Carla Roberta Pergiosa

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Tecnologia Bioqumico-Farmacutica
rea de Tecnologia Qumico-Farmacutica
Bioprocessos e bioindicadores de tratamento e monitoramento de

guas: desenvolvimento e aplicaes
Carla Roberta da Silva Neves dos Santos
Dissertao para obteno do grau de

MESTRE
Orientadora:
Prof.. Dr. Thereza Christina Vessoni Penna
So Paulo
2016
Bioprocessos e bioindicadores de tratamento e monitoramento de

guas: desenvolvimento e aplicaes
Comisso Julgadora
da
Dissertao para obteno do grau de Mestre
Prof.. Dr. Thereza Christina Vessoni Penna

Orientadora/presidente
____________________________
1o. examinador
____________________________
2o. examinador
____________________________
3o. examinador
____________________________
4o. examinador
So Paulo, ___________ de _____.

Quem acende uma luz o primeiro a
Beneficiar-se da claridade.
Gilbert Cherterton
AGRADECIMENTOS
- Em primeiro lugar agradeo a Deus, que me deu sade e bom nimo, para que
fosse possvel chegar at aqui.
- Aos meus pais, sem os quais esse trabalho no seria possvel.
- Ao meu grande amigo e companheiro Diego Leandro P. de Sousa por todo amor,
carinho, incentivo e pela colaborao com a reviso deste trabalho.
- Ao Professor Dante Augusto Moraes, pelo convite para o ingresso na carreira
acadmica, amizade e incentivo.
- Premente, Justo e agradvel lembrar tambm dos professores que compuseram
minha banca de defesa: Thereza Christina Vessoni Penna, Ricardo Pinheiro de
Souza Oliveira, Joaquim Aparecido Machado.
Aos professores Joaquim Aparecido Machado e Ricardo Pinheiro de Souza
Oliveira, agradeo em especial, pois no apenas contriburam de maneira
enriquecedora com as reflexes deste trabalho, como tambm ajudaram de forma
generosa na organizao e simplificao do mesmo.
A professora Thereza Christina Vessoni Penna, pelo apoio constante durante
a vida acadmica, com a qual, pude aprender muito mais do que a mesma possa
imaginar! Aprendi, no apenas sobre cincia, mas tambm sobre perseverana,
amor, dedicao e esperana. Deixo aqui o meu muito obrigada pelo grande
exemplo.
- A Professora Dr. Marina Ishii pelo apoio e colaborao nos laboratrios de

Microbiologia Aplicada e Fsica Industrial.
- Ao Professor Dr. Marco Antnio Sthephano, pelas aulas inspiradoras de
biotecnologia, e pelos reagentes qumicos.
- As Professoras Dr. Carlota O. Rangel Yagui e Dr. Gisele Monteiro de Sousa por
todas as orientaes e ajudas ao longo do curso.
- A professora Dr. Waldely de Oliveira Dias, do laboratrio de biotecnologia do
Instituto Butantan, por ter me dado a primeira oportunidade para trabalhar com
biotecnologia, e a minha amiga Eliane Pessoa, pela companhia apoio e
ensinamentos, durante o meu estgio como IC.
- As alunas de iniciao cientfica: Julia Lima Ariosvaldo, Giovanna Ribeiro Dos
Santos e Maria Conceio Procpio.
- Aos colegas de laboratrio: Norberto Vieira, e a aluna especial Cristina Mendes.
- Aos demais colegas do Departamento de Tecnologia Bioqumico-Farmacutica,
pela colaborao vida acadmica.
- Aos funcionrios da secretaria de ps-graduao. E aos chefes de segurana e
manuteno pelo excelente trabalho, cuidado e amizade.
- A CAPES pelo incentivo com uma bolsa de estudos.
RESUMO
SANTOS, C. R. S. N. Bioprocessos e bioindicadores de tratamento e

monitoramento de guas: desenvolvimento e aplicaes. 2016. 92f. Dissertao
(Mestrado) Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo,
So Paulo, Brasil. 2016.
Atualmente, a m qualidade da gua continua a representar uma grande

ameaa para a sade humana, causando doenas graves, como diarreias, e
diversos tipos de cncer devido a ingesto de compostos aromticos e metais
pesados. Estima-se que 88% dos casos dessas doenas sejam atribudos ao
abastecimento de gua inseguro, saneamento e higiene. Este fato, em grande parte,
deve-se ao mal controle de qualidade das guas tratadas. Assim, atualmente, uma
das principais preocupaes no estabelecimento de ndices de qualidade de gua,
seja em base biolgica ou atravs de mtodos fsico-qumicos e matemticos,
tornar as avaliaes ecolgicas com fins de rotina aplicveis para pessoal no
especializado. O presente trabalho, visando oferecer sociedade subsdios para a
adoo de tecnologias alternativas de tratamento e monitoramento de qualidade de
guas, realizou uma anlise sobre os potenciais dos Gros de kefir e da planta
kalanchoe pinnata como elementos bioindicadores de qualidade de guas tratadas,
por meio de biorremediao com o micro-organismo Bacillus subtilis, e guas
tratadas na Unidade de beneficiamento de guas (UPIBA). Os resultados dos
experimentos evidenciaram que os gros de kefir geraram respostas biolgicas
distintas, quando submetidos a diferentes concentraes de benzeno, presente em
guas biorremediadas com o B. subtilis. E os ensaios aplicando a K. pinnata como
agente bioindicador de qualidade de guas pluviais e SABESP, sugeriram que a
mesma pode ser uma excelente bioindicadora em guas eutrofizadas, isto , ricas
em matria orgnica.
Palavras-chave: Benzeno; kalanchoe pinnata; Biorremediao; indicadores

biolgicos; Gros de kefir .
ABSTRACT
SANTOS, C. R. S. N. Bioprocesses and bioindicators of water treatment and

monitoring: development and applications. 2016. 92f. Dissertao (Mestrado)
Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo, So Paulo,
Brasil. 2016.
Currently, poor quality water continues to pose a major threat to human

health, causing serious illnesses such as diarrhea and various types of cancer due to
the ingestion of aromatic compounds and heavy metals. It is estimated that 88% of
these diseases cases are caused by unsafe water supply, sanitation and hygiene.
This is largely due to poor quality control of treated water. Thus, currently, one of the
major concerns in establishing water quality indicators, whether on a biological basis
or through physical-chemical and mathematical methods, is to make routine
ecological assessments applicable to non-specialized personnel. The present paper,
aiming to offer society subsidies for the adoption of alternative technologies for
treating and monitoring water quality, carried out an analysis on the potentials of kefir
grains and the kalanchoe pinnata plant as bioindicators of the quality of water treated
by means of Bioremediation with the microorganism Bacillus subtilis and treated
water in the UPIBA. The experiments results showed that the kefir grains generated
different biological responses when submitted to different concentrations of benzene,
present in bioremediated waters with B. subtilis. And trials applying K. pinnata as a
bioindicator of rainwater quality and SABESP, have suggested that it may be an
excellent bioindicator in eutrophic waters, that is, rich in organic matter.
Keywords: Benzene; Kalanchoe pinnata; Bioremediation; Biologicals indicators; Kefir

Grains.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Macroinvertebrados bentnicos .. .......................................................... 24

Figura 2 - Florao de Algas Nocivas ..................................................................... 29
Figura 3- Ecossistemas eutrofizados......................................................................30
Figura 4 - Estrutura molecular do Kefirano (A) e Dextrano (B)................................31
Figura 5 - Gros de kefir. ........................................................................................ 32
Figura 6 - Microscopia eletrnica de gros de Kefir em gua e em leite. ............... 33
Figura 7 - Espectro de varredura para Benzeno na regio UV............................... 41
Figura 8 - Curva de calibrao para Benzeno no meio de deteco ...................... 42
Figura 9 - Fluxograma do ensaio de validao do sistema com Gros de Kefir. ... 44
Figura 10 - Vista lateral do biorreator New Brunswick .............................................. 48
Figura 11 - Correlao entre absorbncia medida a 660nm e concentrao ........... 50
Figura 12 - Curva de crescimento do Bacillus subtilis ATCC 6051...........................51
Figura 13 - biodegradao de Benzeno por Bacillus subtilis .................................... 52
Figura 14 Resultados da fermentao em biorreator. ........................................... 54
Figura 15 - Pistia stratiotes (Alface-d'gua) e outras macrfitas .............................. 60
Figura 16 - Tanque de biofiltrao com Pistia stratiotes (Alface-d'gua) ................. 62
Figura 17 - K. pinnata com suas razes em evidncia .............................................. 68
Figura 18 - identificao das folhas de Kalanchoe pinnata ...................................... 69
Figura 19 - Folhas de Kalanchoe pinnata identificadas. ........................................... 70
Figura 20 - Contagem em UFC/mL (100) Sabesp + UV+ O3 .................................... 73
Figura 21 - Contagem em UFC/mL (10-2) Sabesp + UV+ O3 ................................... 73
Figura 22 - Contagem em UFC/mL (10-0 a 10-3) Chuva + UV+ O3 ........................... 74
Figura 23 - Contagem em UFC/mL gua deionizada com lcool 70% .................... 74
Figura 24 - Contagem em UFC/mL gua deionizada com lcool 70%. .................... 74
Figura 25 - Membrana com gua SABESP beneficiada na UPIBA ......................... 75
Figura 26 - Kalanchoe pinnata micropropagada em terra enriquecida ..................... 77
Figura 27- Amostras 1 e 2 de Kalanchoe pinnata..................................................... 79
Figura 28 - Amostras 3 e 4 de Kalanchoe pinnata.................................................... 79
Figura 29 - Amostras 5 e 6 de Kalanchoe pinnata.................................................... 80
Figura 30 - K. pinnata (todas as folhas com tamanhos variados)............................. 80
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BH Bushnell-Haas
QSP Quantidade suficiente para
UPIBA Unidade Piloto de Beneficiamento de gua
BTEX Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno, Xileno
UV Ultravioleta
mN/m millinewton meter
USEPA United States Environmental Protection Agency
CMC Concentrao Micelar Critica
UPIBA Unidade Piloto de Beneficiamento de gua
TSB Tryptone Soya Broth
TSA Tryptophan Broth Agar
NMP Nmero Mais Provvel
IB Indicador Biolgico
DBO Demanda Bioqumica de Oxignio
KLa Coeficiente de Transferncia de Oxignio
VMP Valor Mximo Permitido
LQA Limite de Quantificao Aceitvel
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
RPM Rotao Por Minuto

SUMRIO
CAPTULO I .............................................................................................................. 15

Biorremediao de guas contaminadas com benzeno por meio do o micro-
organismo Bacillus subtilis. E aplicao dos Gros de kefir como bioindicador
de qualidade da gua.

1 INTRODUO ....................................................................................................... 15
1.1 Definies ..................................................................................................... 16
1.1.1 Bacillus subtilis ..................................................................................... 16
1.1.2 Biossurfactantes ...................................................................................... 17
1.1.3 Indicadores biolgicos (IBs) ................................................................ 18
1.1.3.1 Organismos bentnicos bioindicadores ........................................ 23
1.1.3.2 Algas bioindicadoras........................................................................ 28
1.1.3.3 Gros de kefir .................................................................................... 30
1.1.4 Contaminao de guas com benzeno e suas consequncias ........ 35
1.1.4.1 Legislao ambiental........................................................................ 37
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 38
2.1 Objetivo geral ................................................................................................. 38
2.2 Objetivos especfico .................................................................................... 38
3 MATERIAIS E MTODOS ..................................................................................... 39
3.1 Bacillus subtilis .............................................................................................. 39
3.2 Indicador Biolgico ..................................................................................... 39
3.3 Meios e Solues Estoque ......................................................................... 39
3.4 Acompanhamento de Crescimento Celular ................................................. 40
3.5 Peso Seco ...................................................................................................... 40
3.6 Caracterizao do Benzeno .......................................................................... 41
3.6.1 Definio do Comprimento de Onda ...................................................... 41
3.6.2 Curva de Calibrao para Benzeno ........................................................ 41
3.7 Biodegradao de Benzeno .......................................................................... 42
3.8 Testes com os Gros de kefir ...................................................................... 43
3.9 Testes de produo de biossurfactante em erlenmeyers .......................... 44
3.10 Testes de produo de biossurfactante em biorreator ............................ 45
3.10.1 Planejamento experimental para a produo de biossurfactante em
biorreator ........................................................................................................... 45
3.10.2 Descrio do biorreator......................................................................... 47
3.10.3 Condies de cultivo ............................................................................. 48
3.11 Pesquisa de biossurfactante intracelular em Bacillus subtilis ............... 49
4 RESULTADOS E DISCUSO................................................................................ 50
4.1 Correlao entre Absorbncia e Concentrao Celular ............................. 50
4.2 Curva de Crescimento celular ....................................................................... 50
4.3 Ensaios de Biodegradao ........................................................................... 51
4.4 Testes de qualidade de gua com os Gros de Kefir ...................................... 53
4.5 Testes em biorreator ...................................................................................... 53
4.6 Pesquisa de biossurfactante intracelular em Bacillus subtilis .................. 54
5 CONCLUSO......................................................................................................... 56

CAPTULO II ............................................................................................................. 57

Beneficiamento de guas pluviais e da SABESP na UPIBA, e aplicao da
planta Kalanchoe pinnata como agente bioindicador e fitorremediador.

1 INTRODUO ....................................................................................................... 57
1.1. Definies ...................................................................................................... 62
1.1.1 Kalanchoe pinnata .................................................................................. 62
1.1.2 Micropropagao .................................................................................... 63
1.1.2.1 Processos fotossintticos ............................................................... 64
2 OJETIVOS ............................................................................................................ 65
2.1 Objetivos gerais: ............................................................................................ 65
2.2 Objetivos especficos .................................................................................. 65
3 MATERIAIS E MTODOS ..................................................................................... 66
3.1 Unidade Piloto de Beneficiamento de gua (UPIBA) ....................................... 66
3.1.1 Captao das guas pluviais .................................................................. 67
3.2 Anlises microbiolgicas ................................................................................. 67
3.4 Biofiltrao e uso da Kalanchoe pinnata como indicador biolgico ...... 68
3.3.1 Micropropagao fotoautotrfica............................................................... 68
3.4 Preparo do extrato de folhas de Kalanchoe pinnata ....................................... 70
3.4.1 Determinao dos flavonoides totais, equivalentes em catequina..... 70
4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 71
4.1 Ensaios microbiolgicos ................................................................................... 72
4.2 Micripropagao de kalanchoe pinnata ........................................................... 76
4.3 Dosagem dos flavonoides das folhas de K. pinnata ....................................... 81
5 CONCLUSO........................................................................................................ 82
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 83
ANEXOS OBRIGATRIOS ...................................................................................... 94
Bioprocessos e bioindicadores de tratamento e monitoramento de guas: desenvolvimento e aplicaes
15
CAPTULO I
Biorremediao de guas contaminadas com benzeno por meio do o micro-

organismo Bacillus subtilis. E aplicao dos Gros de kefir como bioindicador
de qualidade da gua.
1 INTRODUO
O conceito de bioprocessos no contexto da biotecnologia ambiental concerne

aplicao de micro-oganismos (fungos, algas, bactrias), capazes de eliminar total
ou parcialmente substncias txicas ao meio ambiente e seres vivos.
(MALAJOVICH, 2004; TIBURTIUS et al., 2004).
O primeiro bioprocesso realizado em larga escala foi a tcnica de
fermentao para a produo de vinhos e cervejas. E ao longo do sculo XX, a
expanso da microbiologia industrial e o desenvolvimento de bioprocessos
baseados no metabolismo microbiano possibilitaram a produo de diversas outras
substncias (antibiticos). Atualmente, por questes histricas, ainda hoje o termo
processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer processo
microbiano operando em grande escala, independentemente se este seja ou no
uma fermentao. E o termo fermentador se usa como sinnimo de biorreator,
designando a dorna de vidro ou ao inox, sendo este o elemento principal, pois
onde ocorre o processo fermentativo (MALAJOVICH, 2004).
De maneira geral, para a realizao de um bioprocesso necessrio, que
primeiro se faa a escolha do agente biolgico adequado, para a transformao da
matria prima de interesse, em condies que podem exigir esterilizao, aerao e
controle do processo (pH, temperatura e etc), e finaliza com a separao e
purificao do produto final (MALAJOVICH, 2004).
O presente trabalho objetiva desenvolver bioprocessos, visando oferecer
sociedade subsdios para a adoo de tecnologias alternativas de tratamento
biotecnolgico das guas. Haja visto que, a m qualidade da gua continua a
representar uma grande ameaa para a sade humana, causando doenas graves,
como diarreias, e diversos tipos de cncer devido a ingesto de compostos
aromticos e metais pesados.
16
Estima-se que 88% dos casos dessas doenas sejam atribudos ao

abastecimento de gua inseguro, saneamento e higiene, e concentrado
principalmente em crianas de pases subdesenvolvidos (PENNA, 2002). A gua
tratada por meio de processos biotecnolgicos poder ser utilizada na produo de
preparaes comerciais, aplicaes farmacuticas, limpeza de reas e
equipamentos, bem como na preparao de produtos qumicos farmacuticos e
meios de cultivos bacteriolgicos (PENNA, 2001).
1.1 Definies
1.1.1 Bacillus subtilis
O Bacillus subtilis uma espcie gram-positiva de bactria saprfita comum

do solo e da gua. Possui organismo esporulado, no patognico, graas sua
termofilia utilizado na validao e monitoramento de ciclos de esterilizao por
calor seco e xido de etileno, realizados em estufas ou fornos de esterilizao e
autoclaves para gs xido de etileno, respetivamente.
A atividade antimicrobiana do Bacillus Subtilis vem sendo bastante
pesquisada, devido a sua capacidade de sintetizar biossurfactantes, sendo a sntese
independente da hidrofobicidade do meio estando, geralmente, relacionada ao
metabolismo primrio. Entretanto, o acmulo destes lipopeptdeos extracelulares no
meio de cultura podem induzir mudanas na hidrofobicidade da parede celular de
forma a criar mecanismos de adeso entre diversas superfcies atravs de
interaes hidrofbicas. Assim, a produo de biossurfactantes lipopeptdicos
secundrios estaria relacionada a uma adequao metablica do microrganismo a
meios com baixa solubilidade aquosa (amidos, leos, etc) (MUKHERJEE et al.,
2006).
MUKHERJEE et al., (2006) cita a capacidade do Bacilllus Subtilis crescer em
condies aerbias e anaerbias (neste caso, diante da presena de nitrato). A
importncia da composio de meios de cultivo vem sendo estudada de forma a
identificar tambm a importncia de sais de potssio, fontes de nitrognio e carbono
entre outros, para a produo de biossurfactantes (MUKHERJEE et al., 2006). Esses
estudos relacionando as condies de crescimento de Bacillus Subtilis e produes
17
de biossurfactantes so relevantes para avaliar os limites das fontes de carbono

