.5.

Aislamiento y Purificacin
El aislamiento denota generalmente la separacin del producto de la masa del organismo
productor. La disposicin y el estado de la protena expresada afectan al procedimiento de
aislamiento. Para las clulas de mamferos y algunos E. coli, Streptomyces, Bacillus, y
productos de levadura, la protena se libera de la clula en el medio circundante, y el
aislamiento se efecta mediante una etapa de separacin slido-lquido, usualmente
centrifugacin o microfiltracin o ultrafiltracin. Si el producto se ha agregado en el
espacio citoplasmtico o periplsmico, el aislamiento es ms complicado. Generalmente, la
clula es primero lisada por tratamiento mecnico, qumico o enzimtico (o una
combinacin). En algunos casos, el agregado ms denso puede separarse por centrifugacin
de la mayor parte de los componentes celulares solubles e insolubles; en otros casos, el
agregado se solubiliza en primer lugar mientras todava se encuentra en la mezcla de
protenas soluble.
La purificacin de la protena es una parte crtica ya menudo costosa del proceso. Podra
representar el 50% o ms del costo total de produccin. La purificacin tiene varios
objetivos: eliminar componentes contaminantes del organismo husped, es decir, otras
protenas, ADN y lpidos; para separar la protena (o familia de protenas) deseada de las
variantes no deseadas de la protena deseada; eliminar y evitar la introduccin de
endotoxina; para inactivar virus; para obtener los rendimientos requeridos a un costo
aceptable; para evitar la modificacin qumica o bioqumica de la protena; y hacer que el
proceso sea consistente y fiable. En algunos casos, el objetivo primero y adicional es doblar
la protena en su conformacin deseada.
Gran parte del conocimiento acumulado sobre la purificacin de protenas es propiedad de
empresas individuales. Sin embargo, la informacin disponible sugiere una consistencia
general en el tipo y orden de las etapas del proceso. Las operaciones individuales ms
comunes son centrifugacin, filtracin, separacin por membrana, separacin por adsorcin
y cromatografa.
Las preocupaciones regulatorias y de seguridad se han combinado con el deseo de
formulaciones lquidas estables para motivar la eliminacin de las protenas del organismo
husped a un grado mximo. La medicin de esos contaminantes requiere ensayos
sofisticados capaces de detectar un espectro de posibles contaminantes en unas pocas partes
por milln de la protena del producto. La presencia de variantes no deseadas de la protena
diana ha motivado el desarrollo de tcnicas para detectar y separar (a gran escala) protenas
modificadas en uno de varios cientos de aminocidos.
La dificultad de separacin puede a menudo disminuirse cambiando el organismo o las
condiciones de cultivo para producir una protena ms uniforme. Sin embargo, todava es
necesario combinar una serie de etapas de purificacin cada una de las cuales se separa de
acuerdo con un principio diferente. A menudo se utilizan pasos de ultrafiltracin entre las
etapas de separacin para concentrar la solucin de protena o para hacer la solucin
tampn compatible con la siguiente etapa de separacin. Los pasos finales estn diseados
para colocar la protena purificada en la solucin utilizada para la forma del producto.
La complejidad de los pasos de purificacin individuales y la necesidad de poder
integrarlos en un sistema de fabricacin se convierten en una gran oportunidad para la
ingeniera de bioprocesamiento a medida que el proceso se mueve desde el banco a la
planta. La investigacin y el desarrollo en la purificacin, la ampliacin de la integracin y
el diseo del sistema seguirn teniendo una alta prioridad.

4.1.12. Formulacin del Producto

La formulacin del producto es una parte importante ya menudo pasada por alto en el
desarrollo del bioproceso. La protena del producto debe estar en una forma que es estable,
es conveniente de usar, y permite que el frmaco se suministre de la manera
deseada. Varios de los productos de rDNA iniciales estaban en forma liofilizada, que es
relativamente estable, pero inconveniente. Los productos biofarmacuticos ms recientes
estn en forma lquida.
Para las protenas liofilizadas, es necesario desarrollar un procedimiento de congelacin,
secado y tapado cuidadosamente controlado. El equipo est diseado y probado para
proporcionar condiciones uniformes en toda la cmara de liofilizacin. Para las
formulaciones lquidas, la produccin se simplifica, pero la seleccin de los componentes
de la solucin es mucho ms difcil. Primero, las reacciones adversas deben ser
identificadas para cada producto proteico. Los ensayos deben ser desarrollados con alta
sensibilidad y precisin para detectar productos de degradacin. Finalmente, las
condiciones deben ser rastreadas para encontrar aquellas que permitan una vida til estable
de por lo menos un ao. Los resultados de estabilidad pueden indicar que la protena
necesita purificarse ms antes de la formulacin, por ejemplo, para eliminar de forma ms
completa la proteasa problema.

