PENGUKURAN AKTIVITAS AMILASE

Oleh:
Nama : Shinta Prabawati
NIM : B1J014049
Rombongan : II
Kelompok :2
Asisten : Ristiandani Riana P.

LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI NUTRISI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2016
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Ikan Nilem (Osteochilus vittattus) merupakan salah satu hewan vertebrata yang
hidup di air tawar dan bernafas dengan insang. Ikan Nilem menurut Sunarma (2007)
merupakan spesies indegenous yang dapat ditemukan di pulau Sumatra, Jawa, dan
Kalimantan. Ikan ini digolongkan kedalam ikan omnivora karena memakan tumbuh-
tumbuhan dan hewan-hewan kecil. Jenis pakan yang dikonsumsi ikan berhubungan
dengan pencernaan dan absorbsi ikan (Syarifah et al., 2014).
Ikan Lele (Clarias batrachus) memiliki tubuh licin, agak pipih, dan
memanjang. Ikan ini juga memiliki sungut yang panjang pada bagian dekat mulutnya.
Ikan Lele mampu bertahan hidup di tempat tercemar karena kemampuannya
menghilangkan kotoran-kotoran. Habitatnya di sungai dengan arus air yang perlahan,
rawa, telaga, waduk, dan sawah yang tergenang air. Ikan Lele tergolong dalam ikan
omnivor yang pakan utamanya merupakan campuran dari hewan dan tumbuhan
(Brotowidjoyo, 1993).
Ikan pada umumnya tidak memiliki kelenjar air liur yang menghasilkan enzim,
sehingga tidak ada proses pencernaan pada rongga mulutnya. Sistem pencernaan ikan
dimulai di usus bagian depan. Usus ikan mampu menghasilkan enzim pencernaan yang
berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat proses pencernaan. Enzim yang
berperan dalam proses pencernaan salah satunya adalah amilase. Enzim Amilase
mengkatalisis pemecahan nutrien komplek berupa karbohidrat menjadi nutrien yang
lebih sederhana. Aktivitas amilase semakin meningkat dengan meningkatnya umur
ikan (Syarifah et al., 2014).
Aktivitas enzim pada umumnya dipengaruhi oleh kondisi pemuasaan pada
ikan. Hasil penelitian menunjukkan adanya penurunan aktivitas enzim pencernaan
pada ikan yang dipuasakan, namun pemberian pakan kembali mampu
mengembalikan aktivitas enzim pencernaan. Aktivitas amilase lebih cepat
mengalami pemulihan dibanding enzim lainnya setelah pemberian pakan kembali
(Pratiwi et al., 2013). Ikan Lele (Clarias batrachus) dan ikan Nile (Osteochilus
vittatus) dipilih sebagai preparat dikarenakan harganya yang murah, mudah
diperoleh, memiliki ukuran tubuh cukup besar, mudah dipelihara, dan
keberadaannya yang melimpah sehingga tidak mengganggu ekosistem.
1.2 Tujuan

Tujuan praktikum acara Pengukuran Aktivitas Amilase pada Ikan Lele

(Clarias batrachus) dan Ikan Nilem (Osteochilus vittatus) adalah mengukur perbedaan
kapasitas pencernaan ikan yang terukur sebagai aktivitas amilase pada ikan yang diberi
pemuasaan dengan ikan yang diberi pakan.
 II. MATERI DAN CARA KERJA

2.1 Materi
Alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu tabung reaksi, tabung eppendorf,
mikropipet, blue tip, yellow tip, inkubator, vortex, spektrofotometer, bak plastik,
kompor, panci, wadah, dan kamera.
Bahan yang digunakan meliputi kertas tisu, ekstrak enzim dari ikan Nilem
(Osteochilus vittatus) dan ikan Lele (Clarias batrachus) dengan pemuasaan dan
pemberian pakan, es balok, buffer fosfat, substrat amilum, reagen DNS (asam
dinitrosalisilat), air, akuabides, dan label.