e/ou nitrognio que interferem na produtividade de biossurfactantes e sua aplicao
na biorremediao.
1.1.2 Biossurfactantes
Os biossurfactantes so molculas surfactivas, heterogneas obtidas a partir

do cultivo de microrganismos. Essas biomolculas podem ser do tipo: glicolipdeos,
lipopeptdeos, complexos proteico-polissacardeos, fosfolipdeos, cidos graxos e
lipdeos neutros, so capazes de reduzir a tenso superficial, concentrao micelar
crtica, tenso interfacial em solues aquosas com misturas de hidrocarbonetos
(BANAT et al., 1991)
Alguns biossurfactantes podem apresentar atividade antibacteriana e
antifngica, destacando-se neste grupo lipopeptdeos como a viscosinamida,
surfactina, iturina e fengicina (BANAT et al., 1991). Dentre as mais importantes
aplicaes destas substncias temos a biorremediao e seu uso como agente
antimicrobiano. Os biossurfactantes so expressos espontaneamente durante o
crescimento celular e sua funo est, geralmente, relacionada ao consumo de
hidrocarbonetos incluindo resduos oleosos (MUKHERJEE & DAS, 2006).
A produo do biossurfactante contribui na biodegradao dos
hidrocarbonetos pelas bactrias por meio de dois mecanismos; O primeiro inclui o
aumento da disponibilidade biolgica do substrato hidrofbico para micro-
oganismos, com consequente reduo da tenso superficial do meio em torno da
bactria e a reduo da tenso interfacial entre a parede da clula bacteriana e as
molculas do hidrocarboneto; Enquanto o outro mecanismo envolve a interao com
a superfcie da clula promovendo modificaes na membrana facilitando a
aderncia ao hidrocarboneto (aumento de hidrofobicidade) e reduzindo o ndice de
lipopolissacardeos da parede celular sem danificar a membrana, gerando a
disperso do hidrocarboneto pelo seu encapsulamento em micelas, vesculas
esfricas ou irregulares e estruturas lamelares, conforme. (BANAT et al., 1991).
A produo de biossurfactante medida indiretamente atravs da tenso
superficial, que est relacionada com as foras de atrao e repulso entre as
molculas de um fluido. Para manter as molculas com um maior nmero possvel
18
de vizinhos semelhantes, os lquidos tendem a adotar uma forma que diminui sua
rea de superfcie, formando gotas esfricas que a forma com menor razo
superfcie/volume.
A eficincia do biossurfactante determinada atravs da concentrao
micelar critica (CMC), ponto em que comeam a se formar as micelas. Um
biossurfactante eficiente possui baixa CMC, ou seja, uma menor quantidade de
surfactante necessria para diminuir a tenso superficial, demonstrando maior
efetividade e eficincia que os surfactantes qumicos (DESAI; BANAT, 1997).
A surfactina um dos biossurfactante mais eficientes que se tem
conhecimento, reduzindo a tenso superficial da gua de 72 mN/m para 27 mN/m,
que prximo do valor mnimo detectvel (SEYDLOV; SVOBODOV, 2008). O
mecanismo de mobilizao das molculas, que provoca a reduo da tenso
superficial entre ar/gua e solo/gua, ocorre em concentraes de biossurfactante
abaixo da CMC.
Em concentraes acima da CMC inicia-se o processo de solubilizao,
devido formao de micelas que aumentam a solubilidade do leo (URUM;
PEKDEMIR, 2004).
1.1.3 Indicadores biolgicos (IBs)
Por definio, um Indicador biolgico (IB) um sistema de desafio, contendo

micro-organismos viveis, e que possui resistncia definida a um processo
especfico (ISO 11138 - 1; VESSONI PENNA et al., 2000 apud ISHII. M., 2006.).
De maneira geral, as principais caractersticas dos bioindicadores so: possuir
limites de tolerncia estreitos (sensveis a pequenas mudanas ambientais); possuir
identificao fcil e rpida; ser bem conhecido biologicamente; e ser dotado de
pouca ou nenhuma mobilidade.
Alm disso, o bioindicador no deve ser patognico ou pirognico, deve ser
capaz de fornecer reprodutibilidade e preciso em relao ao mtodo, apresentar
resistncia ao agente fsico ou qumico independente da microbiota presente no
artigo ou ambiente inserido, em relao afinidade que se destinam, alm de
facilitar o diagnstico e a definio dos parmetros de processo (ISHII. M., 2006.)
19
Do ponto de vista ecolgico, quando se trata de biomonitoramento e/ou

bioprocessos, os indicadores biolgicos utilizados so espcies, grupos de espcies
ou comunidades biolgicas cuja presena, quantidade e distribuio indicam a
ocorrncia ou a iminncia de impactos ambientais em um ecossistema. A primeira
abordagem visando determinao de indicadores biolgicos de qualidade das
guas, com bases cientficas, foi feita com bactrias, fungos e protozorios na
Alemanha por KOLKWITZ & MARSSON, (1909) apud (BUSS, 2003).
Nas primeiras experincias com bioindicadores, foi feito uso de uma espcie ou
uma associao de espcies. J, na atualidade, outros nveis de organizao do
ecossistema vm se mostrando teis (populaes, comunidades).
Isto porque, a composio de uma comunidade reflete caractersticas ambientais
que os mtodos tradicionais no detectam. Esta viso mais abrangente mostrou-se
especialmente interessante em estudos de contaminaes (CALLISTO et al., 2001).
Sendo as tcnicas, nesta rea, bem reconhecidas. Muitas vezes, os mtodos de
bioindicao so mais teis e mais econmicos que os tradicionais mtodos de
anlise fsico-qumica (METCALFE,1989 apud BUSS, 2003).
Atualmente, existem trs principais linhas de pesquisa sobre a avaliao
biolgica da gua que utilizam dados taxonmicos e de tolerncia poluio sendo
elas: saprbica, ndice de diversidade e ndice bitico, as quais sero explicadas
com mais detalhes a seguir:
Sistema saprbico: O termo saprbio significa a dependncia de um
organismo na decomposio de substncias orgnicas como um recurso alimentar.
O sistema saprbico foi baseado na presena de micro-organismos indicadores
(principalmente bactrias, algas, protozorios e rotferos) que recebem valores de
acordo com sua tolerncia poluio. Com base no nvel de saprobidade dos
organismos bioindicadores, so definidas as zonas, de acordo com o grau de
eutrofizao encontrado. Assim temos, em ordem crescente de eutrofizao, as
reas oligosaprbicas, mesosaprbicas (alfa- e beta-) e polisaprbicas
(METCALFE, 1989 apud BUSS, 2003). Conforme for o sistema saprbico, a qualidade
da gua classificada em uma das categorias estabelecidas, de acordo com os
parmetros relacionados, como DBO (Demanda Bioqumica de Oxignio), contagem
de bactrias e concentraes de oxignio dissolvido e H2S (cido sulfdrico). Apesar
de bastante usados em alguns pases da Europa, os ndices saprbicos apresentam
algumas limitaes, apontadas por PERSOONE & DE PAUW (1979): falta de
20
conhecimento taxonmico adequado; subjetividade dos limites de tolerncia

estabelecidos para os organismos; necessidade de amostragem intensiva; aplicao
geogrfica local; e tipos de poluio restritos.
Bitico (ndice bitico): O ndice bitico correlaciona determinados fatores
ambientais que podem ser empregados como indicadores na avaliao de uma
rea, atribuindo um valor para cada bioindicador de acordo com sua tolerncia ao
impacto. A anlise bacteriolgica da gua de um rio, por exemplo, importante, j
que a elevada presena de bactrias neste ecossistema mostra que h uma grande
quantidade de matria orgnica no ambiente, caracterstica tpica de eutrofizao. O
grupo dos coliformes fecais, utilizado neste tipo de anlise, est relacionado com
fezes de animais de sangue quente (METCALFE, 1989 apud BUSS, 2003).
Os organismos indicadores de contaminao fecal (presena de fezes
humanas ou animais na gua) no so patognicos, mas indicam a potencialidade
da gua na transmisso de doenas. O grupo de organismos mais utilizado so as
bactrias do grupo coliforme. Neste tipo de anlise, calcula-se o nmero total de
colnias de bactrias na gua. Entre os coliformes fecais, a presena de Escherichia
coli uma indicao de esgotos cloacais. Tambm existem os estreptococos fecais,
como por exemplo as espcies Streptococcus faecalis (fezes humanas),
Streptococcus bovis (fezes bovinas) e Streptococcus equinus (fezes equinas)
(SPERLING, 1996).
ndice de Diversidade: Os ndices de diversidade so expresses
matemticas que utilizam trs componentes da estrutura de comunidades: riqueza,
equitabilidade e abundncia, para descrever a resposta de uma comunidade a
respeito da qualidade de seu ambiente. Os mais populares so os ndices de
Shannon-Weaver (H) e Simpson (S), que so ndices baseados na abundncia
proporcional de espcies, e associam riqueza e equitabilidade em um nico fator. A
riqueza de espcies como uma medida de diversidade foi bem sucedida em vrios
estudos, como em CONNOR & SIMBERLOFF (1978) e HARRIS (1984). Entretanto,
KEMPTON (1979) observou que a distribuio de abundncia de espcies
frequentemente uma medida mais sensvel de distrbio ambiental do que a riqueza
de espcies somente.
O uso de micro e macro-organismos como bioindicadores baseado em um
princpio simples: submetidos a condies adversas, os organismos geram uma
resposta biolgica e, se adaptam ou morrem por sua tolerncia ou sensibilidade a
21
vrios parmetros, como poluio orgnica, alterao de pH da gua, lanamento de

pesticidas entre outros (WASHINGTON,1984 apud BUSS et al., 2003; ALBA-
TERCEDOR, 1996 apud CALLISTO, 2000). O termo resposta biolgica se refere
ao conjunto de reaes de um indivduo ou uma comunidade em relao a um
estmulo ou a um conjunto de estmulos (ARMITAGE, 1995 apud BUSS et al., 2003).
Por estmulos entendemos algo que induza uma reao do indivduo que possa ser
percebida e medida na populao ou na comunidade.
Os organismos bioindicadores podem ser classificados tambm de acordo com o
seu grau de sensibilidade a poluentes. Assim, tm-se os organismos tolerantes: so
encontrados em ambientes com alto grau de contaminao orgnica, adaptados
para viver em condies de baixo nvel de oxignio; Facultativos: possuem um alto
grau de tolerncia e frequentemente associados com moderados nveis de
contaminao orgnica; Intolerantes: no so associados a contaminao e
geralmente so sensveis a moderada reduo do oxignio dissolvido no meio.
Como praticamente qualquer grupo pode ser utilizado em programas de
biomonitoramento, como bactrias, algas, protozorios, macroinvertebrados e
plantas, foram desenvolvidas metodologias de avaliao para macrfitas aquticas
(BEST, 1990; HASLAM, 1982 apud BUSS, 2003), peixes e macroinvertebrados.
A utilizao da comunidade de peixes com essa finalidade tem sido
extensamente implantada, principalmente nos Estados Unidos (CAIRNS JR. & VAN
DER SCHALIE, 1980; FAUSCH et al., 1990; KARR, 1981; KARR et al., 1986 apud
BUSS, 2003), inclusive com proposta de uso em programas em todo o pas
(FAUSCH et al., 1984; PLAFKIN et al., 1989 apud BUSS, 2003).
As alteraes na qualidade da gua, resultantes dos processos de evoluo
natural e de ao antrpica, se manifestam pela reduo acentuada da
biodiversidade aqutica, em funo da desestruturao do ambiente fsico, qumico
e alteraes na dinmica e estrutura das comunidades biolgicas, sendo que o uso
de bioindicadores permite uma avaliao integrada dos efeitos ecolgicos causados
por mltiplas fontes de poluio (CALLISTO et al., 2001).
Assim, os bioindicadores complementam as informaes sobre qualidade das
guas, especialmente para a avaliao de impactos ambientais decorrentes de
descargas pontuais de esgotos domsticos e efluentes industriais. Como tambm
so bons detectores de poluio sutil (difusa).
22
De acordo com Metcalfe (1989 apud BUSS, 2003), o uso das respostas
biolgicas como indicadores de degradao ambiental vantajoso em relao s
medidas fsicas e qumicas da gua, pois na variveis fsicas e qumicas h uma
descontinuidade temporal e espacial das amostragens, por registrar somente uma
fotografia de uma situao que pode apresentar caractersticas altamente dinmicas,
uma vez que, registram apenas o momento em que foram coletadas, necessitando
assim de um grande nmero de anlises para a realizao de um monitoramento
temporal eficiente (WHITFIELD, 2001 apud GOULART & CALLISTO, 2003).
Em geral, as avaliaes da qualidade da gua atravs dos parmetros fsico-
qumicos e bacteriolgicos atendem ao uso para agricultura, consumo domstico e
industrial, mas no atendem s dimenses estticas de lazer ou ecolgicas
(BAPTISTA et al., 2000).
Outra desvantagem que, se as amostragens forem feitas longe da fonte
poluente, as medies qumicas no sero capazes de detectar perturbaes sutis
sobre o ecossistema, nesse caso, as metodologias biolgicas so bastante eficazes
na avaliao de poluio no pontual (difusa), tendo, portanto, grande valor para
avaliaes em escala regional (PRATT & COLER, 1976 apud BUSS, 2003). Isto
porque, os organismos integram as condies ambientais durante toda a sua vida,
permitindo que a avaliao biolgica seja utilizada com bastante eficincia na
deteco tanto de ondas txicas intermitentes agudas quanto de lanamentos
crnicos contnuos (DE PAUW & VANHOOREN, 1983 apud BUSS, 2003).
Mesmo em casos de lanamentos contnuos dentro das normas
estabelecidas por lei, o uso da biota aqutica uma importante ferramenta na
avaliao da qualidade da gua. Isso se deve a um processo natural denominado
biomagnificao, que a transmisso de compostos que no so metabolizados ou
excretados pelos organismos para o nvel superior da cadeia trfica. Em alguns
casos esses compostos podem ser txicos se acumulados, como no caso de metais
pesados e de pesticidas organoclorados. Portanto, mesmo estando dentro das
normas legais de lanamento, esses efluentes podem estar degradando as inter-
relaes biolgicas, extinguindo espcies e gerando problemas de qualidade de vida
para as populaes que utilizam aquele recurso.
A Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos (U.S Environmental
Protection Agency USEPA) e a Diretriz da Unio Europeia (94C 222/06, 10 de
agosto de 1994) recomenda a utilizao de critrios biolgicos (que utilizam a
23
condio de um organismo ou conjunto de organismos para descrever a integridade

ecolgica de um ambiente aqutico impactado, pouco impactado, ou reas de
referncia), para complementar as informaes sobre qualidade da gua,
tradicionalmente baseados em parmetros qumicos e fsicos (CALLISTO et al,
2013). Uma vez que, micro-organismos e suas complexas interaes com o meio
ambiente respondem de maneira diferenciada s modificaes da paisagem,
produzindo informaes, que no s indicam a presena de poluentes, mas como
estes interagem com a natureza, proporcionando uma melhor indicao de seus
impactos na qualidade dos ecossistemas (SOUZA, 2001 apud PIEDRAS et al,
2006).
Os organismos aquticos, principalmente invertebrados, so os que melhor
respondem s mudanas das condies ambientais. Ambientes fortemente
impactados mostram poucas espcies que, se estiverem bem adaptadas, podem
exibir timo desenvolvimento e o monitoramento de estaes a montante e a jusante
da fonte poluidora, pode identificar as consequncias ambientais para a qualidade
da gua e sade do ecossistema aqutico (MATSUMARA-TUNDISI, 1999 apud
PIEDRAS et al, 2006). De modo que, quanto mais intensos forem os impactos
ambientais, mais pronunciadas sero as respostas ecolgicas dos organismos
aquticos bioindicadores de qualidade da gua, podendo haver inclusive a excluso
de organismos sensveis poluio (CALLISTO et al., 2001 apud CALLISTO, 2013).
O conhecimento dos organismos aquticos de um ecossistema de suma

importncia, pois a presena ou ausncia de certas espcies como indicador do
status a longo prazo da qualidade de gua, alm de favorecer, atravs da
manipulao da cadeia alimentar, a melhora da qualidade da gua (STRASKRABA
& TUNDISI, 2000 apud PIEDRAS et al, 2006).
1.1.3.1 Organismos bentnicos bioindicadores
Entre os diversos organismos usados como bioindicadores de qualidade de

guas, os mais testados e utilizados entre os cientistas so os macroinvertebrados
bentnicos (benthos, do grego, fundo), (Figura 1) so chamados assim, porque
geralmente so encontrados no fundo de corpos dgua continentais (rios e lagos)
(BUSS et al., 2003).
24
A escolha por esses organismos ocorre devido ao fato de estes podem

responder a perturbaes em todos os ambientes aquticos e em todos os perodos
e de forma rpida; possuem grande nmero de espcies, o que oferece um amplo
espectro de respostas; mesmo em pequenos corpos hdricos, a fauna pode ser
extremamente rica; so relativamente sedentrios, permitindo uma anlise mais
eficiente dos efeitos das perturbaes, e alm do mais, esta uma metodologia de
coleta simples e de baixo custo que no causa grandes impactos ao ambiente, alm
disso, esses organismos possuem estruturas morfolgicas relativamente fceis de
identificar (BUSS et al., 2003).
Figura 1 - Macroinvertebrados bentnicos que podem ser encontrados nos ecossiste-

mas aquticos evidenciando os diferentes grupos taxonmicos: (A) Olygochaeta; (B)
Gastropoda; (C) Ceratopogonidae (Diptera Insecta) ;(D) Ephemeroptera (Insecta)
e (E) Elmida e (Coleoptera Insecta). Foto: Guilherme Alfenas.
Fonte: <https://limnonews.wordpress.com/2013/03/20/macroinverte-o-que>.
Muitos organismos bentnicos alimentam-se de matria orgnica. So

importantes componentes da dieta de peixes, anfbios e aves aquticas e por isso
transferem a energia obtida da matria orgnica morta retida no sedimento para os
animais que deles se alimentam. Dentre os organismos bentnicos, predominam as
larvas de insetos aquticos, minhocas dgua, caramujos, vermes e crustceos, com
tamanhos de corpo maiores que 0,2-0,5 mm (CALLISTO, 2000).
Os macroinvertebrados bentnicos so bons bioindicadores de qualidade da

gua porque so mais permanentes no ambiente, uma vez que, vivem de semanas
a meses no sedimento. O que torna esses bioindicadores importantes, o fato de
possurem uma notvel relao com o sedimento, por se alimentarem da matria
orgnica presente nele, os bioindicadores refletem a qualidade do sistema aqutico
25
(JESUS et al., 2004). O sedimento pode ser considerado como o compartimento