4.1.13. Necesidades de investigacin

La tecnologa para bioprocesos en la fabricacin de productos biofarmacuticos abarca una
amplia gama de disciplinas biolgicas, qumicas y de ingeniera. Hay muchas
oportunidades de investigacin dentro de esta gama, y las necesidades industriales ms
importantes actuales se enumeran a continuacin. El comit recomienda que la financiacin
de la investigacin se asignen a los temas enumerados aqu a travs de un programa de
subvenciones competitivas. Creemos que estructurar la investigacin de una manera que
requiera una interaccin industria-universidad o industria-gobierno catalizara ms
investigacin y ayudara a promover enfoques que son relevantes tanto para la
investigacin genrica como para las futuras necesidades de personal de las industrias en
desarrollo. Adems de fomentar el desarrollo de una base fundamental de conocimientos de
ingeniera y de nuevas tecnologas orientadas a la fabricacin de bioprocesos,
Las herramientas biolgicas y bioqumicas son necesarias y requerirn investigacin para
Desarrollar herramientas para la expresin, modificacin y secrecin de protenas
heterlogas de clulas procariotas y eucariotas. Esto incluye el estudio de la translocacin
y doblado de protenas en E. coli , la insercin estable de genes extraos en clulas de
mamferos, la eliminacin de la produccin de proteasa y el desarrollo de herramientas
para el uso de nuevos organismos para la expresin de genes heterlogos.
 Modificar protenas in vivo a travs de la ingeniera de protenas. Esto incluye el estudio de
mecanismos qumicos e influencias ambientales que afectan la modificacin de protenas
y mtodos para el cribado de variantes de protenas que tienen diferentes actividades
biolgicas.

El procesamiento de upstream requerir investigacin para

Desarrollar dispositivos y procedimientos mejorados para cribar las actividades biolgicas
de nuevas protenas u otros compuestos. Esto puede incluir cultivos primarios
prolongados de organismos, tejidos, grupos de clulas o lneas celulares individuales y
procedimientos in vitro usando porciones relevantes del sistema inmune para evaluar la
inmunogenicidad de compuestos nuevos o modificados.
Desarrollar una tecnologa que mejore la estabilidad de protenas y clulas expuestas a
interfaces dinmicas gas-lquido.
Desarrollar tecnologa de ensayo en lnea que reconozca la calidad y la cantidad de
protenas recombinantes.
Sistemas de contencin del ingeniero para su uso en la fabricacin.
Disear una capacidad de bombeo estril y de baja cizalladura para reactores de reciclado
a gran escala.
Desarrollar modelos predictivos para aumentar la escala de los reactores de tanque
agitado y de elevacin neumtica que consideren cambios potenciales de las limitaciones
cinticas a las limitaciones de transporte en escala.

Desafos en downstream de procesamiento son a

Desarrollar tecnologas de purificacin de protenas de alta resolucin que ofrecen el
grado de resolucin proporcionado por la HPLC de fase inversa, pero que son fcilmente
escalables y no requieren disolventes que sean costosos y difciles de eliminar.
Mejorar las tecnologas de separacin de protenas basadas en el tamao molecular. Las
tecnologas deben proporcionar una buena resolucin y una operacin econmica (es
decir, tienen altas tasas de rendimiento especfico).
Desarrollar capacidades rpidas de anlisis en lnea y fuera de lnea para evaluar las
protenas husped contaminantes y el ADN a concentraciones de partes por milln, las
variantes de la protena del producto y la actividad biolgica relativa.
Integrar el monitoreo rpido, la deteccin en lnea de productos bioespecficos y las
secuencias de purificacin de mltiples etapas para obtener sistemas automatizados de
purificacin.
Desarrollar algoritmos de diseo computarizado integrados para la optimizacin
computarizada de las secuencias de purificacin.

Otras tecnologas que necesitan ser desarrolladas incluyen mtodos para

Formulacin lquida estable de protenas farmacuticas.
 Modificaciones precisas de protenas para producir protenas complejas modificadas
homogneamente con efectos biolgicos precisos.
Administracin no parenteral de productos farmacuticos proteicos, incluyendo capacidad
de liberacin sostenida; algunos productos farmacuticos tambin podran beneficiarse de
la liberabilidad de una manera pulstil.
Caracterizacin de los costos operacionales y de capital para permitir una estimacin
precisa y rpida del costo total del proceso.