2.2 Cara Kerja

Metode yang digunakan pada percobaan kali ini yakni:
1. Tabung reaksi sejumlah 6 dipersiapkan dan diberi label (2 untuk sampel dan 1
untuk blanko, masing-masing pada perlakuan pemuasaan dan pemberian pakan.
2. Buffer fosfat ditambahkan sebanyak 350 l masing-masing untuk sampel dan
blanko.
3. Ekstrak enzim sebanyak 50 l ditambahkan pada tabung sampel.
4. Semua campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37C.
5. Substrat amilum sebanyak 350 l selanjutnya ditambahkan pada masing-masing
tabung sampel dan blanko.
6. Semua campuran tersebut diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37C.
7. Reagen DNS sebanyak 750 l ditambahkan ke dalam masing-masing tabung
sampel dan blanko.
8. Ekstrak enzim sebanyak 50 l ditambahkan ke dalam tabung blanko.
9. Semua campuran dididihkan selama 5 menit pada suhu 100 C.
10. Semua campuran didinginkan selama 20 menit dan ditambah akuabides 1500 l.
11. Semua campuran dihomogenkan dengan vortex.
12. Campuran yang telah homogen diukur absorbansinya dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 540 nm.
13. Aktivitas amilase dihitung menggunakan kurva standard maltosa yang
diperoleh.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Tabel 1. Berat Usus dan Berat Tris HCl Ikan Makan dan Ikan Puasa
No Eppendorf No Eppendorf Berat Tris
Jenis Berat Usus
Kel. Sebelum Setelah HCl (x8)
Ikan (gram)
Sentrifugasi Sentrifugasi (gram)
Lele 41-42 21-22 0.9 7.2
1 makan
Lele 43-44 23-24 1.42 11.36
puasa
Lele 45-46 25-26 0.6 4.8
2 makan
Lele 47-48 27-28 0.39 3.12
puasa
Nilem 49-50 29-30 0.57 4.56
3 makan
Nilem 51-52 31-32 0.95 7.6
puasa

Keterangan:
Berat Usus : Berat Tris HCl = 1 : 8

Tabel 2. Hasil Absorbansi Blanko dan Sampel Protease Ikan Makan dan Ikan
Puasa
No Tabung Absorbansi Konsentrasi
1 2.363 0.920
2 2.278 0.748
3 1.969 0.127
4 2.165 0.521
5 2.072 0.335
6 1.992 0.173
7 2.148 0.488
8 2.271 0.735
9 2.030 0.251
10 2.351 0.896
11 2.532 1.259
 12 2.042 0.275
13 3.821 3.850
14 3.694 3.595
15 1.986 0.161
16 3.224 2.650
17 3.563 3.331
18 2.114 0.419

Keterangan:
= Blanko kelompok 1, 2, dan 3
= Sampel kelompok 1 ikan makan dan puasa
= Sampel kelompok 2 ikan makan dan puasa
= Sampel kelompok 3 ikan makan dan puasa

Tabel 3. Hasil Absorbansi Larutan Standar

Nomor Absorbansi Konsentrasi
1 1.947 0.210
2 2.057 0.420
3 2.457 0.840
4 2.798 1.680
5 3.506 3.360

Tabel 4. Hasil Pengukuran Aktivitas Amilase Ikan Makan dan Ikan Puasa
Hasil Ikan Makan Ikan Puasa
Konsentrasi sampel 1 0.488 g 0.896 g
Konsentrasi sampel 2 0.735 g 1.259 g
Konsentrasi blanko 0.251 g 0.275 g
Aktivitas enzim 0.3605 g 0.8025 g
Aktivitas enzim permenit 0.024 g/menit 0.053 g/menit
Perhitungan kelompok 2
1 + 2
Aktivitas enzim dalam konsentrasi (x) =
2

Aktivitas enzim dalam menit = (15 )

A. Ikan makan
1 + 2
X =
2

0.488 + 0.735
= 0.251
2

= 0.6115 0.251
= 0.3605 mikrogram

Aktivitas enzim dalam menit =
(15 )

0.3605
= 15

= 0.024 mikrogram/menit
B. Ikan puasa
1 + 2
X =
2

0.896 + 1.259
= 0.275
2

= 1.0775 0.275
= 0.8025 mikrogram

Aktivitas enzim dalam menit =
(15 )

0.8025
= 15

= 0.053 mikrogram/menit
3.2 Pembahasan

Percobaan yang dilakukan oleh kelompok 2 rombongan II menggunakan ikan

Lele (Clarias batrachus) dan ikan Nilem (Osteochilus vittatus) dengan pemuasaan dan
pemberian pakan. Aktivitas enzim amilase selanjutnya diukur dengan menggunakan
metode hidrolisis amilum dan dibandingkan untuk mengetahui perbedaannya. Hasil
konsentrasi ikan makan sampel 1 sebesar 0.488 g, sampel 2 sebesar 0.735 g, dan
blanko sebesar 0.251 g, sementara konsentrasi ikan puasa sampel 1 sebesar 0.896 g,
sampel 2 sebesar 1.259 g, dan blanko sebesar 0.275 g. Hasil tersebut selanjutnya
digunakan untuk menghitung aktivitas enzim dalam konsentrasi dengan rumus X =
1 + 2
, sehingga diperoleh aktivitas enzim dalam
2