resultante da integrao de todos os processos que ocorrem em um ecossistema
aqutico (BUSS et al., 2003). Os mtodos baseados em presena ou ausncia de
macroinvertebrados indicadores tiveram origem nos Estados Unidos, e evoluram ao
longo do sculo XX de sistemas qualitativos para quantitativos (CAIRNS & PRATT,
1993 apud BUSS, 2003)
Devido alta capacidade de soro e acumulao do sedimento, o mesmo

pode conter maiores concentraes de poluentes, como metais pesados, do que a
coluna da gua. Alm disso, diversos processos biticos e abiticos tambm podem
remobilizar esses poluentes do substrato, constituindo-se em fontes de poluio
secundrias, afetando a qualidade da gua e originando a bioacumulao na cadeia
trfica (BUSS et al., 2003). Por este motivo, o seu monitoramento torna-se mais
eficiente que o monitoramento baseado apenas na mensurao de parmetros
fsicos e qumicos (LENAT & BARBOUT, 1994; ALBA-TERCEDOR, 1996 apud
CALLISTO, 2013).
Os macroinvertebrados bentnicos tambm recebem grande influncia de

algumas caractersticas fsico-qumicas dos ambientes aquticos, entre estas,
destacam-se a velocidade da corrente, qualidade e disponibilidade de alimento, tipo
de substrato, temperatura da gua e concentrao de gases como o oxignio. Essas
variveis possuem forte influncia na composio desses organismos, sendo que
suas alteraes podem ser detectadas pela mudana na quantidade e dominncia
entre eles.
Em um estudo sobre o uso de macroinvertebrados como bioindicadores da
qualidade das guas do Alto Uruguai Gacho, HEPP E RESTELLO (2007)
apresentam algumas informaes bsicas sobre os macroinvertebrados bentnicos,
e descrevem o resultado da utilizao destes organismos na avaliao da qualidade
das guas deste rio. Os autores partiram do princpio de que em ambientes
aquticos contaminados, ordens como Ephemeroptera, Trichoptera e Plecoptera,
no so encontradas, uma vez que estas so altamente intolerantes a poluio.
Em contrapartida, h organismos, como a famlia Chironomidae (Diptera), que
so altamente adaptados a ambientes muito poludos e tem preferncia por habitats
com grandes concentraes de substncias hmicas e flvicas. Tal tolerncia,
26
auxiliou no desenvolvimento de mecanismos fisiolgicos para sobrevivncia em

ambientes com pouco oxignio dissolvido.
Os ndices de qualidade da gua tm sido formulados para fornecer uma
tcnica de rotina para uso no monitoramento de gua. Segundo METCALFE (1989),
o ndice ideal seria aquele que combinasse uma medida quantitativa de diversidade
de espcies com uma informao qualitativa das sensibilidades ecolgicas de
espcies individuais em uma nica expresso numrica que possa ser
estatisticamente analisada. Este tipo de ndice essencialmente encontrado na
avaliao bitica. O ndice bitico BMWP (Biological Monitoring Working Party) e o
IQA so atualmente os mais populares.
O IQA corresponde a um ndice baseado em um modelo matemtico, o qual

leva em conta a concentrao de nove parmetros fsicos e qumicos das guas. J
o BMWP (Biological Monitoring Working Party), baseia-se na soma de valores que
so atribudos a cada grupo de macroinvertebrado por sua capacidade de
sobrevivncia a distintos nveis de qualidade da gua. Esses valores so atribudos
aos grupos em uma escala de 1 a 10, em ordem decrescente de tolerncia. Outros
parmetros ecolgicos utilizados foram a abundncia, riqueza e a equitabilidade da
comunidade dos organismos bentnicos (HEPP e RESTELLO, 2007).
Para se aplicar a tabela faz-se o levantamento da comunidade de

macroinvertebrados em determinado trecho, explorando os diversos nichos nele
existente. Monta-se, ento, uma tabela com as famlias que ocorreram neste local e
suas respectivas pontuaes. Com a somatria desta pontuao, vai-se para a
tabela abaixo e se caracteriza a qualidade da gua daquele trecho de rio.
Outros autores tambm descrevem sucintamente as caractersticas principais

e listam as espcies encontradas em trs ecossistemas aquticos (natural, alterado
e impactado) ao longo da bacia Rio das Velhas (MG). Em um ecossistema natural,
espera-se encontrar grande diversidade, altas concentraes de oxignio dissolvido,
e ausncia de interferncia humana, o que proporciona um ambiente agradvel para
os invertebrados bentnicos, como Biomphalaria, Oligochaeta, Chironomidae,
Gerridae, Aeschnidae, Odontoceridae, Psephenidae, Helicopsichidae, Hydroptilidae,
e Oligoneuridae MORENO E CALLISTO (2005).
J em ambiente aqutico alterado, a diversidade tende a ser menor, aumenta-

se a turbidez e os slidos dissolvidos, e no h vegetao ripria. Odontoceridae,
27
Gerridae, Aeschnidae, Biomphalaria, Oligochaeta, Chironomidae so organismos

bentnicos encontrados neste ambiente. Por ltimo, em ecossistemas impactados,
h um domnio de espcies tolerantes causado pelo aumento do aporte de matria
orgnica e baixas taxas de oxignio dissolvido MORENO E CALLISTO (2005).
No ambiente impactado apenas trs espcies foram encontradas por

MORENO e CALLISTO, as quais so Biomphalaria, Oligochaeta, Chironomidae.
Estas trs espcies aparecem nos trs ambientes, comprovando a sua alta
tolerncia s adversidades, e so listadas pela maioria dos autores encontrados
MORENO E CALLISTO (2005).
A relao entre os macroinvertebrados e o sedimento explanada por

SILVEIRA (2004), para ela, o tamanho do sedimento (argila, silte, areia, cascalho) e
a diversidade influenciam o tipo de comunidade de invertebrados bentnicos que
iro se estabelecer no local, uma vez que o tamanho da partcula determina a
dimenso dos espaos intersticiais, os quais servem de esconderijo para a presa
fugir do predador. No caso deste sedimento ser orgnico, alm de moradia, pode
servir tambm como alimento.
Tambm possvel a utilizao de categorias trficas como ferramentas para

a avaliao da qualidade da gua SILVEIRA (2004). Tal mtodo parte do princpio
de que a natureza do alimento dos macroinvertebrados e a forma de captura desses
possuem relao direta com possveis impactos em corpos hdricos. Desta forma, os
invertebrados bentnicos so divididos em categorias alimentares, as quais so:
filtradores, coletores, filtradores-coletores (Dptera, Ephemeroptera), raspadores
(Psephenidae), fragmentadores (Pyralidae), e predadores (ninfas de Odonata).
As trs primeiras categorias ingerem partculas menores que 1mm, os

raspadores se alimentam de materiais presos ao sedimento, os fragmentadores
ingerem partculas maiores que 1mm e os predadores se alimentam de outros
animais (CUMMINS, 1996 apud SILVEIRA, 2004). Com o desmatamento da mata
ripria, por exemplo, os fragmentadores sofreriam reduo em sua populao,
devido baixa disponibilidade de folhas para a sua alimentao, enquanto, os
coletores e filtradores aumentariam em grande nmero, devido ao acrscimo de
matria orgnica provocado pela eroso das margens e assoreamento (SILVEIRA,
2004).
28
1.1.3.2 Algas bioindicadoras
As algas so organismos que apresentam diversas caractersticas

morfofisiolgicas especiais: possuem distribuio mundial nas regies litorneas e
podem apresentar-se em condio de vida livre ou em forma de colnias e como
espcies epfitas ou epfitas parasitas. Variam de formas microscpicas (microalgas),
a grandes algas (macroalgas), tais como algas gigantes com mais de cem metros de
comprimento. As Microalgas incluem tanto as cianobactrias, (semelhantes a
bactrias, e anteriormente chamado de "algas azuis"). As algas esto classificadas
da seguinte maneira dentro dos trs reinos: MONERA: Filo Cyanophyta; PROTISTA:
Filos Euglenophyta, Pyrrophyta (dinoflageladas), Chrysophyta (douradas),
Bacillariophyta; PLANTAE: Chlorophyta (verdes), Rhodophyta (vermelhas),
Phaeophyta (pardas) (FILHO, EURICO, 1977).
Como espcies aquticas representativas do primeiro nvel trfico as algas so
organismos ecologicamente importantes, pois elas refletem o que pode acontecer
gradativamente no nvel de populaes, comunidades e, ecossistema (FILHO,
EURICO, 1977).
As algas so utilizadas como bioindicadores de diversas maneiras, por meio
da observao de sua biodiversidade, de sua reduo ou aumento de suas colnias,
ou por anlises qumicas de sua composio, uma vez que so organismos que
interagem com o meio onde vivem, e bioacumulam as informaes contidas no
meio, como por exemplo, a ausncia ou excesso de nutrientes, quando competem
com as macrfitas pelo Nitrognio e Fsforo (FILHO, EURICO 1977). So capazes
tambm de absorver substncias orgnicas, organoclorados e organofosforados que
inibem a sua fotossntese, alm absorver os herbicidas que diminuem a sua
biossntese de lipdios e, tambm os ons metlicos Cu, Cd, Hg, Pb e Zn reduzem a
fotossntese e causam danos aos cloroplastos, inibem a fixao de N.
Baseando-se nisto foi sugerido um ndice de poluio baseado nos gneros
de algas presentes quanto menos diversificada a riqueza especfica de algas, maior
a poluio do sistema (ARAJO LIMA e CALIMAN, 2012).
Dentre as algas mais conhecidas e utilizadas como bioindicadores de
qualidade de guas, esto as pirrofceas, tambm chamadas de dinoflagelados, so
organismos unicelulares, biflagelados, muitos dos quais so marinhos e outros de
gua doce (ARAJO LIMA e CALIMAN, 2012). So abundantes e de alta
29
produtividade no plncton marinho. Muitos dinoflagelados so bioluminescentes,

capazes de converter a energia qumica em energia luminosa, fluorescendo na
tonalidade azul nas guas noite como por exemplo, Noctiluca scintillans (Figura
2). Enquanto que, o fenmeno da mar vermelha provocado pelo desequilbrio
ecolgico resultante da excessiva proliferao da populao de pirrofceas,
principalmente as Alexandrium catenella (Figura 2).
As causas relacionadas a esse acontecimento so as seguintes: alterao na
salinidade, oscilao trmica da gua e excesso de sais minerais decorrentes do
escoamento de esgoto domstico causando aumento exagerado da concentrao
de nutrientes e fertilizantes nas guas, provenientes tambm das indstrias e
lavouras, o que leva a proliferao exagerada desses organismos aquticos
(RIBEIRO et al., 2011) A superpopulao de algas, ocasiona um consumo
exagerado de oxignio e reduo desse gs nas guas profundas; reduz tambm a
penetrao de luz nas camadas profundas, o que prejudica a fotossntese das
plantas imersas, reduzindo a oferta de oxignio e o aumento do gs carbnico. O
ambiente se torna inspito vida e surge a mortandade. Com o aumento do nmero
de seres em decomposio, aumenta o nmero de seres anaerbios
(decompositores) (CARLSON, 1977). Por isso, as mars vermelhas causadas pelos
dinoflagelados so consideradas desastres ambientais.
Figura 2 - Florao de Algas Nocivas da espcie Alexandrium catenella, com liberao de

neurotoxinas no meio, conferindo colorao vermelha as guas do arquiplago do Chile em 2016;
Alga marinha bioluminiscente, Noctiluca scintillans nas Maldivas. Foto: Will Ho; Edio de imagens:
A autora. Fonte: <http://jardimsustentavel.com.br/mare-vermelha/>. Disponivel em 03/12/2016
<http://noctulachannel.com/mar-brilhante-algas-bioluminescencia/>. Disponivel em 03/12/2016
30
No caso das cianfitas, mais conhecidas por algas azuis. Tambm o

arrastamento de detritos fsicos para as margens da lagoa, pedras, dejetos, areia e
outros, faz diminuir o volume de gua. E com menos gua, aumenta a concentrao
do "caldo de nutriente", o que causa a proliferao dessas algas, acelerando a
eutrofizao, que tende a transformar os lagos e lagoas em autnticos pntanos
(Figura 3). (RIBEIRO et al., 2011)
Figura 3- Ecossistemas eutrofizados. Edio de imagens: A autora

Fonte: <https://ambientesaudavelbiologia.wordpress.com/eutrofizacao/>.
<https://guiaecologico.wordpress.com/2011/08/15/o-terror-dos-lagos-e-lagoas-a-eutrofizacao-
acelerada/>.; <http://pt.slideshare.net/geografianaserpapinto/eutrofizao-48378617>.
Disponvel em 03/12/2016
1.1.3.3 Gros de kefir
O nome kefir derivado da palavra Keif oriunda da Turquia e significa bem-

estar, devido sensao e aos benefcios que ele promove sade humana. Os
gros de kefir foram considerados um presente de Al entre os membros das tribos
muulmanas das montanhas do Cucaso, os gros de kefir foram passados de
gerao para gerao por estas pessoas que os consideravam como uma fonte de
riqueza tribal e da famlia. Estima-se que o kefir tem sido usado por seres humanos
a mais de quatro mil anos.
Na matriz dos gros de kefir coexistem mais de 35 espcies de micro-
oganismos que vivem em simbiose (WITTHUHN et al., 2004 apud MIGUEL,
2009). Pode ser produzido em leite fresco, ou em gua com acar mascavo na
31
concentrao de 3 a 10%, dependendo da sua linhagem, nesse trabalho ser

estudado o kefir cultivado em gua (Tibico), tais micro-organismos so considerados
como culturas starter, sendo utilizado em diversos processos, como por exemplo, a
fabricao de pes, iogurtes e bebidas fermentadas.
Os gros de kefir so massas proteicas com aspecto gelatinoso irregulares que
podem variar de 3 a 55 mm de dimetro (IRIGOYEN et al., 2005 apud MIGUEL,
2009), possuem uma aparncia semelhante a couve-flor (OTLES & CAGINDI, 2003
apud MIGUEL, 2009). Podem ser amarelo-claros quando cultivados em leite, ocres e
pardos se crescidos em acar mascavo ou purpreos se cultivados em suco de uva
(GUZEL-SEIDYM et al., 2000). E a composio microbiolgica dos mesmos
depende da origem, das condies de cultivo e de armazenamento (GARROTE et
al., 2001; FARNWORTH e MAINVILLE, 2003; MIGUEL et al., 2010; TAMIME, 2002
apud MIGUEL, 2009).
Os Gros de kefir quando cultivados em leite so compostos por um
complexo heteropolissacardeo denominado kefirano, enquanto aqueles cultivados
em gua com acar mascavo so compostos por dextrano (HSIEH et al., 2012).
A Figura 4 mostra a estrutura molecular destes exopolissacardeos
presentes no Gro de Kefir. Sendo esse um glucolactano ramificado solvel em
gua, contendo quantidades iguais de D-glucose e D-galactose (RIMADA &
ABRAHAM, 2006; FRENGOVA et al., 2002 apud ZANIRATI, 2012; CHEIRSILP et al.,
2003 apud MIGUEL, 2009).
Figura 4 - Estrutura molecular dos exopolissacardeos Kefirano (A) e Dextrano (B).

Fonte: A- Micheli et al. (1999) e B - Waldher et al. (2010).
32
O exopolissacardeo (Figura 5) sintetizado pelos micro-organismos

presentes nos Gros de kefir, sendo este liberado no meio de cultivo incluindo
fatores de crescimento, a produo de kefirano tambm dependente das
condies de preparo como temperatura de crescimento e tempo de fermentao
(TAMIME, 2002 apud MIGUEL (2009).
Figura 5 - Gros de kefir. Fonte: A autora
Nos Gros de kefir encontrada uma diversidade microbiolgica elevada que

inclui espcies de leveduras (Kluyveromyces, Pichia e Saccharomyces), bactrias
cido lticas (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Streptococcus), bactrias
do cido actico e outros micro-organismos ainda no descritos (GARROTE et al.,
1997; 2001; GUVEN e GULMEZ, 2003; MIGUEL et al., 2010; GUZEL-SEYDIM et al.,
2011 apud ZANIRATI, 2012).
A Figura 6 ilustra a presena de bactrias e leveduras em gros de kefir
cultivados em substratos diferentes. Entre os micro-organismos presentes no kefir
esto a levedura Saccharomyces cerevisiae e o Lacbacillus kefiranofaciens que so
os principais contribuintes para a formao e crescimento de gros de kefir
(CHEIRSILP et al, 2003; HSIEH, H.-H., et al. 2012 apud ZANIRATI, 2012).
33
Figura 6 - Microscopia eletrnica de gros de Kefir cultivados em gua com

acar (A) e em leite (B). Fonte: HSIEH, H.-H., et al., 2012 apud ZANIRATI, 2012.
O kefir muito estudado no campo alimentcio e medicinal, entretanto no h

pesquisas sobre o mesmo relacionando-o com indicadores biolgicos de qualidade
da gua. No presente trabalho foram realizados ensaios aplicando os conceitos de
bioindicadores para os gros de kefir, uma vez que, a levedura S. cerevisiae
presente no kefir amplamente pesquisada por evidenciar os efeitos dos poluentes,
sendo utilizada na fabricao de biossensores para o monitoramento de poluentes
orgnicos (BELKIN S., 2003) e para a avaliao da contaminao pelo cromo
(JIANLONG, W. et al., 2004). Os estudos sobre a sensibilidade a diferentes tipos e
concentraes de poluentes do S. cerevisiae, podem justificar a pesquisa sobre a
utilizao dos gros de kefir como um indicador biolgico, visto que essa levedura
uma das principais promotoras da produo do exopolissacardeo do kefir. Tal fato,
de suma importncia, pois um dos requisitos para que um organismo seja
considerado um bioindicador, que a sua identificao seja fcil e rpida, no caso
dos gros de kefir, os mesmos podem ser vistos a olho nu, e a avaliao parte da
uma simples observao, se o mesmo se multiplicou significativamente, ou no.
Alm disso, necessrio tambm que o bioindicador tenha pouca mobilidade
e que possam ser encontrados em abundncia, esses quesitos possibilitam anlises
pontuais no meio contaminado e, portanto, com maior eficincia, essa questo, se
aplica aos gros de kefir, perfeitamente, visto que so organismos ssseis e que se
multiplicam facilmente, quando em suas condies ideais de cultivo, temperatura de
ambientes temperados e concentrao de acar entre 5 a 10%.
34
Outro quesito importante para que um organismo seja considerado um

