el futuro se puedan
despus de la inoculacin [19]. La penetracin del hongo utilizar como control biolgico del Colletotrichum y as
fue directa a travs de las clulas epidermales y las disminuir el uso de plaguicidas.
basales de los tricomas [20].
Esta informacin, sumada a las pruebas de patogenicidad,
En los ensayos realizados en pruebas de laboratorio ser de gran utilidad para la seleccin de genotipos,
utilizando frutos, hay abundante presencia del hongo, con accesiones y/o variedades de mora con tolerancia o
abundante esporulacin a los cuatro das (96 H). Los resistencia a Colletotrichum spp. Estas plantas sern
resultados coinciden con los de otros autores [3, 7, 21] posteriormente evaluadas en colaboracin con
quienes en investigaciones en antracnosis en mora agricultores de Risaralda; se conocen varios trabajos en
describen que los sntomas en tallos empiezan cuatro das fresa y frambuesa, especies de la familia Roseaceae al
despus de la inoculacin con lesiones caf oscuras igual que la mora, en los cuales se ha encontrado
alrededor del sitio de inoculacin, sin embargo los resistencia a Colletotrichum, [6, 22] se identificaron
mismos autores describen que en frutos, la presencia del genes de resistencia en frambuesa y marcadores
hongo slo ocurri despus de los 10 das. moleculares asociados con el gen de Rca 2 que otorga la
resistencia para el grupo 2 de patogenicidad de
En la actualidad se est evaluando el efecto del hongo, Colletotrichum acutatum, que causa la antracnosis a la
sobre diferentes porciones de las plantas de mora, en fresa [22].
pruebas de laboratorio, de los diferentes aislamientos del
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Otros trabajos de mucha importancia en el tema de la Se realiz la extraccin de ADN, de los aislamientos en
genmica funcional en fresa [23] es el desarrollo EST cultivo, se observ su buena calidad y concentracin, se
(secuencias de genes expresados) y SSR (secuencias han realizado evaluaciones preliminares con los ITS, y se
simples repetidas), se encontr un grupo de secuencias de ha obtenido amplificacin positiva.
genes putativos -1304- estos EST han sido desarrollados
y las transcripciones identificadas para aspectos Desde el punto de vista de la aplicacin prctica de
fisiolgico y de inters econmico. Los anlisis de nuestros resultados y su transferencia a los agricultores se
homologa de las secuencias indicaron que un 89.5% son puede concluir, de manera preliminar, que antes de cuatro
compartidas con protenas funcionales y conocidas en das de iniciado el proceso infectivo es preciso hacer un
otras especies de Rosaceae. Los EST son fragmentos de control de la enfermedad en campo. Dicho control puede
ADNc que se obtienen de secuenciar la expresin de un contemplar la aplicacin de un fungicida sistmico y la
gen, o una cadena de RNA mensajero. realizacin de podas y destruccin de ramas y tallos que
se encuentren afectados, buena aireacin con la poda de
Las secuencias obtenidas por estos investigadores pueden ramas improductivas y las ramas que ya estn
ser utilizadas para acelerar procesos de bsqueda de fructificadas.
genes de importancia econmica tanto en Fragaria como
Rubus y otras Rosaseae, basados en las herramientas 5. BIBLIOGRAFA
modernas de la Bio-informtica, y la genmica
comparativa [23]. [1] J. Rodrguez. Aspectos socioeconmicos de los
sistemas de produccin de mora y lulo en Colombia.
Tanto los resultados anteriores, sobre la presencia de 2002. En: IV Seminario nacional de frutales de
genes de resistencia en fresa, como la existencia de un clima fro moderado.
grupo de EST en Fragaria; son de gran valor para que a
muy corto plazo, nuestro grupo incursione en la [2] M. Botero, G. Ros, G Franco, M. Romero, J.
evaluacin de los EST relacionados con la resistencia a la Prez, J. Morales, J. Gallego, y D. Echeverry.
antracnosis en el germoplasma de mora. Identificacin y especializacin de enfermedades
asociadas a los cultivos de mora (Rubus glaucus
Los mtodos actuales de seleccin y bsqueda de Benth) en el eje cafetero. 2002. IV Seminario de
resistencia, se basan en el aprovechamiento de las bases frutales de clima fro moderado. pp, 87-92
de datos y en la genmica comparativa, debido a que se
ha demostrado que los genomas de las plantas muy [3] M. Cedeo y P. Palacios. Antracnosis en mora de
cercanas filogenticamente, comparten regiones Castilla (Rubus glaucus) causada por Glomerella
altamente conservadas, es de esperar entonces, la cingulata en Venezuela. 1991.Fitopatologa
existencia de genes de resistencia en Rubus, por Venezolana 4: 17-2.
pertenecer a la familia Rosaseacae.
[4] G. Franco y M. Giraldo. El cultivo de la mora. 2002.
Hay muchos reportes sobre la presencia de un Corpoica Regional 9. 78 pp.
importante nmero de especies de Rubus en los Andes
Colombianos [24, 25, 26]; adicionalmente ha sido [5] S. Freeman. Genetic diversity and host specificity
documentada, mediante la utilizacin de marcadores of Colletotrichum species on various fruits. In:
moleculares, una amplia variabilidad gentica intra- Colletotrichum Host Specificity, Pathology, and
especifica en la especie Rubus glaucus, como tambin la Host-Pathogen Interaction. 2000. APS Press. USA.
probable interaccin gentica entre las especies de Rubus pp: 131-144.
silvestres con la especie de inters comercial [27, 28].

El amplio y diverso germoplasma de mora presente en el [6] B. Smith y L. Black. Resistance of strawberry plants
eje cafetero, ha sido estudiado de manera extensa por to Colletotrichum fragariae affected by
nuestro grupo utilizando marcadores moleculares RAPD, environmental conditions. 1987.Plant Dis. 71: 834-
AFLP y SSR [27, 28]. 837.

4. CONCLUSIONES [7] E. Alvarez .A. Arenas, J. Meja. Molecular


andpathogenic characterization of isolates of
Se estn efectuando pruebas de patogenicidad a nivel de Colletotrichum spp. associated whit anthracnose of
laboratorio, logrando estandarizar el mtodo de Andean blackberry on accessions from Valle del
inoculacin en diferentes porciones de la planta en Cauca. 2006. CIAT Annual Report.
cmara hmeda, obteniendo el tiempo de aparicin del
hongo en los diferentes inoculados. [8] S. Sreenivasapradsad.. P.R, Mills. B., Meehan. y A.E.
Brown. Phylogeny and Systematics of 18
590 Scientia et Technica Ao XIII, No 37, Diciembre de 2007. Universidad Tecnolgica de Pereira.

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