konsentrasi ikan makan sebesar 0.3605 g dan aktivitas enzim dalam konsentrasi ikan
puasa sebesar 0.8025 g. Aktivitas enzim dalam menit kemudian dihitung dengan
rumus :

aktivitas enzim dalam menit = , sehingga diperoleh
(20 )

hasil pada ikan makan sebesar 0.024 g/menit dan hasil pada ikan puasa sebesar 0.053
g/menit. Hasil dari perhitungan tersebut menunjukkan bahwa aktivitas enzim amilase
per menitnya pada ikan makan lebih rendah dari ikan puasa. Hal tersebut tidak sesuai
dengan referensi yang menunjukkan bahwa konsentrasi substrat yang lebih tinggi akan
meningkatkan kerja dari enzim. Ikan makan memperoleh substrat berupa
amilum/karbohidrat dari pakannya, sementara ikan puasa tidak memperoleh asupan
karbohidrat, sehingga dapat dipastikan substrat berupa karbohidrat pada ikan makan
lebih tinggi daripada ikan puasa. Hal tersebut dapat disebabkan karena beberapa faktor
seperti umur ikan, kualitas pakan, perbedaan volume akuades, dan kekurangtelitian
praktikan. Aktivitas amilase semakin meningkat dengan meningkatnya umur ikan.
Perbedaan volume akuades yang diberikan akan menyebabkan perbedaan warna
sehingga berpengaruh pada nilai absorbansi dan konsentrasi dari hasil
spektrofotometer (Radiopoetro, 1998).
Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi untuk
mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tumbuhan tanpa
mempengaruhi keseimbangan reaksi. Enzim tidak ikut bereaksi, struktur enzim tidak
berubah baik sebelum dan sesudah reaksi tetap. Enzim sebagai biokatalisator dan
bagian enzim yang aktif adalah sisi aktif dari enzim. Amilase merupakan enim
pencernaan yang membantu dalam pemecahan karbohidrat dengan merusak ikatan
antara molekul gula pada polisakarida melalui reaksi hidrolisis. Pemecahan
karbohidrat menjadi gula penting untuk membuat sumber energi yang tersedia untuk
tubuh (Bhilave et al., 2014).
Hewan yang menghasilkan sejumlah besar enzim pencernaan akan sia-sia
karena rendahnya substrat untuk enzim tersebut. Ikan herbivora sering menunjukkan
aktivitas karbohidrase yang lebih tinggi, sedangkan ikan karnivora sering
menunjukkan aktivitas enzim proteolitik yang lebih tinggi. Aktivitas enzim
pencernaan pada ikan yang bervariasi antar spesies dan dapat dipengaruhi oleh usia
maupun oleh kuantitas dan komposisi pakan. Hubungan filogenetik juga dapat
memengaruhi aktivitas enzim pencernaan. (German et al., 2004).
Hidrolisis adalah proses dekomposisi kimia dengan menggunakan air untuk
memisahkan ikatan kimia dari substansinya. Hidrolisis pati merupakan proses
pemecahan molekul amilum menjadi bagian-bagian penyusunnya yang lebih
sederhana seperti dekstrin, isomaltosa, maltosa dan glukosa. Proses hidrolisis
dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu: enzim, ukuran partikel, temperatur, pH, waktu
hidrolisis, perbandingan cairan terhadap bahan baku (volume substrat), dan
pengadukan. Untuk mengidentifikasi hasil hidrolisis amilum menurut referensi
digunakan larutan amilum 1%, larutan iodium, pereaksi Benedict, larutan HCl 2 N,
dan larutan NaOH 2%. Amilum ditambahkan dengan HCl lalu dipanaskan. Uji iodium
dilakukan setiap 3 menit hingga warnanya berubah jadi kuning pucat, kemudian
larutan dihidrolisis lagi selama 5 menit lalu didinginkan dan dinetralkan dengan NaOH
2%. Larutan selanjutnya diuji dengan pereaksi Benedict (Steel & Torrie, 1993)
Metode yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah metode hidrolisis
amilum. Metode ini menggunakan penambahan buffer fosfat sebagai larutan
penyangga enzim dan substrat. Amilum yang ditambahkan berfungsi sebagai substrat
yang akan didigesti gula. Ekstrak enzim yang digunakan berfungsi sebagai sumber
amilase dalam pemecahan substrat amilum menjadi gula. Reagen DNS (asam
dinitrosalisilat) memiliki fungsi untuk menghentikan kerja dari enzim amilase.
Akuabides digunakan untuk mengencerkan larutan. Larutan standar yang digunakan
berupa larutan maltosa standar yang telah diencerkan dengan akuabides, maltosa
merupakan hasil digesti dari amilum. Waktu inkubasi pertama dilakukan selama 10
menit untuk mengaktivasi enzim amilase, sementara waktu inkubasi kedua dilakukan
selama 15 menit untuk mengoptimalkan kerja enzim amilase. Suhu yang digunakan
saat inkubasi sebesar 37 C dan harus tetap stabil, oleh karena itu digunakan inkubator
untuk menjaga suhu tetap 37 C. Larutan yang akan diukur absorbansinya
dihomogenkan terlebih dahulu menggunakan vortex. Larutan yang telah homogen
akan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 540 nm (Radiopoetro, 1998).
Perbedaan perlakuan pengukuran aktivitas protease dengan aktivitas amilase
terletak pada reagen yang digunakan, jenis enzim yang berperan, substrat, waktu
inkubasi, larutan penyangga, jenis larutan standar, dan panjang gelombang yang
digunakan. Enzim yang berperan dalam pengukuran aktivitas protease berupa enzim
protease, sementara enzim yang berperan dalam pengukuran aktivitas amilase berupa
enzim amilase. Substrat enzim amilase berupa amilum, sementara substrat enzim
protease berupa kasein. Larutan penyangga pada protease menggunakan buffer Tris-
HCl, sedangkan pada amilase menggunakan larutan buffer fosfat. Asam trichloroacetat
(TCA) digunakan pada protease, sementara asam dinitrosalisilat (DNS) digunakan
pada amilase, fungsi dari kedua larutan tersebut adalah untuk menghentikan kerja
enzim. Waktu inkubasi untuk mengoptimalkan kerja protease adalah 20 menit,
sedangkan untuk amilase hanya 15 menit. Larutan standar protease berupa tirosin
standar, sedangkan pada amilase berupa maltosa standar. Panjang gelombang 280 nm
digunakan pada protease, sementara panjang gelombang 540 digunakan pada amilase
(Radiopoetro, 1998).
 IV. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