bioindicador que, o mesmo seja bem conhecido e caracteriazado biologicamente,
nesse caso, o nmero de pesquisas para a caracterizao dos micro-organismos
presentes nos gros de kefir ainda so escassas e precisam aumentar, isto porque,
no Brasil, a cultura de consumir e utilizar o kefir, ainda muito insipiente.
Por muitos anos, as pesquisas da microbiota dos gros de kefir tm sido
realizadas pelo mtodo convencional, dependente de cultivo, com identificao
fenotpica e/ou genotpica dos isolados selecionados. Recentemente, mtodos
moleculares independentes de cultivo provaram ser ferramentas poderosas pois
fornecem a mais completa realidade da diversidade microbiolgica em amostras de
kefir (GIRAFFA 2004 apud ZANIRATI, 2012).
O emprego da metodologia convencional para isolamento e identificao
geralmente torna a anlise microbiolgica de produtos base de kefir relativamente
demorada e os resultados podem ser influenciados pela pobre viabilidade ou pela
baixa densidade de um determinado microrganismo (MIGUEL et al., 2010 apud
ZANIRATI, 2012). Ambos os mtodos, dependentes e independentes de cultivo, tm
algumas limitaes e esto sujeitos a vis. Por esta razo, o mtodo independente
de cultivo tem sido utilizado como uma complementao para medidas de controle
de qualidade desses produtos e para determinar a real microbiota de comunidades
(TEMMERMAN et al., 2004 apud ZANIRATI, 2012).
Estudos recentes que tratam da identificao da microbiota dos gros de Kefir e
da bebida kefir mostraram a importncia de usar as ferramentas de biologia
molecular para a real caracterizao dos micro-organismos presentes nestes tipos
de produtos (FARNWORTH e MAINVILLE, 2003 apud ZANIRATI, 2012). Isto porque,
o mtodo independente de cultivo demonstrou que o dependente de cultivo no
detectava a real diversidade dos microrganismos (SHAPIRO & DWORKIN, 1997
apud ZANIRATI, 2012).
A associao dos mtodos dependente e independente de cultivo foi utilizada
para identificar e caracterizar a microbiota presente nos gros de Kefir de diversas
origens como Taiwan (CHEN, et. al. 2008 apud ZANIRATI, 2012), Tibet (ZHOU, et. al.
2009 apud ZANIRATI, 2012), o estado brasileiro de Minas Gerais (MAGALHES, et.
al. 2010 apud ZANIRATI, 2012), outros estados brasileiros, o Canad e os Estados
Unidos da Amrica (MIGUEL, et. al. 2010 apud ZANIRATI, 2012).
35
A metodologia dependente de cultivo consiste no isolamento e cultivo de micro-

organismos e sua identificao de acordo com as suas caractersticas morfolgicas
ou bioqumicas (ZHOU et al., 2009 apud ZANIRATI, 2012). Nesta metodologia, as
espcies que se apresentam em nmero reduzido competem pelo crescimento com
as espcies microbianas numericamente mais abundantes (HUGENHOLTZ et al.,
1998 apud ZANIRATI, 2012) e algumas espcies podem ser incapazes de crescer in
vitro (HEAD et al., 1998 apud ZANIRATI, 2012). Como alternativa a utilizao dos
vrios testes fenotpicos, tcnicas moleculares tm sido aplicadas com sucesso para
anlise filogentica, estudo de ecologia microbiana de ecossistemas e identificao
dos diversos gneros (FLORESTA, 2003 apud ZANIRATI, 2012).
Com base em todos os fatores citados acima, e na facilidade de manipulao e
baixo custo do kefir, foram empreendidos esforos para a explorao do potencial do
kefir como agente bioindicador de poluentes orgnicos em guas contaminadas com
benzeno.
1.1.4 Contaminao de guas com benzeno e suas consequncias
O benzeno e outros alquilbenzenos so molculas aromticas que possuem

apenas um anel. Entre esses hidrocarbonetos monocromticos, encontra-se uma
classe particular de compostos denominados BTEX: benzeno, tolueno, etilbenzeno e
xileno que esto presentes nos derivados de petrleo, esses so largamente
utilizados em diversos seguimentos industriais, como plstico, solventes, produtos
farmacuticos e combustveis. Dentre os BTEX, o benzeno foi escolhido devido ao
seu alto grau de periculosidade e quantidades presentes no meio ambiente.
Os compostos BTEX so contaminantes comuns de solos e guas, esses
hidrocarbonetos podem chegar ao meio ambiente atravs da descarga dos efluentes
industriais e tambm atravs de acidentes durante o processo de produo,
transporte e estocagem. Entretanto, a grande parcela do processo de contaminao
pode ser atribuda s atividades de refinarias de petrleo e seus derivados, em
especial, a gasolina, cuja composio pode variar de 10 a 60% de compostos BTEX.
(GLENSOY; ALVAREZ, 1999).
As refinarias de petrleo geram muitos resduos slidos (mundialmente,
cerca de 10.000 m3 por dia) classificados pela NBR 10004 como classe I ou resduos
36
perigosos, que no podem ser reutilizados nem reciclados, sendo inflamveis,

corrosivos, txicos ou patognicos (GAFAROV et al., 2006), os resduos gerados
so compostos por leos, gorduras, compostos orgnicos e metais. Muitos destes
compostos so descritos como extremamente poluentes, devido apresentarem
potencial carcinognico e mutagnico para seres humanos (JANBANDHU;
FULEKAR, 2011).
Existem limitaes nos mtodos convencionais, como a remediao por
meio qumico, por exemplo, realizada pela adio de compostos qumicos
(surfactantes sintticos), afim de transformar os compostos orgnicos em
substncias menos txicas ao meio ambiente. Esse mtodo, apesar de ter uma ao
rpida, possuem compostos oxidantes que so corrosivos e podem causar
exploses e, ao final do processo, podem restar subprodutos das reaes que so
nocivos biota local.
A baixa solubilidade e a hidrofobicidade elevada de muitos hidrocarbonetos os
tornam altamente indisponveis aos microrganismos, que para utiliz-los como fonte
de carbono, produzem biossurfactantes capazes de clivar as molculas de
hidrocarbonetos e torn-las disponveis como fonte de carbono para os
microrganismos, assim esses transformam os compostos orgnicos em molculas
mais simples como CO2, CH4 e H2O apresentando inmeras vantagens em relao
aos surfactantes de origem qumica, principalmente em relao sua
biodegradabilidade, compatibilidade com o meio ambiente, baixa toxicidade, alta
seletividade e por sua atividade mesmo sob extremas condies de temperatura, pH
e salinidade.
A exposio crnica ao benzeno pode causar: leucemias, linfomas,
depresso, imunossupresso, neuropatia perifrica, (JANBANDHU; FULEKAR,
2011). Uma das formas de tratar efluentes e locais contaminados por benzeno a
biorremediao, o hidrocarboneto monoaromtico degradado aerobiamente por
micro-organismos atravs de um processo oxidativo em que a primeira etapa da via
d-se atravs de reaes catalisadas por enzimas oxigenases, que introduzem
tomos de oxignio no anel aromtico que abrem o anel e tornam os tomos de
carbono acessveis (CAVALCA et al., 2000), transformando o composto em produtos
com pouca ou nenhuma toxicidade (TIBURTIUS et al., 2004).
37
1.1.4.1 Legislao ambiental
No Brasil a legislao ambiental comeou a ser vigente na dcada de 80,

quando muitos dos representantes de grupos ambientalistas passaram a participar
do governo e outros setores pblicos. No momento atual, as leis brasileiras de
proteo ambiental so internacionalmente aceitas. Foram criadas as reas de
Proteo Ambiental, e, em 1998, foi sancionada a Lei de Crimes Ambientais, que
estabelece as penas para infraes e agresses cometidas contra o meio ambiente
no Brasil.
A resoluo 357/05 do CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente)
define padres de qualidade para classificar uma gua doce como potvel para
consumo humano em 0,005 mg/L de benzeno total (CONAMA 357/05, 2005),
definindo o limite mximo tolervel dos contaminantes na gua para garantir a
potabilidade da mesma.
Os limites aceitveis tambm podem variar dependendo do tipo de gua,
como por exemplo, para as guas subterrneas os Valores Mximos Permitidos
(VMP), para cada um dos usos considerados como preponderantes e os limites de
quantificao praticveis (LQP), considerados como aceitveis, para o bezeno em
guas destinadas ao abastecimento domstico, aps o tratamento convencional, e
para o consumo humano de 5 g.L-1 e para fins recreativos 10 g.L-1 (CONAMA
396, 2008.)
No entanto, delicada essa determinao desses parmetros, devido falta
de dados mais precisos em relao aos danos sade humana quando os
compostos orgnicos esto presentes em concentraes muito baixas, visto que, os
compostos aromticos, em sua maioria, no so eliminados durante o processo de
remoo de poluentes no tratamento de gua convencional, como por exemplo,
aqueles que utilizam como agente oxidativo o hipoclorito, sendo este considerado
brando para os compostos aromticos, devido a sua eliminao ser possvel apenas
por meio de processos oxidativos avanados (POA), como ozonizao, perxido de
hidrognio, radiao UV, ou de combinaes como O3/H2O2, O3/UV, H2O2/UV,
O3/H2O2/UV, e da combinao de perxido de hidrognio com ons ferrosos no
chamado Reagente de Fenton (AZBAR et al., 2004), ou mesmo por processos
biotecnolgicos como a biorremediao com micro-organismos.
38
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Explorar os potenciais dos Gros de kefir como bioindicadores de benzeno

em gua.
Verificar a capacidade biorremediadora do B. Subtilis em gua contaminada

com benzeno.
2.2 Objetivos especfico
Verificar a relao entre a concentrao de oxignio dissolvido (KLa) e os

valores da tenso superficial.
Verificar a relao entre a concentrao de extrato de levedura no meio de

cultivo TSB, com a produo de biossurfactante interno pelo micro-organismo
B. subtilis.
39
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Bacillus subtilis
O micro-organismo Bacillus subtilis ATCC 6051, Foi adquirido no instituto

Andr Toselo localizado em Campinas pela Prof. Dra. Thereza Cristina Vessoni
Penna do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Cincias farmacuticas
da USP (FCFUSP).
3.2 Indicador Biolgico
Os Gros de kefir foram cedidos gentilmente pela aluna especial Cristina

Mendes do Departamento de Tecnologia bioqumico farmacutico da Faculdade de
Cincias farmacuticas da USP (FCFUSP). Os Gros de kefir, foram cultivados em
500 ml de meio de cultura composto por gua filtrada e acar mascavo em uma
concentrao entre 3 e 10%.
3.3 Meios e Solues Estoque
Seguem as composies dos meios e solues estoque, mantidas em

congelador, utilizados nos experimentos:
Soluo estoque de benzeno: benzeno (grau analtico) em etanol (439,5

g/L).
Meio de crescimento do pr-inculo: TSB (Tryptone Soya Broth): casena
pancretica digestiva 17 g/L; Enzima de papana 3,0 g/L; Cloridrato de
sdio 5,0 g/L Glicose 2,5 g/L; Potssio dibsico 2,5 g/L.
Meio de deteco: (Bushnell-Hass (BH) - Com extrato de levedura (2 g/L):
Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) 0,2; Cloreto de Clcio (CaCl2) 0,02
g/L; Fosfato de Potssio Monobsico (KH2PO4) 1,0 g/L; Fosfato de
Potssio Dibsico (K2HPO4) 1,0 g/L; Nitrato de Amnio (NH4NO3) 1,0g/L;
Cloreto Frrico (FeCl3) 0,03 g/L; Extrato de levedura 2 g/L; gua de rejeito
industrial dos destiladores de osmose reversa (qsp). Fonte:(Adaptado,
BUSHNELL; HAAS, 1941).
40
3.4 Acompanhamento de Crescimento Celular
O cultivo do pr-inculo foi realizado em frasco erlenmeyer de 250mL

contendo 50mL de meio TSB (Tryptone Soya Broth). Aps 72 horas de crescimento,
fase exponencial, a 30C em shaker a 200 rpm, mediu-se a densidade ptica da
suspenso celular da cepa 6051 em espectrofotmetro UV-visvel (Shimadzu UV-
1650 PC) no comprimento de onda 660nm (DO660nm). (MUKHERJEE et al., 2006).
Para iniciar o acompanhamento da curva de crescimento, calculou-se o
volume (mL) necessrio do pr-inculo para se obter uma DO660nm inicial prxima de
1 g/L (0,8 0,9 g/L) no meio Bushnell-Hass (BH), contidos em um frasco erlenmeyer
de 250mL. Retirou-se, ento, a primeira alquota para leitura da DO660nm no tempo
inicial (0h). O cultivo foi mantido a 30C em shaker a 200 rpm e o crescimento celular
foi monitorado pela absorbncia medida periodicamente at alcanar um valor
mximo estvel, representando a fase estacionria.
3.5 Peso Seco
Aps crescimento celular conforme descrito no item anterior 3.4, as clulas

em estado estacionrio foram centrifugadas por 25 minutos a 3500 rpm e o
precipitado obtido foi ressuspendido em 5 mL de gua destilada. Aps a
transferncia para um nico tubo de centrfuga, as clulas foram novamente
centrifugadas por 25 minutos a 3500 rpm e lavadas com 5 mL de gua destilada
novamente.
A biomassa foi ressuspendida em gua destilada para se obter uma
suspenso concentrada de clulas, 2 mL dessa suspenso foram colocados em um
cadinho seco e j pesado (em duplicata), secando-o em estufa a 60C e pesando o
cadinho com as clulas at atingir peso constante.
Calculou-se a Concentrao (g/L) da suspenso, dividindo a massa celular
(mg) obtida pelo volume conhecido (2mL). Desta mesma suspenso utilizada para o
clculo da concentrao celular, 5 diluies foram feitas para obter 5 leituras de
absorbncia (DO660nm) entre 0,1 e 0,5 correspondendo cada leitura sua respectiva
concentrao celular.
41
3.6 Caracterizao do Benzeno
3.6.1 Definio do Comprimento de Onda
Para confirmar o comprimento de onda para a quantificao do benzeno em

espectrofotmetro (Shimadzu UV-1650 PC), fez-se varredura no comprimento de
onda na regio do UV (200-305nm). Tendo em mos os resultados, identificou-se o
pico mximo de absoro de luz do hidrocarboneto aromtico para se obter a curva
de calibrao.
Os compostos com anel aromtico absorvem luz na regio do ultravioleta.
Assim, para definir o valor do comprimento de onda do benzeno, isto , em que a
absoro de luz mxima, fez-se uma varredura do espectro na regio UV (200-305
nm). Os valores obtidos permitiram construir o seguinte grfico (Figura 7).
Figura 7 - Espectro de varredura para Benzeno na regio UV. Fonte: A autora
Observa-se na Figura 7 que, em 255nm obteve-se a maior absorbncia,

definindo, assim, o comprimento de onda timo para o Benzeno.
3.6.2 Curva de Calibrao para Benzeno

42
Partindo de uma soluo estoque de benzeno (item 3.3), realizou-se 5

diluies, e, para cada uma, fez-se a leitura da absorbncia correspondente no
comprimento de onda a 255 nm, determinado no item 3.6.1. O solvente utilizado nas
diluies foi o meio de deteco cuja composio encontra-se descrita no item 3.3
deste trabalho. Com os valores obtidos, da absorbncia medida versus a
concentrao de benzeno, obteve-se a curva de calibrao do hidrocarboneto
aromtico (Figura 8). Em que se observou uma boa correlao linear (R2 = 0,9986)
com uma relao direta entre a concentrao de benzeno (g/L) e a densidade tica
lida.
Figura 8 - Curva de calibrao para Benzeno no meio de deteco. Fonte: A autora
Com a equao da reta obtida, foi possvel determinar a concentrao de

benzeno (g/L) no meio de deteco.
3.7 Biodegradao de Benzeno
O teste de biodegradao deu-se no momento em que se adicionou 100 mg/L

de benzeno em um frasco erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio, e o B.
Subtilis j inoculado. Retirou-se, ento, a primeira alquota de 5mL referente ao
ponto 0 horas e os frascos foram colocados a 300C sob agitao constante de
200rpm.
Alquotas foram retiradas periodicamente e imediatamente analisadas aps
filtrao em membrana Millipore 0,45. Cada alquota isenta de clulas teve sua
43
absorbncia medida no comprimento de onda a 255nm, a fim de quantificar a

concentrao deste composto atravs da curva de calibrao obtida no item 3.6.2.
Este procedimento foi realizado at o final do teste, no qual a biodegradao
no era mais observada, que ocorreu aps 90 minutos de ensaio. Utilizou-se um
frasco isento de bactria Bacillus subtilis ATCC 6051 como controle, contendo 100
mL de meio de deteco e 100 mg/L de benzeno, nas mesmas condies de tempo
e temperatura, para verificar a perda do hidrocarboneto por volatilizao. Os
experimentos de biodegradao foram realizados em duplicata e comparados com
dois controles.
3.8 Testes com os Gros de kefir
Posteriormente ao ensaio de biodegradao as amostras foram filtradas em

membrana de 0.45 , e em seguida adicionou-se 1g de acar mascavo, por este
ser mais natural, e portanto, mais aceito como substrato para fermentao pelos
micro-organismos do kefir, e em seguida adicionou-se 1 g de Gros de Kefir nos
frascos erlenmeyers. Os ensaios foram divididos em dois grupos (a) e (b), no grupo
(a) estavam as amostras com 0,0025 mg/L de benzeno e, no grupo (b) as amostras
contendo 0,005 mg/L de benzeno, ambos os grupos foram testados em duplicatas.
Os controles foram divididos em positivo e negativo, sendo o controle positivo isento
de resduos de benzeno estando em condies ideais para o desenvolvimento dos
Gros de Kefir, e ao controle negativo adicionou-se 100 mg/L de Benzeno.
Subsequentemente, os frascos foram colocados em uma estufa com temperatura
controlada a 25 C, realizam-se leituras do crescimento dos Gros de Kefir aps
24horas e 48 horas, conforme mostrado no fluxograma (Figura 9).
44
Figura 9 - Fluxograma do ensaio de validao do sistema com Gros de Kefir. Fonte: A autora
3.9 Testes de produo de biossurfactante em erlenmeyers
Foi testado o micro-organismo Bacillus subtilis (ATCC 6051) nos

ensaios de biodegradao dos hidrocarbonetos em meio aquoso. Os testes de
crescimento com a presena de hidrocarboneto como fonte de carbono, foram
realizados em erlenmeyers, com 250 mL dos meios de cultura j relacionados, com
3% de hidrocarboneto (Benzeno) e 2% do inculo, deixados em Shaker a 30C e
45
146 rpm, por 42h. A taxa de crescimento microbiano foi avaliada por massa seca,
utilizando-se 5mL de cada amostra. E a produo de biossurfactante foi analisada
por meio da tenso superficial, medida em tensimetro Kruss - K9.
3.10 Testes de produo de biossurfactante em biorreator
Os ensaios em biorreator foram realizados com 2% de pr-inculo