La mayora de la fabricacin biolgica (al menos de productos de alto valor) se lleva a cabo
ahora en lotes pequeos. A medida que los productos biofarmacuticos crecen en volumen
y escala y como el costo se vuelve ms importante en la rentabilidad a largo plazo, el
desarrollo de sistemas de fabricacin eficientes e integrados ser ms importante en la
ingeniera de bioprocesos. Todas las cuestiones que ahora se tratan en otros tipos de
fabricacin -desarrollo para fabricacin, fabricacin intrnseca, sistemas integrados de
sensores y controles y sistemas integrados de procesamiento de informacin para la
fabricacin- sern relevantes para el bioprocesamiento. El desarrollo de los sistemas
sensores apropiados es probablemente el elemento clave en las primeras etapas de sistemas
de fabricacin biolgica administrados por computadora.
Un bioproceso es un proceso especfico que utiliza clulas vivas completas o sus
componentes (por ejemplo, bacterias , enzimas , cloroplastos ) para obtener los productos
deseados.
El transporte de energa y masa es fundamental para muchos procesos biolgicos y
ambientales. reas, desde la elaboracin de alimentos para el diseo trmico de la
construccin de dispositivos biomdicos de control de la contaminacin y el calentamiento
global , requieren el conocimiento de cmo la energa y la masa pueden ser transportados a
travs de materiales (masa, el momento, la transferencia de calor).
El bioprocesamiento de terapia celular es una disciplina que puentea los campos de terapia
celular y bioprocesamiento (es decir, fabricacin biofarmacutica), y es un sub-campo de
la ingeniera de bioprocesos . Los objetivos del bioprocesamiento de terapia celular son
establecer procesos de fabricacin reproducibles y robustos para la produccin de clulas
teraputicas. [1] [2] Los bioprocesos comercialmente relevantes:

1. Producir productos que mantienen todos los estndares de calidad de los

medicamentos biofarmacuticos [3]
2. Suministrar tanto clnicas y comerciales cantidades de clulas teraputicas a lo largo
de las diversas etapas de desarrollo. Los procesos y las tecnologas de produccin
deben ser escalables, [2] and
3. Controlar el costo de los bienes (GdC) del producto farmacutico final. Este aspecto es
crtico para construir las bases para una industria comercialmente viable.

Bioprocesamiento ascendente [ editar ]

Los procesos de fabricacin de clulas teraputicas se pueden separar en procesos
ascendentes y procesos descendentes. El proceso ascendente se define como todo el
proceso desde el aislamiento y cultivo temprano de las clulas, hasta la expansin de las
clulas y la expansin de las clulas hasta la cosecha final (terminacin del cultivo y recogida
del lote de clulas vivas).
Aparte de los desafos tecnolgicos, relativos a la escalabilidad de los aparatos de cultivo, en
los ltimos aos han surgido varios riesgos de suministro de materias primas, incluida la
disponibilidad de suero bovino fetal de calidad GMP .
La parte aguas arriba de un bioproceso se refiere a la primera etapa en la que se crecen
microbios / clulas, por ejemplo, lneas celulares bacterianas o de mamferos (vase cultivo
celular ), en biorreactores . El procesamiento ascendente implica todos los pasos relacionados
con el desarrollo del inculo, el desarrollo de los medios, la mejora del inculo mediante el
proceso de ingeniera gentica, la optimizacin de la cintica de crecimiento para que el
desarrollo del producto pueda mejorar enormemente. La fermentacin tiene dos partes: aguas
arriba y aguas abajo. Despus del desarrollo del producto, el siguiente paso es la purificacin
del producto para la calidad deseada. Cuando alcanzan la densidad deseada (para lotes y
cultivos discontinuos alimentados) se recogen y se mueven a la seccin corriente abajo del
bioproceso.

Bioprocesamiento aguas abajo [ editar ]

La parte corriente abajo de un bioproceso se refiere a la parte en la que la masa celular de la
corriente ascendente se procesa para cumplir los requisitos de pureza y calidad. El
procesamiento aguas abajo se divide generalmente en tres secciones principales: disrupcin
celular, una seccin de purificacin y una seccin de pulido. Los productos voltiles pueden
separarse por destilacin del cultivo cosechado sin pretratamiento. La destilacin se realiza a
presin reducida en alambiques continuos. A presin reducida puede ser posible la destilacin
del producto directamente del fermentador. Los pasos del procesamiento de abajo son:

1. Separacin de la biomasa: separacin de la biomasa (clulas microbianas)

generalmente realizada por centrifugacin o ultra-centrifugacin. Si el producto es
biomasa, entonces se recupera para su procesamiento y se descarta el medio
gastado. Si el producto es extra celular la biomasa ser descartada. La ultrafiltracin
es una alternativa a la centrifugacin.
2. Interrupcin celular: Si el producto deseado es intracelular, la biomasa celular puede
ser interrumpida para que el producto sea liberado. El slido-lquido se separa por
centrifugacin o filtracin y los desechos celulares se descartan.
3. Concentracin de caldo: El medio gastado se concentra si el producto es extracelular.
4. Purificacin inicial de los metabolitos: De acuerdo con la naturaleza fsico-qumica de
la molcula del producto se utilizaron varios mtodos para la recuperacin del
producto del caldo fermentado clarificado (precipitacin, etc.)
5. Deshidratacin: Si se encuentra una cantidad baja de producto en un volumen muy
grande de medio gastado, se reduce el volumen eliminando agua para concentrar el
producto. Se realiza por secado al vaco o por smosis inversa.
6. Pulido de metabolitos: este es el paso final de hacer el producto 98 a 100% puro. El
producto purificado se mezcla con varios ingredientes inertes llamados excipientes. El
producto formulado se envasa y se enva al mercado para los consumidores.