aktivitas amilase pada ikan makan lebih tinggi dari ikan puasa karena konsentrasi
substrat yang lebih tinggi akan meningkatkan kerja dari enzim. Faktor yang dapat
mempengaruhi aktivitas dari amilase diantaranya kualitas pakan dan umur ikan.
 DAFTAR REFERENSI

Bhilave, M. P., V.b Nalawade, & J.J. Kulkarni. 2014. Amylase activity of fingerlings
of freshwater fish Labeo rohita fed on formulated feed. International Journal
of Fisheries and Aquatic Studies, 2(1): 53-56.

Brotowidjoyo, M. 1993. Zoologi Dasar. Erlangga, Jakarta.

German D. P., Michael H. H., Anna G. 2004. Digestive Enzyme Activities in

Herbivorous and Carnivorous Prickleback Fishes (Teleostei: Stichaeidae):
Ontogenetic, Dietary, and Phylogenetic Effects. Department of Biological
Science, California State University, Fullerton, California.

Pratiwi, E. S., Untung S., dan Slamet P. 2013. Aktivitas Amilase dan Laju
Metabolisme Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) pada Kondisi Puasa dan
Pemberian Pakan Kembali. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto.

Radiopoetro. 1988. Zoologi. Jakarta: Erlangga.

Steel RGD, Torrie JH. 1993. Prinsip dan prosedur statistik : suatu pendekatan
biometric [diterjemahkan oleh Sumantri B]. Edisi kedua. Jakarta: PT. Eas West
Seed Indonesia Gramedia Utama.

Sunarma A, Hastuti DWB, Sistina Y. 2007. Penggunaan ekstender madu yang

dikombinasikan dengan krioprotektan berbeda pada pengawetan sperma ikan
Nilem (Indonesian Sharkminnow, Osteochilus hasseltii Valenciennes 1842).
Makalah dipresentasikan pada: Konferens.

Syarifah F. A. G., Untung S., Slamet P. 2014. Aktivitas Protease dan Amilase pada
Hepatopankreas dan Intestine Ikan Nilem (Osteochilus hasselti). Scripta
Biologica, 1(1): 43-48.