(preparado utilizando 15 mL de meio BH, com 5%,1% e 0,5% de extrato de levedura,
deixado em Shaker por 30C e 200 RPM), adicionado em 1,5L de meios salino e 3%
de hidrocarboneto (benzeno), 30C, 146 RPM e 1,0 VVM de aerao, por 42h. No
decorrer do tratamento, foram analisadas tenso superficial (produo de
biossurfactante), analisada por meio de um tensimetro Kruss - K9, quantidade
celular (massa seca) e concentrao de oxignio dissolvido.
3.10.1 Planejamento experimental para a produo de biossurfactante em

biorreator
O Quadro 1 refere s variveis utilizadas no planejamento fatorial fracionado
24-1. Para o planejamento de experimentos, foram realizados 2 delineamentos
fracionados 24-1 acrescidos de 4 pontos centrais e um ensaio controle (somente com
o meio BH de osmolaridade igual a 110, sem a adio de benzeno, agitao de 100
rpm e temperatura de conduo do processo de 30 C, totalizando 25 ensaios em
agitador metablico (Quadro 2).
Quadro 1 - nveis dos fatores que sero avaliados no delineamento fatorial

fracionado.
Variveis cdigo -1 0 1
Salinidade
x1 11 110 1100
(mOsmol/L)
Benzeno (%) x2 3 6 9
Agitao (rpm) x3 50 100 150
Temperatura (C) x4 25 30 35
46
Quadro 2 - Matriz do delineamento experimental dos ensaios segundo o Quadro 1,

exceto o ensaio controle.
Ensaios x1 x2 x3 x4
1 -1 -1 -1 -1
2 1 -1 -1 1
3 -1 1 -1 1
4 1 1 -1 -1
5 -1 -1 1 1
6 1 -1 1 -1
7 -1 1 1 -1
8 1 1 1 1
9 0 0 0 0
10 0 0 0 0
11 0 0 0 0
12 0 0 0 0
Aps a avaliao dos efeitos das variveis prosseguiu-se para a prxima

etapa, produo de biossurfactante de acordo com o planejamento experimental
DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) no fermentador de bancada,
tendo em vista a observao de dois fatores (Quadros 3 e 4): agitao e aerao.
Quadro 3 - Variveis utilizadas no DCCR em fermentador de bancada.
Varivel cdigo -1 0 1
Agitao
x1 100 150 200
(rpm)
Aerao
x2 0,5 1,0 1,5
(vvm)
47
Quadro 4 - Matriz do delineamento experimental DCCR segundo o Quadro 3

utilizando o planejamento fatorial 22 com 3 repeties no ponto central.
Ensaios Agitao Aerao
(rpm) (vvm)
1 -1 -1
2 +1 -1
3 -1 +1
4 +1 +1
5 0 0
6 0 0
7 0 0
3.10.2 Descrio do biorreator
Os experimentos foram realizados em Biorreator de bancada New
Brunswick modelo BioFlo/Celligen 115, com dorna de vidro de borossilicato,

capacidade nominal total de 3,0 L e tampa de ao inox, tem sua agitao garantida
por duas turbinas do tipo Rushton, com aerao submersa (Figura 10). Para medir
o pH e o oxignio dissolvido durante o cultivo, o biorreator possui um eletrodo de
vidro esterilizvel modelo 405-DPAS-SC-K8S/225 (Mettler Toledo, Alphaville-Barueri,
Brasil) e um eletrodo polarogrfico autoclavvel modelo InPro 6110/220 (Mettler-
Toledo, Alphaville-Barueri, Brasil), respectivamente. O sistema possui uma sonda de
temperatura, que envia sinal para o sistema de controle. Este, por sua vez, promove
o aquecimento do liquido em seu interior ou promove seu resfriamento, com gua da
rede pblica (devidamente filtrada com filtro de carvo ativado) que flui pela
serpentina de ao inox existente no interior do biorreator. A retirada de amostras foi
realizada por uma sada prpria, uma mangueira de silicone com sua extremidade
conectada a um amostrador.
48
Figura 10 - Vista lateral do biorreator New Brunswick

Fonte: Manual Scientific BioFlo /Celligen 11
3.10.3 Condies de cultivo
O meio salino estudado, com composio apresentada abaixo, foram

testados com adio de extrato de levedura (5%), Benzeno (padro analtico
LabSynth) na concentrao de 3%, e na forma pura (sem a adio desses), para
primeiramente avaliar sua oxigenao e posteriormente definir quais seriam os mais
adequados para dar prosseguimento aos experimentos.
49
Meio Bushnell-Haas BH (adaptado, BUSHNELL; HAAS, 1941)
SAIS g/L
Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) 0,2
Cloreto de Clcio (CaCl2) 0,02
Fosfato de Potssio Monobsico (KH2PO4) 1,0
Fosfato de Potssio Dibsico (K2HPO4) 1,0
Nitrato de Amnio (NH4NO3) 1,0
Cloreto Frrico (FeCl3) 0,05
3.11 Pesquisa de biossurfactante intracelular em Bacillus subtilis
Em primeiro momento, aps o crescimento durante 24 horas e 48 horas do

micro-organismo em meio TSB com diferentes concentraes de extrato de levedura
(3%, 2% e 1%) em frascos erlenmeyers, retirou-se amostras de 42 mililitros em
duplicata e colocou-se em tubos falcons de 50 mililitros, centrfugou-se a 4 C e
5.000.00 rpm por 15 minutos.
Em seguida, retirou-se os tubos da centrfuga, e separou-se o sobrenadante,
reservando-o para posteriormente ler a tenso superficial do meio extracelular.
Restando apenas o pellet no fundo do tubo falcon, prosseguiu-se as lavagens das
clulas com gua destilada, adicionando-se 10 mililitros de gua destilada ao pellet,
ressuspendendo-o e agitando-se levemente as clulas, em seguida levou-se para a
centrfuga a 4 C e 5.000.00 rpm por 15 minutos, retirou-se da centrfuga e
descartou-se o sobrenadante, repetiu-se toda a operao de lavagem de clulas
com mais 10 mililitros de gua destilada.
Posteriormente, ressuspendeu-se as clulas com 7 ml de PBS, conduziu-se a
agitao em um shaker new brusuwick programado para 200 rpm a 30 C por 2
horas, afim de induzir a lise celular e liberao de biossurfactante intracelular.
Por fim, centrifugou-se e separou-se o sobrenadante para ler a tenso superficial do
meio com a possvel presena de biossurfactante intracelular.
50
4 RESULTADOS E DISCUSO
4.1 Correlao entre Absorbncia e Concentrao Celular
Algumas diluies foram realizadas com a finalidade de se correlacionar a

concentrao celular com a absorbncia a 660nm (Figura 11).
Figura 11 - Correlao entre absorbncia medida a 660nm e concentrao

celular de Bacillus subtilis ATCC 6051. Fonte: A autora
Com os dados obtidos, obteve-se a seguinte equao de reta com uma boa
correlao linear (R2 = 0,9986). Essa correlao permitiu calcular a concentrao
celular (g/L) utilizada em todos experimentos subsequentes.
4.2 Curva de Crescimento celular
Na Figura 12, nota-se o incio da fase exponencial em aproximadamente 2h,

enquanto que, para atingir a fase que caracteriza a estabilizao do crescimento
(fase estacionria), foram necessrias mais de 20h.
51
Figura 12 - Curva de crescimento do Bacillus subtilis ATCC 6051 em meio TSB

O
30 C e 200rpm. Fonte: A autora
Atravs desta curva, sabe-se quanto tempo as clulas necessitam para entrar
na fase exponencial e estacionria.
4.3 Ensaios de Biodegradao
O experimento de biodegradao de Benzeno (Ci = 105 mg/L), na concen-

trao celular 1g/L, foi feito em duplicata e comparado a um controle ausente de
clulas.
Observa-se, pela Figura 13, que 30 minutos so necessrios para iniciar o

processo de biodegradao nas condies testadas. Aps este tempo, notvel
uma diminuio da concentrao de benzeno e uma estabilizao desta em 27 mg/L
aps 90 minutos de teste, resultando em 48% de remoo efetiva. Tal valor de
biodegradao foi prximo ao obtido por Bacillus vietnamiensis UFRGS62 (50%), em
72 horas de ensaio (MORALES et al., 2008), o Bacillus vietnamiensis foi escolhido
como padro de referncia para biodegradao nesse estudo, por possuir
caractersticas semelhantes s do B. subtillis.
52
Figura 13 - biodegradao de Benzeno por Bacillus subtilis

0
a 28 C e 200 RPM. Fonte: A autora
Os resultados finais do experimento e o percentual de remoo do

hidrocarboneto esto mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 - Resultados de biodegradao aps 150 minutos de teste
Benzeno (mg/L) % Degradao_

Ensaio 27 74,2
Controle 74,4 26,2
Fonte: A autora
A diminuio da concentrao do contaminante, em percentual, observada no

controle (26,2%) deve-se volatilizao do contaminante, uma vez que os frascos
permaneceram em agitao constante durante todo o perodo de teste,
descontando-se tal parcela do percentual de remoo do ensaio (74,2%), obtm-se
uma remoo real de 48% de benzeno em menos de 2h, sugerindo, assim, um
potencial da cepa ATCC 6051 em degradar benzeno.
53
4.4 Testes de qualidade de gua com os Gros de Kefir
Aps o perodo de incubao dos Gros de kefir em gua biorremediada pelo

micro-organismo B. subtilis, o mesmo aumentou seu tamanho em 55% e 105%,
conforme a concentrao do composto aromtico em gua, sendo o maior
crescimento (105%) obtido nas amostras do grupo (a) que continham a menor
concentrao de benzeno (0,0025 mg/L). Tal fato, demonstra que o kefir pode ser
tolerante a traos de benzeno em gua, mas no tolerante em maiores
concentraes do aromtico, uma vez que, o mesmo no se desenvolveu
plenamente nos ensaios com o grupo (b), aumentando seu tamanho em apenas
55% e, nos ensaios de controles negativos no qual haviam 100 mg/L do aromtico o
mesmo no cresceu e os gros desintegraram-se totalmente. Enquanto que, nos
controles positivos, em que no haviam adio de benzeno, houve um crescimento
de 100% em relao ao peso inicial dos gros.
Os resultados obtidos, permitiram uma anlise sobre o potencial biondicador
dos gros de kefir em ensaios de qualidade de guas. Tendo este estudo um carter
exploratrio, entende-se que os objetivos propostos foram alcanados, pois ser
possvel a partir dele, direcionar novas pesquisas com objetivos mais especficos,
para que possam vir a elucidar as respostas biolgicas geradas pelos gros de kefir
observadas neste estudo, com a utilizao de algumas ferramentas, como a biologia
molecular para a identificao dos micro-organismos nos gros de kefir, bem como,
realizar a padronizao da concentrao de S. cerevisiae e L. Kefiranofaciens.
4.5 Testes em biorreator
Dentre os ensaios realizados, o ensaio feito em biorreator destacou-se, por

mostrar uma possvel relao entre o aumento da concentrao de oxignio
dissolvido no meio, e a diminuio da tenso superficial (Figura 14), isso porque,
com o aumento da aerao no meio, ocorreu uma melhor disponibilidade de
oxignio para a cadeia respiratria do bacilo, que possui metabolismo primrio,
possibilitando maior produo de biossurfactante refletindo na queda da tenso
superficial. Ao realizar um estudo sobre biorremediao.
54
Observou-se tambm nos ensaios em biorreator que o pH do meio se

manteve constante, confirmando estudos relatados em literaturas sobre esta
propriedade de estabilidade da maioria dos biossurfactantes frente a diferentes
condies fsico-qumicas, resistindo s altas temperaturas de autoclavagem (121C
por 20 min) e tambm a baixas temperaturas (-18C por 6 meses), e pH (5-11)
encontradas no meio ambiente, (MUTHUSAMY et al., 2008), tornando assim, o
monitoramento do valor de pH facultativo.
Figura 14 Resultados da fermentao em biorreator. Tenso superficial

versus concentrao de oxignio dissolvido Fonte: A autora
4.6 Pesquisa de biossurfactante intracelular em Bacillus subtilis

Obeservou-se que houve maior produo de biossurfactante interno nas
amostras que continham 3% de extrato de levedura, ocasionando nessas
amostras os menores valores de tenso superficial em relao a maioria das
amostras com 1% e 2% de extrato de levedura (Quadros 5, 6, 7 e 8).
Quadro 5 - Resultados de tenso superficial mN/m - Ensaio de 24 horas
Branco com (a) (b) (c) Mdia

1% de extrato
de levedura 56,3 55,5 54,7 55,5

2% de extrato
de levedura 61,1 59,7 56,6 59,13
3% de extrato
de levedura 51,4 55,6 55,5 54,13
55
Ensaio com (a) (b) (c) Mdia

1% de extrato
de levedura 69,3 69,2 69,2 69,23
2% de extrato
de levedura 65,7 66 65,7 65,8
3% de extrato
de levedura 60,5 63,2 65,4 63
Fonte: A autora

1% de extrato
de levedura 63 62,8 62,7 62,8
2% de extrato
de levedura 72,4 73,4 73 72,93
3% de extrato
de levedura 62,6 68 62,7 64,43
Fonte: A autora

Ensaio com 1% (a) (b) (c)
de extrato de
levedura 0,144 0,089 0,087
de extrato de
levedura 0,093 0,144 0,085
de extrato de
levedura 0,065 0,065 0,067
Fonte: A autora

(a) (b) (c)
Ensaio com 1% de
extrato de 0,047 0,046 0,046
levedura
Ensaio com 2% de (a) (b) (c)
extrato de
levedura 0,043 0,042 0,042
Ensaio com 3% de (a) (b) (c)
extrato de
levedura 0,047 0,047 0,047
Fonte: A autora
56
5 CONCLUSO
O desenvolvimento do presente estudo possibilitou uma anlise sobre os

potenciais dos Gros de kefir como elemento bioindicador de qualidade de guas
contaminadas com benzeno, visto que, os resultados dos experimentos
evidenciaram que os Gros de kefir geraram respostas biolgicas distintas, quando
submetidos a diferentes concentraes de benzeno, presente em guas
biorremediadas com o micro-organismo Bacillus subtilis. Tal fato, torna-se
interessante, uma vez que, atualmente, dentre as principais preocupaes no
estabelecimento de ndices de qualidade de gua, seja em base biolgica ou atravs
de mtodos fsico qumicos e matemticos, tornar as avaliaes ecolgicas com
fins de rotina aplicveis para pessoal no especializado.
Nesse sentido, a utilizao dos gros de kefir como agente bioindicador, pode
ser feita tanto por especialistas, quanto por leigos, pois para realizar a avaliao
necessrio aplicar apenas o princpio da observao, do crescimento ou retrao
dos gros de kefir. Isto porque, grande parte da multiplicao dos gros realizada
por micro-organismos sensveis a poluentes orgnicos, sendo, portanto, a
multiplicao ou a retrao dos gros de kefir uma resposta biolgica, sendo esta
um reflexo da tolerncia ou intolerncia dos micro-organismos Saccharomyces
cerevisiae e Lacbacillus kefiranofaciens concentrao de toxicante no meio.
Alm disso, foi possvel verificar a capacidade biorremediadora do B. Subtilis,
tornando este bioprocesso uma alternativa vivel de descontaminao de guas
que possuem traos de benzeno.
Uma vez que o objetivo principal desse trabalho consistiu em explorar os
potenciais dos gros de kefir como bioindicador, e verificar a capacidade
biorremediadora do B. Subtilis para o benzeno em gua, pode-se considerar que os
objetivos desse trabalho foram alcanados. Pois forneceram resultados significativos
para direcionar novos ensaios mais especficos futuramente.
57
CAPTULO II
Beneficiamento de guas pluviais e da SABESP na UPIBA, e aplicao da

planta Kalanchoe pinnata como agente bioindicador e fitorremediador
1 INTRODUO
As plantas classificadas como macrfitas (macro = grande; fita = planta) so

vegetaes aquticas com formas macroscpicas (WETZEL, 1993 apud HEGEL e
MELO, 2016), visveis a olho nu, e possuem as partes fotossintetizantes
permanentemente, ou por diversos meses, durante todos os anos, total ou
parcialmente submersas em gua doce ou salobra (IRGANG; GASTAL JR, 1996
apud Hegel e Melo, 2016).
SCREMIN-DIAS et al. (1999) apud (HEGEl e MELO, 2016) definem como
macrfitas as macroalgas, musgos, pteridfitas e angiospermas, originrias do
ambiente terrestre com adaptaes para a vida na gua; ou seja, aquelas que
ocorrem tanto em ambientes mais secos da borda dos ambientes aquticos, como
dentro da gua, neste caso, as plantas como a Kalanchoe pinnata que vivem tanto
em gua como em solos, tambm podem ser classificadas como macrfitas.
No Brasil, alguns estudos tm sido realizados para examinar o papel das
macrfitas na melhoria da qualidade da gua (DINIZ ET AL., 2005 apud HEGEL e
MELO, 2016). Os primeiros estudos foram desenvolvidos por MANFRINATO (1989)
apud HEGEL e MELO, 2016), que verificou a eficincia da Eichhornia crassipes
(Aguap), na descontaminao das guas do Rio Piracicaba (SP). FIGUEROA
(1996) apud (HEGEL e MELO, 2016) avaliou as funes ecolgicas das macrfitas
na represa do Lobo (SP). LUCIANO (1996) apud (HEGEL e MELO, 2016) analisou
sua importncia nos processos de reteno e liberao de nutrientes na represa
Jurumirim (SP).
Atualmente, algumas plantas fitorremediadoras so sugeridas pela sua
capacidade de retirar da gua nutrientes e substncias txicas, dando condies
favorveis para a base alimentar nos ecossistemas aquticos MANFRINATO (1989)
apud HEGEL e MELO, 2016). Lemnceas ou lentilhas d' gua, por exemplo, so
muito usadas no caso das guas servidas (esgoto), pela capacidade de se
propagarem rapidamente e de retirarem substncias txicas da gua, outras plantas
58
eficientes so o aguap (Eichhornia crassipesl), a alface-d ' gua (Pis tia stratiotes),
a orelhade-ona (Salvinia auriculata ) e a taboa (Typha domingensisl), que atuam
como indicadoras de ambientes poludos, j que, estas espcies costumam se
desenvolver melhor em ambientes eutrofizados (isto , enrriquecidos por nutrientes),
com altas concentraes de matria orgnica. Enquanto que, a presena de Lrio-
d'gua e algumas espcies de Nymphoides, so bioindicadoras de ambientes menos
poludos (MANFRINATO ,1989) apud (Hegel e Melo, 2016).
De acordo com SUTTON & ORNES (1975) e LORENZI (1991), Lemna e
Spirodela so consideradas excelentes filtros biolgicos, uma vez que conseguem
absorver 97 % do ortofosfato de um lago raso em oito semanas, quando colhidas a
cada semana, e comprova que, alm da remoo de poluentes, as plantas aquticas
podem descontaminar a gua de germes, reduzindo a populao de bactrias
patgnicas, por meio dos microrganismos associados (perifiton), decompositores
de substncias orgnicas, e da absoro de produtos da decomposio e da
oxigenao do sistema.
Algumas plantas, como por exemplo, a orelha-de-ona, possuem grande
capacidade de remover e bioacumular metais pesados, como chumbo ou cdmio.
Porm, quando contaminada no pode ser usada como alimento ou adubo, pois o
descarte dessa biomassa pode contaminar tambm o solo e a gua subterrnea.
Todavia, os metais pesados capturados podem ser reciclados ( POTT & POTT,
2002).
Em relao aos estudos sobre a capacidade fitorremediadora e/ou
bioindicadora da planta kalanchoe pinnata, observa-se que so muitos escassos,
estando as pesquisas sobre esta espcie voltadas basicamente para a sua
aplicao na medicina, como por exemplo, no tratamento de leishmaniose (SILVA,
S. A. G, 1999).
Entre as poucas pesquisas sobre a capacidade bioindicadora da planta
kalanchoe, tm-se alguns estudos com a espcie kalanchoe blossfeldiana,
realizados em cmaras hermticas desenvolvidas no Chile e nos Estados Unidos,
que apresentaram resultados iniciais bastante expressivos para a fitorremediao do
ar contaminado com benzeno em. Nesses estudos, as plantas ficaram expostas
durante 24 horas ao ar contaminado com benzeno, e esta espcie demonstrou uma
grande capacidade fitorremediadora, por efetivar 85% de remoo do benzeno do
ar. Resultados interessantes tambm ocorreram na presena de benzeno e
59
tricloroetileno (TCE) tendo uma remoo de (76,8% do benzeno e 47% do TCE)

(CORNEJO, J.J. and MUOZ, F.G. 1997., apud WETZEL, 2014).
As plantas, como a kalanchoe pinnata, podem tanto ser utilizadas como
indicadores da qualidade da gua, como tambm bioindicadoras da qualidade de
solos, visto que, se adaptam facilmente em ambos os ambientes. Isto porque, as
macrfitas podem ser excelentes bioindicadoras da qualidade de guas, uma vez
que, desempenham importantes funes nos ecossistemas aquticos participando
da ciclagem e estocagem de nutrientes, da formao de detritos orgnicos, do
controle da poluio e da eutrofizao artificial das guas (ESTEVES, 2011;
CAMARGO, 1986; POTT; POTT, 2000 apud HEGEL e MELO, 2016).
As macrfitas (Figura 15), podem atuar como indicadoras de atividade
qumica ou da decomposio de um sistema natural, porque so organismos que
vivem exclusivamente ou preferencialmente em determinados ambientes sendo
capazes, portanto, de caracterizar as propriedades fsicas e qumicas deste
ambiente. Indicando o nvel de nutrientes do ecossistema aqutico.
Contudo, de acordo com CERVI et al. (2009), os estudos sobre as macrfitas
bioindicadoras brasileiras so escassos e esto concentrados em poucas reas do
pas, sendo necessrio aumentar o nmero de pesquisas nesse campo.
(CORDAZZO; SEELINGER, 1988; NOTARE, 1992; IRGANG; GASTAL, 1996;
SCREMIN-DIAS et al. 1999; POTT; POTT, 2000; POMPO; MOSCHINI-CARLOS,
2003; THOMAZ; BINI, 2003 apud HEGEL E MELO, 2016).
Atualmente, os principais mtodos envolvidos nas anlises com as plantas
bioindicadores h o levantamento de espcies, a avaliao das modificaes na
riqueza e os ndices de diversidade; abundncia de organismos resistentes; perda
de espcies sensveis; medidas de produtividade primria e secundria;
sensibilidade a concentraes de substncias txicas (ensaios ecotoxicolgicos),
entre outros (BARBOUR et al., 1999 apud HEGEL e MELO, 2016).
60
Figura 15 - Pistia stratiotes (Alface-d'gua); Salvinia sp. (Orelha-de-rato);

Eichhornia crassipes (Aguap); Myriophyllum aquaticum (Pinheirinho d'gua);
Typha domingensis (Taboa); Nymphaea elegans (Lrio-d'gua).
Desenhos: Katia Sendra Tavares
Fonte: <http://www.ufscar.br/~probio/macrof_des.html>.
Dentre os sistemas de tratamento de efluentes que utilizam as plantas

aquticas esto os sistemas que utilizam plantas aquticas emergentes (PAE) ou
wetlands (zonas midas), estes apresentam um grande potencial para serem
utilizados em atividades industriais, domsticas e agrcolas, como ps-tratamento de
efluentes de reatores anaerbios ou mesmo para etapa nica de tratamento
secundrio (WEF,1994).
61
O sistema wetlands so lagoas ou banhados com plantas aquticas

emergentes, em que os nveis aquticos e as taxas de fluxo podem ser facilmente
controlados e monitorados. O tipo de camada suporte e vegetao so selecionados
a partir das suas capacidades de se adaptarem ao ecossistema e remoo dos
constituintes do efluente (WEF,1994). O sistema de tratamento dimensionado para
condies especficas do local de implantao, o que permite sua construo em
praticamente qualquer tipo de terreno e de clima, chegando a ter altos ndices de
remoes at em temperaturas congelantes, pela parte subterrnea dos vegetais.
Estes sistemas se caracterizam por possuir camadas suporte de substrato
para as plantas e pouco ou nenhum nvel de lmina dgua. Tais sistemas visam
geralmente, remoo de cor, slidos suspensos, matria orgnica, nutrientes,
metais, patognicos, entre outros parmetros.
No Brasil, os avanos em pesquisa e desenvolvimento de bioprocessos e
tcnicas de tratamento de guas residurias tm sido direcionados tanto para
sistemas de grande porte e de maior complexidade, quanto de pequeno porte, baixo
custo e simplicidade operacional, tais como: tanques spticos, lagoas de
estabilizao, reatores anaerbios, disposio nos solos e leitos cultivados
(SCHULZ, 2009). Da mesma maneira, pesquisas tm sido realizadas com tanques
para reaproveitamento de guas pluviais, em vrias partes do mundo, visando
captao e reutilizao da gua, porm, sem nenhum tratamento da mesma
(RAIMONDI & BECCIU, 2014; FRONE & FRONE, 2012; MARTIN et al., 2015.
Neste sentido, o trabalho proposto neste captulo, visa o beneficiamento de
guas pluviais em um tanque com escala piloto para o tratamento de guas, sendo
esse sistema denominado UPIBA. Alm disso aplicar a planta kalanchoe pinnata
como agente bioindicador da qualidade dessa gua, e das guas da SABESP.
A Unidade Piloto de Beneficiamento de gua (UPIBA), possui uma concepo
construtiva simples, de baixo custo (infraestrutura e equipamentos), porm gera
resultados de alta complexidade, devido possibilidade de efetuar a reutilizao de
guas de rejeitos industriais, produzidos por destiladores de gua e osmose reversa,
guas pluviais, e guas tratadas oriundas das estaes de tratamento de gua e
esgoto (ETA e ETE), como a SABESP, por exemplo, por melhorar as caractersticas
fsico qumicas e microbiolgicas das mesma. A UPIBA um sistema que pode ser
implantado em qualquer lugar do mundo, adaptando-se a escala ao volume de gua
que se deseja beneficiar VIEIRA et al. 2014.
62
Neste sistema, tambm possvel a reutilizao guas provenientes de

tratamentos biotecnolgicos, como por exemplo, as biorremeadiadas por Bacillus
subtilis, para remoo de Benzeno (Captulo 1).
Na (UPIBA), aps a gua ser captada ela e passa por um sistema de
mltiplos estgios, que objetiva a melhoria dos aspectos fsico-qumico-
microbiolgicos desta gua. E no segundo estgios do bioprocesso de tratamento da
gua, oncorre, a fitorremediao, por meio do uso de macrfitas como a alface-
dgua, por exemplo (Figura16). As razes dessas plantas filtram os metais pesados
presentes na gua. E utilizam o P (fosforo), K (potssio) e N (nitrognio) que
absorvem da gua como nutriente.
Figura 16 Tanque de biofiltrao com Pistia stratiotes (Alface-d'gua)

Fonte: VIEIRA et al. 2014.
1.1. Definies
1.1.1 Kalanchoe pinnata
A flora brasileira extremamente rica, pois nela existem milhares de espcies

de plantas medicinais, dentre essas plantas est a Kalanchoe pinnata, que apesar
de ser largamente utilizada pela populao, ainda possui poucos estudos que
comprovem as suas propriedades medicinais, estando as pesquisas sobre essa
espcie no Brasil ainda incipientes. Trata-se de uma planta perene, portanto,
facilmente encontrada em diversos climas e regies do mundo, e de fcil
manipulao, devido as suas caractersticas morfolgicas.
63
As diferentes espcies do gnero Kalanchoe (famlia Crassulaceae) so

conhecidas no mbito da medicina popular em diversos pases. Sendo empregada
no tratamento de processos inflamatrios e em diversas doenas. Entre os principais
ativos da Kalanchoe pinnata esto os polifenois (COUTINHO, M.A.S., et al., 2009),
sendo estes flavonoides e antioxidantes.
Entre os flavonoides presentes est a quercetina (MUZITANO M. F., et al.,
2006) que tem mostrado importante ao no tratamento de leishmaniose (SILVA, S.
A. G, 1999). A quercetina e o kaempferol so flavonoides vastamente espalhados
pelo reino vegetal e possuem significante ao anti-inflamatria, que podem ser
atribudas inibio das enzimas fosfolipase A2 (PLA2), 8 lipo-oxigenase, ciclo-
oxigenase e inibio da produo de xido ntrico, atravs da modulao da enzima
iNOS (JUSTO, C. F, 2005; JAAKOLA, L et al., 2004; COUTINHO, M.A.S., et al.,
2009).
Escolheu-se a planta K. pinnata devido a mesma apresentar uma grande
facilidade de micropropagar-se tanto em meios aquticos como terrestres, possuir
alta capacidade de adaptao a diferentes climas e, fceis condies de manejo.
E por ser rica em constituintes fitoqumicos que possuem potencial para
produo de produtos farmacuticos de alto valor agregado, como anti-inflamatrios
e antioxidantes.
1.1.2 Micropropagao
A micropropagao um mtodo de propagao vegetativa amplamente

estudado nas mais diversas espcies vegetais, sendo a modalidade dentro da
cultura de tecidos, que mais tem difundido e encontrado aplicaes prticas
comprovadas (KOZAI, T e KUBOT, 2001). Entre as vantagens de sua utilizao,
est a possibilidade da obteno de vrias plantas a partir de um explante inicial,
independente da estao do ano, alm da reduo do tempo e da rea necessria
propagao da espcie. E, devido as melhores condies sanitrias, por meio do
cultivo de meristemas previamente tratados por termoterapia, h a reproduo do
gentipo da planta-me, geralmente, com fidelidade durante a multiplicao, que
permite a propagao vegetativa de espcies difceis de serem propagadas por
outros mtodos.
64
Entretanto, na micropropagao convencional, com produo in vitro, o meio

de cultivo sinttico e acrescido de sacarose e hormnios, o que torna esse mtodo
oneroso. Nesta tcnica, a natureza heterotrfica ou fotomixotrfica de crescimento
das plantas diretamente ou indiretamente, responsvel pela maioria dos fatores
relacionados ao custo de produo das plantas micropropagadas (KOZAI, T e
KUBOT, 2001), uma vez que h necessidade de um alto consumo de energia
eltrica.
Enquanto que, a micropropagao fotoautotrfica realizada custa de luz
natural, sendo, portanto, mais vivel economicamente, alm de proporcionar um
crescimento maior para as plantas, uma vez que a remoo da sacarose do meio de
cultura, melhora as caractersticas fisiolgicas da planta. O crescimento de plantas
aquticas como as macrfitas e as algas ocorre de maneira fotoautrfica pela
utilizao de CO2 ou uma de suas formas hidratadas para a sntese de compostos
orgnicos. Na gua, o CO2 pode apresentar-se como H2CO3, HCO3- ou CO3-2,
dependendo do pH (RICHMOND, 1990).
E, devido s condies ambientais de cultivo serem mais naturais, h tambm
reduo do estresse da planta durante a aclimatizao, aumentando a porcentagem
de sobrevivncia das mudas (HEMPEL, M., 2003; AFREEN, F. et al., 2002; KOZAI,
T e KUBOT, 2001), eliminao dos custos com iluminao e reduo dos custos
com reparos e manuteno, e ainda, possibilidade de utilizao de instalaes
simplificadas (KODYM, A. e ZAPATA-ARIAS, F.J., 1999).
1.1.2.1 Processos fotossintticos
A palavra fotossntese significa construo ou sntese pela luz. A fotossntese

o processo pelo o qual as plantas sintetizam compostos orgnicos a partir de
matria prima inorgnica na presena de luz solar. As plantas e as algas e certas
bactrias captam essa energia diretamente da radiao solar e a utilizam para a
sntese de alimentos essenciais. Por conseguinte, no nosso planeta a fonte primaria
de toda energia metablica o sol e a fotossntese e so essenciais para a
manuteno de todas as formas de vida aqui existente.
O processo de fotossntese pode ser definido como um sistema mediante o
qual a energia luminosa utilizada na sntese de compostos orgnicos. Assim,
65
pode-se classificas os organismos vivos em dois grandes grupos: autotrficos e

heterotrficos. Os autotrficos so capazes de sintetizar suas prprias substncias
complexas a partir de substancias simples como CO2 e H2O, utilizando a energia
proveniente de diversas fontes. De acordo com o tipo da fonte energtica, tm-se
autotrficos fotossintetizantes e os autotrficos quimiosintetizantes os quais utilizam
a luz solar e a energia resultante da reao de xido-reduo, respectivamente
(FERRAZ,1986).
Enquanto que, os seres heterotrficos obtm a energia necessria para a sua
sobrevivncia mediante reaes degradativas de molculas complexas que retiram
do meio ambiente e convertendo-as em CO2 e H2O (FERRAZ,1986).
2 OJETIVOS
2.1 Objetivos gerais:
O trabalho proposto neste captulo, visa qualificao, por meio da

planta kalanchoe pinnata, de guas pluviais beneficiadas em um tanque piloto de
tratamento de guas, sendo esse sistema denominado UPIBA (Unidade Piloto de
Beneficiamento de gua), aplicando a planta como agente bioindicador e
fitorremediador. Visando a contribuio com a conservao e a melhoria da
qualidade ambiental, especialmente da qualidade da gua.
2.2 Objetivos especficos
Quantificao da produo de flavonoides nas folhas micropropagadas, afim

de justificar a viabilizao de uma produo em larga escala de k. Pinnata por
meio da micropropagao fotoautotrfica, tendo em vista o mercado nacional
de insumos para a produo de fitoterpicos.
66
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Unidade Piloto de Beneficiamento de gua (UPIBA)
O sistema UPIBA consiste de cinco tanques de acrlico idnticos com

espessura de 10 mm, 250 mm de altura, dimenses externas de 1.000 mm por
1.000 mm e medidas internas de 990 mm de largura por 975 mm de comprimento. O
nvel de gua dentro do sistema pode variar de 10 mm a 240 mm, sendo que o nvel
de gua ideal para operao est entre 170 mm e 180 mm. A capacidade
volumtrica ideal de cada tanque para operao de 32L, enquanto que a do
sistema todo varia de 160L a 180L (VIEIRA et al. 2014).
No primeiro tanque, recebeu-se as guas de origem pluvial ou provenientes
da SABESP, a vazo nesse tanque foi controlada para se obtivesse um fluxo laminar
e ocorresse a sedimentao. Uma vez que, esse tanque possui uma tubulao
acoplada a um campo magntico, para aglutinar os sais slidos de natureza
cristalina e gelificada. No processo ocorreu, ento a separao de misturas do tipo
slido-lquido e lquido-lquido, com base na diferena de densidade e solubilidade
de seus componentes. O tempo de sedimentao dos sais presentes na gua foi
determinado pela vazo de fluxo do sistema (VIEIRA et al. 2014).
No segundo tanque, ocorreu a biofiltrao, utilizando plantas Kalanchoe
pinnata. No terceiro tanque ocorreu a microfiltrao, este tanque continha camadas
de esferas de vidro (material filtrante inerte), com dimetro que varia de 2 mm a 2,8
mm, para reteno das partculas e compostos, que no foram removidos nas
etapas anteriores. O fluxo laminar em nmero de Reynolds = regime laminar de
Reynolds foi ajustado com a fonte de gua captada, para velocidade de 0,0013m/s,
viscosidade da gua 1,0030x10-3, densidade 1kg/l), compatvel ao sistema, e
compatvel ao limite mximo de perda de carga, determinada pela disposio das
esferas (VIEIRA et al. 2014).
A gua passou pelas microesferas de vidro que, reteram as micropartculas, a
gua ento, filtrada passou por uma ranhura de 5 mm, junto ao leito do tanque de
microfiltrao para o quarto tanque.
No quarto e no quinto tanque ocorreu a ozonizao e radiao UV para
desinfeco da gua. A radiao UV uma onda eletromagntica com um
comprimento de onda de 380 nm a 1 nm. A radiao UV, teve como finalidade
67
efetuar o processo de desinfeco de microrganismos. Nesse estgio, a gua foi

arrastada e agitada por uma bomba modelo Jato 2500, o gs oznio foi produzido
por um ozonizador de 400 mg/h de voltagem de 220 Volts, o gs foi adicionado
gua, agitada pela bomba, essa gua possua um sentido obrigatrio para passar
atravs de uma comporta (em diferena de nvel) para o outro tanque de oznio, que
tambm possuia uma bomba similar a anterior, ambas com uma vazo de 700 L/h,
para que agitao e a mistura do oznio fosse homognea. O oznio tambm teve
como finalidade efetuar a desinfeco da gua (VIEIRA et al. 2014).
3.1.1 Captao das guas pluviais
As guas pluviais foram coletadas mensalmente (uma ou duas coletas de

gua pluvial para anlise, no perodo de chuvas) de acordo com a Norma ABNT
NBR 15527/07. A gua pluvial foi captada por um sistema cncavo em inox,
projetado pelo aluno Norberto Vieira e Professora Christina Penna, com a rea de
captao de 4,00 m2, situado na cobertura do edifcio do semi-industrial. Para que
no haja interferncia de elementos estranhos captao, a gua captada por esse
sistema canalizada para armazenamento em uma caixa de gua de PVC de 300L,
localizada no laboratrio de microbiologia aplicada, no primeiro andar do edifcio
semi-industral, onde est o UPIBA. A gua armazenada nesta caixa dgua
transferida para um barrilete de 50L, denominado RAINWATER, atravs de uma
mangueira de 12mm de dimetro.
3.2 Anlises microbiolgicas
As anlises microbiolgicas foram realizadas com amostras de 100 ml de

gua beneficiada, coletada na UPIBA, e filtradas vcuo em membranas filtrantes
de 0,45 m microbiologicamente estreis. Aps a filtrao, as membranas foram
assentadas em placas de Petri contendo meio de cultura R2A gar para contagem
de heterotrficos, e em seguida incubadas a 33-37C. Aps o perodo de incubao,
as unidades formadoras de colnias (UFC/100mL) presentes na superfcie das
membranas filtrantes foram contadas.
68
Para a anlise de coliformes, utilizou-se uma metodologia que permite a

quantificao por nmero mais provvel (NMP) de microorganismos, pesquisou-se
o nmero de coliformes e a concentrao de Escherichia coli. O ensaio de
determinao desses microorganismos consistiu na inoculao de volumes
decrescentes da amostra em meio de cultura Tryptophan Broth Agar (TBA), sendo
cada volume inoculado em uma srie de tubos. Durante a anlise de gua, utilizou-
se o fator 10 de diluio, sendo inoculados mltiplos e submltiplos de 1mL da
amostra, usando-se sries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado. Aps a
inoculao os tubos foram incubados a 30-37C por 18-24. Neste ensaio, a
combinao de resultados positivos e negativos permitiu a obteno de uma
estimativa da densidade das bactrias pesquisadas, atravs da aplicao de
clculos de probabilidade, com base na tabela NMP (FDA, 2010).
3.4 Biofiltrao e uso da Kalanchoe pinnata como indicador biolgico
A funo da biofiltrao na UPIBA (Figura 17) reter e neutralizar, por meio

das razes das plantas, a poluio ou material em suspenso, fosforo, nitratos. A
planta utilizada como bioindicador, alm de realizar as funes citadas, tambm
indica o nvel de saprobidade da gua.
Figura 17 - (A): K. pinnata com suas razes em evidncia;

e (B): K. Pinnata com multibrotos laterais.
Fonte: A autora
3.3.1 Micropropagao fotoautotrfica

69
As folhas de Kalanchoe pinnata, inicialmente desenvolvidas em terra, foram

transferidas individualmente para recipientes nos quais foram colocadas submersas
em gua oriunda da unidade piloto de beneficiamento de guas (UPIBA). Os
recipientes foram mantidos temperatura ambiente, providos da luz direta do dia
(fotoperodo).
As folhas foram identificadas (Figura 18), e mensuradas conforme a (Figura
19), aps um perodo de sete a dez dias de permanncia na mesma gua, as
dimenses dos brotos provenientes de fololos e respectivas razes foram
mensuradas novamente, e a gua renovada. Prosseguiu-se o acompanhamento do
desenvolvimento da micropropagao, mensurando-se as dimenses das razes,
formao, e crescimento dos brotos em relao ao tempo de cultivo.
Fez-se ento, a identificao das novas folhas, cada broto, com suas folhas e
razes, foi transferido para a terra enriquecida com hmus, e repetiu-se o processo
de acompanhamento e mensurao da K. pinnata durante a sua micropropagao.
Figura 18 - identificao das folhas de Kalanchoe pinnata no incio

da micropropagao em gua.
Fonte: A autora
70

Figura 19 - Folhas de Kalanchoe pinnata identificadas. Fonte: A autora
3.4 Preparo do extrato de folhas de Kalanchoe pinnata
Realizaram-se as extraes das folhas desenvolvidas para avaliar as concentraes

de flavonoides. O extrato alcolico de 100 g de folhas foi macerado em lcool cereal,
e transferido quantitativamente para balo volumtrico de 100 ml, e o volume final
completado com lcool cereal.
3.4.1 Determinao dos flavonoides totais, equivalentes em catequina.
Transferiu-se 0,5 ml da soluo do extrato de K. pinnata, para um balo

volumtrico de 25 mL, acrescentou-se 0,100 mL de cloreto de alumnio a 10% com
4,3 mL de lcool cereal. Adotou-se o mesmo procedimento experimental de
diluies, descrito a seguir (para a verificao da linearidade), para a elaborao da
curva da resposta da absorbncia em funo da concentrao (g/mL) variando de
60 a 260 (g/mL) de flavonoides, equivalentes em catequina, utilizando a equao
da reta proveniente da curva analtica da catequina, sendo esta usada como padro
de referncia secundrio, avaliou-se a linearidade.
Para a verificao da linearidade, foi elaborada a curva analtica com a
soluo estoque de catequina padro de referncia secundrio (pureza = 98%) na
concentrao de 500,0g/mL em lcool cereal.
71
A partir da soluo estoque foram preparadas diluies nas concentraes de

0,084; 0,05; 0,028; 0,017; 0,0076 g/L, que reagiram com 0,100 mL da soluo de
cloreto de alumnio 10% (v/v), completando-se o volume com soluo etanlica de
lcool cereal. Aps 40 min de repouso, procedeu-se leitura em espectrofotmetro
a 510 nm, utilizando como branco lcool cereal o solvente acrescido da soluo de
cloreto de alumnio.
Elaborou-se a curva analtica, verificando-se a linearidade do mtodo,
empregando a observao visual e anlise estatstica adequada, obtendo - se a
equao da reta e o coeficiente de correlao linear. A equao (1) representa a
equao da reta da curva analtica da catequina padro de referncia secundrio,
onde y absorbncia e x concentrao de catequina padro de referncia
secundrio:
Y = 10.121 x 0, 0475 (1)

(r2 = 0,9936)
A partir da obteno de uma reta para a curva analtica e do coeficiente de

correlao linear (r2) 0,9936 foi verificada a linearidade do mtodo.
4 RESULTADOS E DISCUSSO
72
4.1 Ensaios microbiolgicos
Quadro 9 - Resultado em (%) das bactrias encontradas
N colnias
Amostras Micro-organismos % identificada
UFC/mL
gua Sabesp (100) Muitos esporos

e bactrias Incontveis __
(Figura 20)
saprfitas ao redor
Pseudmonas 10 1,82
alcaligenes
Staphylococcus
aureus (colorao 10 1,82
gua Sabesp (102) com
amarelo escuro)
tratamento de UV (30 minutos) e
Aspegillus (tufos
Oznio (60 minutos). 02
com aspecto de 0,36
(Figura 21)
nvoa branca)
Enterococcus
(colorao 200 36,49
alaranjada)
Staphylococcus
aureus (colorao 30 5,5
amarelo escuro)
gua pluvial (10-1) com
Enterococcus
tratamento de UV (30 minutos) +
(colorao 20 3,65
Oznio (60 minutos).
alaranjada)
(Figura 22)
E. coli (colorao 50 9,12

esbranquiada)
Enterococcus
(colorao 10 1,82
alaranjada)
gua pluvial (10-2) com Staphylococcus
tratamento de UV (30 minutos) + aureus (colorao 1 0,18
Oznio (60 minutos). amarelo escuro)
(Figura22)
esbranquiada)
Leveduras 10 1,82
gua deionizada com lcool
70% tratada com UV __ __
__
(3 a 5minutos). (Primeira placa
da Figura 23)
73
N colnias
Amostras Micro-organismos % identificada
UFC/mL
Tubulao limpa com lcool

70% sem UV apresentou uma E. coli (colorao
contagem e com o esporo esbranquiada) Incontveis __
alastrando por toda a placa
(terceira placa da Figura 24)
Fungos zigomiceto
com miclios 02 0,36
brancos cheios de
Tubulao com gua deionizada pontos escuros
e lcool 70% Enterococcus
(Placa central da Figura 24). (colorao 200 36,49
alaranjada)
esbranquiada)
Contagem Total 548 100
Fonte: A autora
0
Figura 20 - Contagem em UFC/mL (10 ) Sabesp + UV+ O3, com
o tempo de O3 variando de 30min a 60min.
Fonte: A autora
-2
Figura 21 - Contagem em UFC/mL (10 ) Sabesp + UV+ O3, com o
tempo de O3 variando de 30min a 50min
Fonte: A autora
74
-0 -3
Figura 22 - Contagem em UFC/mL (10 a 10 ) Chuva + UV+ O3, com
o tempo de O3 variando de 30min e 60min
Fonte: A autora
Figura 23 - Contagem em UFC/mL gua deionizada com lcool 70% com

UV de 3 a 5 min. Fonte: A autora
Figura 24 - Contagem em UFC/mL gua deionizada com lcool 70%.

Fonte: A autora
75
Durantes o tratamento das guas, SABESP e pluvial, testou-se o gs oznio

em diferentes tempos (5, 10 e 20 minutos), de aplicao e notou-se que no foi
eficiente para a limpeza das guas. Observou-se tambm que, foram necessrios ao
menos 30 minutos de aplicao de gs oznio para que o mesmo tivesse os
mesmos resultados obtidos em 15 minutos de aplicao de radiao UV. Com base,
nesses resultados preliminares, optou-se por fixar essa razo de proporo para ser
aplicada a todos os ensaios de tratamento das guas.
Fez-se ento, a aplicao de 30 minutos de UV e 60 minutos de oznio nas
amostras analisadas, com exceo para a gua deionizada com lcool 70% que
foram tratadas com UV (3 a 5minutos).
Nos experimentos, notou-se tambm, que associao das duas tcnicas foi
eficiente quando a radiao UV foi aplicada durante 30 minutos na gua aps a
aplicao de oznio durante 20 minutos. Tendo uma reduo em cerca de 99% (ou
dois ciclos da populao microbiana inicialmente presente na gua pluvial e na gua
da SABESP placa (A) (Figura 25). Uma possvel explicao para este resultado,
o fato da radiao UV ser capaz de degradar o oznio preexistente no meio,
formando O2 (potencial redox 1,23 V) e oxignio nascente [O] (potencial redox
2,42 V), sendo este, por sua vez, mais reativo que o prprio O3 (potencial redox
2,07 V) (TEIXEIRA, et al., 2004.), o que torna a associao das duas tcnicas
aplicadas nesta ordem mais eficaz do que empregadas com a ordem inversa,
como pode ser observado na placa (B) repleta de E. coli (Figura 25).
Figura 25 - (A): Membrana com gua SABESP beneficiada na UPIBA com 20 min de oznio e
em seguida com 30 min com UV; (B): Membrana com gua SABESP beneficiada na UPIBA
com 30 min de UV e em seguida 20 min com oznio repleta de E. coli. Fonte: A autora
76
Observou-se tambm que, a desinfeco prvia com lcool 70% e gua

deionizada dentro da tubulao da UPIBA, no foi eficiente, visto que, apresentou
esporos, como se nota na terceira placa da (Figura 24), e na placa central da
(Figura 24). Porm, no tratamento em que se realizou a limpeza prvia da tubulao
com lcool 70% e aplicou-se a radiao UV durante 3 a 5minutos, obteve-se uma
diferena significativa, pois inibiu a esporulao, evidente na primeira placa da
(Figura 23).
4.2 Micripropagao de kalanchoe pinnata
As folhas de K. pinnata, inicialmente, mensuradas, identificadas e

desenvolvidas em terra, enriquecida com biomassa de frutas (biofertilizante), foram
transferidas individualmente para recipientes nos quais foram colocadas submersas
em guas da SABESP e gua pluvial beneficiadas na unidade piloto de
beneficiamento de guas (UPIBA).
Em primeiro momento, a micropropagao no foi realizada diretamente
dentro do tanque de biofiltrao da UPIBA, pois a luz solar no incidia diretamente
sobre as plantas, no, local onde a UPIBA estava instalada, o que causou em uma
amostra o fenmeno da estiolao (Figura 17), assim, realizaram-se os ensaios
dentro de duas bandejas de plstico, uma contento um litro de gua da SABESP e
outra contendo um litro de gua de pluvial, os recipientes foram mantidos
temperatura ambiente, providos da luz direta do dia (fotoperodo).
As folhas, imersas em gua, produziram razes provenientes de todos os
fololos, e brotos, pr-existentes em um perodo de 7 a 10 dias, e entre um perodo
de 30 e 60 dias notou-se a multiplicao do nmero de fololos como pode-se
observar nas Figuras 27, 28, 29, 30. Em perodo similar, a folha cultivada na terra
desenvolveu, em mdia, dois brotos em 10 dias, e em 40 dias a altura da haste
principal atingiu em mdia 8cm, com 8 folhas novas para cada broto, que possuam
dimenses similares quela da folha me.
Notou-se, entretanto, que as folhas micropropagadas tanto em guas da
SABESP, quanto em guas pluviais produziam multibrotos com fololos de
dimenses diminutas lado (B) (Figura 26), trs vezes menores, em relao aos que
eram produzidos pelas folhas micropropagadas em terra enriquecida com nutrientes
77
orgnicos, sendo estes grandes e viosos lado (A) (Figura 26). Neste estgio, as
folhas com os fololos diminutos mantinham o crescimento estagnado, sendo
necessria sua transferncia para novo cultivo em gua.
Figura 26 - (A) Kalanchoe pinnata micropropagada em terra enriquecida

com biomassa de frutas (biofertilizante); (B) Kalanchoe pinnata
micropropagada em gua da SABESP e em gua pluvial. Fonte: A autora
Tal fato, pode ser explicado pelo esgotamento dos nutrientes orgnicos nas
guas avaliadas, o que levou ada planta a trabalhar em regime basal, essa
diminuio na atividade fisiolgica da planta, levou a formao de brotos mltiplos, e
a estagnao do crescimento dos fololos. Evidenciando, que a planta K. pinnata
atuou como um agente fitorremediador, por esgotar a matria orgnica presente na
gua, e como agente bioindicador de qualidade da gua, visto que, evidenciou que
tanto a gua da SABESP, quanto pluvial, aps a fitorremediao, tinham pouca ou
nenhuma, matria orgnica dissolvida, estagnando o seu desenvolvimento, e
qualificando-as como guas desprovidas de matria orgnica. Alm disso
apresentou boa reprodutibilidade durante a micropropagao, observada na mdia
da quantidade de brotos e fololos gerados a partir das folhas primrias, tendo uma
margem de erro menor que 5 % (P<0,05).
Neste caso a K. pinnata, mostrou que pode ser uma bioindicadora, que se
enquadra na categoria, de plantas que atuam como indicadoras de ambientes
poludos, j que, estas espcies costumam se desenvolver melhor em ambientes
78
enriquecidos por nutrientes, e/ou com altas concentraes de matria

orgnica. Como por exemplo, as Lemnceas ou lentilhas d' gua, que so muito
usadas no caso das guas servidas (esgoto), pela capacidade de se propagarem
rapidamente e de retirarem substncias txicas da gua, outras plantas como o
aguap (Eichhornia crassipesl), a alface-d ' gua (Pis tia stratiotes), a orelhade-ona
(Salvinia auriculata) e a taboa (Typha domingensisl) (MANFRINATO, 1989) apud
(HEGEL e MELO, 2016).
Isto porque, para um organismo ser considerado um bioindicador o mesmo
deve ser preferencialmente, um elemento endmico de determinado ecossistema,
assim, como a K. pinnata se adapta melhor em ambientes ricos em matria
orgnica, ela pode ser considerada um bioindicador guas e de solos ricos em
nutrientes. Podendo tambm ser considera um agente biondicador negativo, ou seja,
que no ir se desenvolver plenamente, por ser uma espcie que se adapta melhor
em meios ricos em matria orgnica, e que, portanto, no ir evoluir totalmente em
sistemas despoludos.
Com isso, a planta kalanchoe pinnata, pode tanto ser utilizadas como
indicadores da qualidade da gua, como tambm fitorremediadora da gua, pois
sendo uma macrfita poder atuar desempenhando importantes funes nos
ecossistemas aquticos, participando da ciclagem e estocagem de nutrientes, da
formao de detritos orgnicos, do controle da poluio e da eutrofizao artificial
das guas (ESTEVES, 2011; CAMARGO, 1986; POTT; POTT, 2000 apud Hegel e
Melo, 2016).
Alm disso, as folhas de k. Pinnata, depois da fitorremediao, tambm
podem vir a ser colhidas e destinadas para fins medicinais, visto que so ricas em
compostos bioativos, como os flavonoides.
Isto porque, apesar de o Brasil ser um pas rico em fauna e flora, atualmente,
ainda se encontra atrasado no campo de tratamentos fitoterpicos, e precisa de
aes estratgicas para a produo de insumos para este setor. Haja visto que, no
mercado brasileiro inexistem polticas efetivas de produo, padronizao e
rastreabilidade de drogas vegetais e plantas medicinais para consumo domstico e
insumos para produo de fitoterpicos em indstrias, tornando o Brasil e os seus
vizinhos da Amrica Latina dependentes de importaes. Constituindo-se tal fato,
em uma questo de segurana nacional. Para se ter uma ideia, em caso de
interrupes abruptas nas importaes de matrias-primas e medicamentos
79
qumicos, cerca de 25% dos pacientes diabticos correriam risco de vida, 15% dos
hipertensos e portadores de lceras gastroduodenais estariam privados de
medicao, uma vez que, o pas importa aproximadamente 90% do que consome
deste tipo de matria-prima (PANIZZA, 2010).
Figura 27- Amostras 1 e 2 de Kalanchoe pinnata

Fonte: A autora
Figura 28 - Amostras 3 e 4 de Kalanchoe pinnata

Fonte: A autora
80
Figura 29 - Amostras 5 e 6 de Kalanchoe pinnata

Fonte: A autora
Figura 30 - K. pinnata (todas as folhas com tamanhos variados).

ANOVA: P < 0,05 ***
Fonte: A autora
81
4.3 Dosagem dos flavonoides das folhas de K. pinnata
Os extratos das folhas desenvolvidas foram avaliados por espectrofotometria,

quanto concentrao de flavonoides, sendo esta, aquela mnima necessria para
justificar as atividades medicinais dos extratos das folhas de Kalanchoe pinnata. Na
Tabela 2 verifica-se o resultado da quantificao de flavonoides totais, equivalentes
em catequina, no extrato de Kalanchoe pinnata, com valor mdio de 42,39 g/mL.
Tabela 2 - Dosagem espectrofotomtrica dos flavonoides totais equivalentes em catequina presentes

no extrato de Kalanchoe pinnata a 510nm.
EKp: Extrato de Kalanchoe pinnata: CF: concentrao de flavonoides totais, equivalentes em
catequina.
Concentrao
do EKp Absorbncia CF
(g/mL) (nm) (g/mL)
60,0 0,2230 17,34
100,0 0,3320 28,00
140,0 0,4219 36,00
180,0 0,5543 50,00
220,0 0,6030 54,00
260,0 0,7456 69,00
Mdia: 42,39
Fonte: A autora
Tendo em vista que a espcie K. pinnata faz parte da Relao Nacional de

Plantas Medicinais de Interesse do Sistema nico de Sade (SUS), faz-se
necessrio promover a populariazao do uso dessa planta para diversas
finalidades, como por exemplo para a fitorremediao, visto que ela pode remediar a
gua contaminada, e a sua biomassa ser colhida e destinada para outros fins, como
as indstrias de insumos para produo de medicamentos fitoterpicos aps um
controle de qualidade, e ensaio ecotoxicolgico que comprove a sua inocuidade,
com relao ao fenmeno de bioacumulao.
Para atingir esse objetivo, este trabalho prev uma abordagem do ponto de
vista, estratgico, para viabilizar uma produo em larga escala dessa planta
utilizando como ferramentas a tcnica de micropropagao fotoautotrfica, para
obter uma grande quantidade de insumos para a indstria de fitoterpicos e ao
mesmo tempo colaborar com a despoluio de guas.
82
5 CONCLUSO
Os ensaios aplicando a K. pinnata como agente bioindicador, sugeriu que a

mesma pode ser uma bioindicadora positiva em ambientes poludos, j que,
estas espcies costumam se desenvolver melhor em ambientes eutrofizados,
isto , rico em matria orgnica.
Constatou-se a reprodutibilidade da produo da planta K. pinnata em um

perodo de cinco meses, em que a mesma micropropagou-se em gua
gerando um nmero mdio de novas folhas significativo com uma margem de
erro menor que 5%.
No aspecto microbiolgico, observou-se, que a associao das tcnicas de

aplicao de gs oznio + radiao UV para a desinfeco da gua
mostrou-se eficiente, exatamente nessa ordem, na qual a gua deve, na
UPIBA, primeiro ser tratada com o oznio e depois com o UV, visto que o
mesmo degradou o oznio pr-existente no meio, formando O2 (potencial
redox 1,23 V) e oxignio nascente [O] (potencial redox 2,42 V), sendo
este, por sua vez, mais reativo que o O3 (potencial redox 2,07 V), o que
causou a a reduo de carga microbiana em 99%, ou dois ciclos da
populao inicialmente presente na gua pluvial e na gua da SABESP.
O beneficiamento de guas da SABESP e pluviais na UPIBA interessante,

visto que a fitorremediao associada com o tratamento fsico qumico diminui
os componentes txicos presentes na gua, responsveis pela diminuio do
tempo de vida til dos filtros de osmose reversa dos destiladores dos
laboratrios. Impactando na reduo do custo para a produo de gua
purificada.
O alto teor de flavonoides em 42,39 g/mL encontrados nos extratos das

folhas de K. pinnata, fundamenta o desenvolvimento de novas pesquisas com
o objetivo de viabilizar a produo dessa planta em larga escala, visando o
mercado nacional e internacional de produtos fitoterpicos.
83
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94
ANEXOS OBRIGATRIOS
95
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Secretaria de Ps-Graduao
Informaes para os Membros de Bancas Julgadoras de

Mestrado/Doutorado
1. O candidato far uma apresentao oral do seu trabalho, com durao

mxima de trinta minutos.
2. Os membros da banca faro a arguio oral. Cada examinador dispor,
no mximo, de trinta minutos para arguir o candidato, exclusivamente sobre o tema do
trabalho apresentado, e o candidato dispor de trinta minutos para sua resposta.
2.1 Com a devida anuncia das partes (examinador e candidato),
facultada a argio na forma de dilogo em at sessenta minutos por examinador.
3. A sesso de defesa ser aberta ao pblico.
4. Terminada a argio por todos os membros da banca, a mesma se
reunir reservadamente e expressar na ata (relatrio de defesa) a aprovao ou
reprovao do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argio.
4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comisso
Julgadora dever emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado
na ata.
4.2 Ser considerado aprovado o aluno que obtiver aprovao por
unanimidade ou pela maioria da b a n c a .
5. Dvidas podero ser esclarecidas junto Secretaria de Ps-
Graduao: pgfarma@usp.br, (11) 3091 3 6 2 1 .
So Paulo, 23 de maio de 2014
Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior

Presidente da CPG/FCF/USP
Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitria - CEP 05508-900 - So Paulo - SP
Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 e-mail: pgfarma@usp.br
96
Faculdade de Cincias Farmacuticas
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA BIOQUMICO-FARMACUTICA
Lineu Prestes, 580 Bloco 16 Cidade Universitria
05508-900 So Paulo SP
Fone: 3091.3886 Fax 3815.6386
DECLARAO DE DISPENSA DE ANLISE DO COMIT DE TICA EM PESQUISA
So Paulo, 13 de agosto de 2015.
Aos Membros da banca Examinadora,
Eu, Carla Roberta da Silva Neves dos Santos, nmero USP 7298732,
matriculada no curso de Ps-Graduao da Faculdade de Cincias Farmacuticas,
no programa de Ps-Graduao de Tecnologia Bioqumico-Farmacutica, em
concordncia com minha orientadora, Prof. Dra. Thereza Christina Vessoni
Penna, declaramos, para dos devidos fins, que o Projeto de Mestrado intitulado:
Bioprocessos e bioindicadores de tratamento e monitoramento de guas:
desenvolvimento e aplicaes, dispensou anlise do Comit de tica em Pesquisa
e/ou do Comit de tica em Experimentao Animal desta Instituio.
Atenciosamente,

Mestranda
Prof. Dra. Thereza Christina Vessoni Penna

Orientadora
97
FICHA DO ALUNO
98
99
100
101
APNDICE 1
Dados experimentais da micropropagao de K. pinnata.
Kalanchoe pinnata
Comprimento Largura Fololos Brotos Altura Raiz Folhas
09/02/2015 18 cm 12,5 cm 10 3 com 1

iniciando cm
02/03/2015 18 cm 12,5 cm 31 13 2,5 6,5 em 4e6

mdia cada
09/03/2015 18 cm 12,5 cm 31 13 3 8 cm 4e6

1 cada
18/03/2015 18 cm 12,5 cm 31 13 4 7 cm 4a6

cada
25/03/2015 18 cm 12,5 cm 31 13 5,5 a 6,5 cm 8 cm 8 a 10

cada
30/05/2015 18 cm 12,5 cm 31 13 3,5 a 6,5 cm 9 cm 6 a 10

cada
08/04/2015 18 cm 12,5 cm 31 1 11 cm 5 cm 10 cada
18 cm 12,5 cm 31 1 11,5 cm 6 cm 12
15/04/2015 11 9/8/4 cm (na 5 cm 6 a 8(na

vermiculita) vermiculit
a)
22/04/2015 18 cm 12,5 cm 31 1 12 cm 5 cm 12

09/02/2015 15,7 cm 10 cm 25 11 com

(gema) raiz
02/03/2015 15,7 cm 10 cm 31 9 1,5 a 2,5 cm 6,5 em

mdia
09/03/2015 15,7 cm 10 cm 31 4 2,5 e 4 cm 7 a 10 cm 4a5

6 em cada
desenvolvimento
2 18/03/2015 15,7 cm 10 cm 31 7 2,5 a 4 cm 7 a 10 cm 4a6
cada
25/03/2015 15,7 cm 10 cm 31 7 3 e 4 cm 14 cm 4a6

cada
30/05/2015 15,7 cm 10 cm 31 7 3,7 a 4,5 cm 11 cm 4e6

cada
08/04/2015 15,7 cm 10 cm 31 7 5,3 cm 11 cm 6 cada
15/04/2015 15,7 cm 10 cm 31 4 3,5 a 4,5 cm 12 cm 4e6

cada
22/04/2015 15,7 cm 10 cm 31 4 4 a 6,5 cm 6,5 cm 6 cada

09/02/2015 13 cm 9,7 cm 16 Gema
iniciando
raiz
02/03/2015 13 cm 9,7 cm 26 11 1,5 a 3,5 cm 6,5 em 4a6
mdia cada
09/03/2015 13 cm 9,7 cm 26 10 3 a 5 cm 8 cm 2e4

3 cada
18/03/2015 13 cm 9,7 cm 26 9 3,5 cm 8 cm 4a6

cada
25/03/2015 13 cm 9,7 cm 26 4 a 6 cm 6 cm 6
cada
30/05/2015 13 cm 9,7 cm 26 9 3,5 a 6,5 cm 5,5 cm 4e6

cada
08/04/2015 13 cm 9,7 cm 26 4 1/ 3,2 / 4 cm 5 cm 4e6

cada
15/04/2015 13 cm 9,7 cm 26 3 1,5 cm 2,5 cm 4 a 6

4 cm 3 cm cada
5,3 cm 9 cm
22/04/2015 13 cm 9,7 cm 26 2 4 e 5 cm ( 3,5 e 8 cm 2
no cada
evoludos)
09/02/205 14 cm 9 cm 25 com 13 com
raiz raiz de 1
cm
02/03/2015 14 cm 9 cm 26 3 e 9 iniciando 1,5 e 2 cm 6,5 em 2e4
mdia cada
4
09/03/2015 14 cm 9 cm 26 2; 8 2,5 e 3 cm 6 cm 6
desenvolvendo cada
18/03/2015 14 cm 9 cm 26 4 1,5/ 2 a 4 7 cm 6
cm cada
25/03/2015 14 cm 9 cm 26 3/ 3,5 e 5 8 cm 4e6

cm cada
30/05/2015 14 cm 9 cm 26 4; 6 no 2,5 a 5 cm 7 a 11 4e6

desenvolveram cm cada
08/04/2015 14 cm 9 cm 26 4 5/ 5,5/ 4,5/ 14 cm 6

3,5 cm cada
15/04/2015 14 cm 9 cm 26 2; 3 iniciando 3,5 e 5 cm 12 cm 6
cada
22/04/2015 14 cm 9 cm 26 2; 3,5 e 5 cm 10 cm 6
1 desenvolvendo 1,5 cm cada
Kalanchoe pinnata
Comprimento Largura Fololos Brotos Altura Raiz Folha
s
09/02/2015 11 cm 5,5 cm 12 2 de 1 cm
iniciando
raiz
02/03/2015 11 cm 5,5 cm 17 9 2 cm 5 cm em 4a6
mdia cada
09/03/2015 11 cm 5,5 cm 17 8 2,5 cm 6 e 7 cm 2e4

5 cada
18/03/2015 11 cm 5,5 cm 17 4; 3 sem 2 a 3,5 cm 6 cm 2 cada

raiz
25/03/2015 11 cm 5,5 cm 17 3 e 3,5 cm 7 cm 2e4

cada
30/05/2015 11 cm 5,5 cm 17 5 2,9 cm 7 cm 2a4

cada
08/04/2015 11 cm 5,5 cm 17 5 8 cm 2e5

cada
15/04/2015 11 cm 5,5 cm 17 5 1,5 a 3,5 cm 7,5 cm 1 com 4

Restant
es 2
22/04/2015 11 cm 5,5 cm 17 3 no 7,5 cm 3 cada
desenvolvidos
09/02/2015 11,5 cm 6,5 cm No

brotou
02/03/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 2 cm 3,5 cm 2 cada
09/03/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 2 cm 2,5 cm 4 cada

6 18/03/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 2,5 cm 4 cada
25/03/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 3 cm 4 cm 6 cada
30/05/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 4 cm 5 cm 4 cada
08/04/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 4 cm 5 cm 6 cada
15/04/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 4 cm 6 cm 6 cada
22/04/2015 11,5 cm 6,5 cm 18 1 4,5 cm 6 cm 6 cada
Kalanchoe pinnata
Comprimento Largura Fololos Brotos Altura Raiz Folhas
09/02/2015 10,5 cm 5,4 cm No

brotou
02/03/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 6 1,5 a 2 cm 7 cm em 4a6
mdia cada
09/03/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 6 2 e 2,5 cm 11 cm 4e6

cada
7
18/03/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 6 13,5 e 4 8 cm
com 2,5 cm
25/03/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 2,5 e 3,5 cm 11 cm 2e4
cada
30/05/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 7 2,5 a 4,5 cm 6a9 2,3 e 5

cm cada
08/04/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 2,8 a 4 cm At 11

cm
15/04/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 6 2,5 a 4,8 cm 5a7 2 e 4 cada

cm
22/04/2015 10,5 cm 5,4 cm 19 6 3,3/5 cm 7 cm 2e4

cada
APNDICE 2
Enasaios de produo de biossurfctante em erlenmeyers
Grupo B Tenso
Superficial(mN/m) DO
B.S COM BH 1 43,7 41,6 0,143
B.S COM BH 2 65,5 46,5 0,07
B.S COM BH 3 49,1 47,4 0,149
B.S COM BH 4
(NEG) 46,6 36,8 0,08
B.S COM BH
0,1% 44,5 44,5 0,08
Grupo A Tenso
DO Superficial(mN/m)
B.S com BH 1% 2,139 52,7
B.S com BH
0,5% 1,353 60,2
B.S com BH
0,1% 0,333 61,7
B.S com SB 1% 2,139 54,4
B.S com SB
0,5% 1,329 51,9
B.S com BS 0,149 66
TENSO
Grupo A SUPERFICIAL
DO mN/m
B.Sub com BH 1% 0,765 50,2
B. Sub com BH 0,5% 1,17 51,3
B.Sub com BH 0,3 % 0,946 64,9
B.Sub com BH 0,1% 0,532 60,2
B.Sub com A.Rej s lev 0,026
66
B. Sub com A.REJ 0,5% 1,413 66,6
B.Sub com A.REJ 0,3% 0,838 63,4
B.Sub com A.REJ 0,1 % 0,587 67
B.Sub com A.MAR 0,5% 1,423 54,5
B.Sub com A.MAR 0,3% 1,193 66,9
B.Sub com A.MAR 0,1% 0,681 60,5
B.Sub com A.MAR 1 % 1,177 54,2
GRUPO B
TENSO SUPERFICIAL
DO mN /m
B.S com BH 1% 0,729 0,719 0,727 50,3 50,4 51
B.S com BH
0,5% 1,085 1,032 1,055 60,2 60,1 61
B.S com BH
0,3% 0,847 0,818 0,832 67,6 67,7 67,9
B.S com BH 0,1
% 0,621 0,618 0,627 57 57 57,1
B.S com BH
NEG 0 0 0 66 66 66,1
B.S com A.REJ
S LEV 0,014 0,021 0,024 55,1 55 55,1
B.S com A.REJ
0,5% 1,299 1,279 1,279 65,6 65,7 65,6
B.S com A.REJ
0,3% 0,804 0,837 0,786 67,2 67,1 67,2
B.S com A.REJ
0,1% 0,915 0,933 0,923 56,6 56,6 56,7
B.S com
A.MAR 1% 0,692 0,677 0,675 51,2 51 51,1
B.S com
A.MAR 0,5% 1,299 1,279 1,279 57 57,1 57
B.S com
A.MAR 0,3% 1,107 1,103 1,112 59 59 59,1
B.S com
A.MAR 0,1% 0,69 0,69 0,689 56,6 56,7 56,6
B.S com
A.MAR NEG 0 0 0 60 60,1 60,2
Grupo C
Tenso
Superfcial
DO mN/m
B.SUB BH
0,1% 0,055 0,061 64,8
B.SUB BH
0,1% 0,07 0,068 64,7
B.SUB BH
0,3% 0,092 0,108 54,3
B.SUB BH
0,3% 0,114 0,108 53,1
Ensaio 24 horas:
Erlenmeyers Bacillus Subtilis I
Tens. Superficial
DO mN/M
B.Subtilis
Benzeno 6% 0,159 0,16 44,41 44,9
B.Subtilis
Benzeno 3 % 0,248 0,148 31,4 46,3
B.Subtilis meio
sem tox 0,257 0,256 54,7 54,7
B. Subtilis
Benzeno 01% 0,05 0,039 51,7 50,5
controle - meio
sem tox 0,146 0,147 60 60
Erlenmeyers Bacillus Subtilis II
Tenso
Superficial
DO mN/m
B. Subtilis 9 %
Benzeno 0,27 0,2 0,266 37,9 37,8 37,8
B. Subtilis 0,05 %
Benzeno 1,789 1,789 1,768 55,1 55,1 55,1
B. Subtilis 0,01 %
Benzeno 1,748 1,748 1,728 50,9 51,5 51,5
Com 1% de Benzeno
Placa + membrana Placa + membrana

(g) com massa seca (g)
6,335 6,342
6,315 6,309
Ensaio 48 horas:
Com 1% de Benzeno

6,335 6,342
6,315 6,317
Com 2% de Benzeno

6,334 6,335
6,310 6,311
Com 3% de Benzeno

6,330 6,333
6,311 6,313
GRUPO A
Erlenmeyers
70
60
50
40
30 Tenso Supercial
20
10 Tenso Supercial
0
B.S B.S B.S B.S B.S DO
COM COM COM COM COM
BH 1 BH 2 BH 3 BH 4 BH
(NEG) 0,1%
80
60
40
20 DO
0
B.S B.S B.S B.S B.S B.S Tenso Supercial
com com com com com com
BH BH BH SB SB BS
1% 0,5% 0,1% 1% 0,5%
Grupo B II
Erlenmeyers
80
60
40
20 DO
0
TENSO SUPERFICIAL
70
60 DO
50
40
30 DO
20
10 Tenso Superfcial
0 mN/m
B.SUB B.SUB B.SUB B.SUB
BH 0,1% BH 0,1% BH 0,3% BH 0,3%
2016 IJSRST | Volume 2 | Issue 4 | Print ISSN: 2395-6011 | Online ISSN: 2395-602X
Themed Section: Science and Technology
Micropropagation Photoautotrophic Kalanchoe pinnata

in Water and Humus with use of Natural Light, and
Determination of Total Flavonoids: A Review
Neves C. R. S. S.*, Procpio M. C, Penna T. C. V.
Department of Biochemical Pharmaceutical Technology, College of Pharmaceutical Sciences, University of So
Paulo, So Paulo, SP, Brazil
ABSTRACT
Micropropagation is a vegetative propagation method widely studied in many different plant species,
beinga mode in tissue culture, the one that has found widespread and proven practical applications. Among
the advantages of its use is the possibility of obtaining various plants from an initial explant, regardless of
the season, besides the reduction of time and area required for the species propagation. The development
of photoautotrophic micropropagation systems with natural light usage, emerge as potential possibilities to
increase the micropropagation efficiency and help reduce costs, making it commercially viable for active
principles and phytotherapeutics production. Thus, the flavonoid content contained in Kalanchoe pinnata
plant extract, can base the pharmacological activity of it when used by population, for the cure and
prevention of various types of chronic noncommunicable diseases (NCDs).
Keywords: Kalanchoe Pinnata, Micropropagation, Photoautotrophic, Flavonoids, Cost Reduction
I. INTRODUCTION The development of photoautotrophic micropro-

pagation systems (production of micropropagules
Photoautotrophic Micropropagation without addition of sucrose in the culture medium and
under ambient conditions favoring photo-synthesis)
Micropropagation is a vegetative propagation me-thod [47], with natural light usage, emerge as potential
widely studied in many different plant species, being possibilities to increase micropropagation efficiency
the mode in tissue culture, the more widespread and and help reduce costs, making it commercially viable.
has found proved practical applications [50]. Among
the advantages of its use is the possibility of obtaining Studies have shown that light can determine the
various plants from an initial explant, regardless of growth direction of plants (phototropism). It is able to
the season, besides the reduction of time and area determine chloroplasts [21, 22] and plant organs
required for the species propagation. Moreover, due to (photomorphogenesis) [21] differentiation, espe-cially
best sanitary conditions by cultivation of meristems the leaf, the most susceptible organ to environ-mental
previously treated by thermotherapy to eliminate changes [23, 24], and in other substances production,
diseases, there is the reproduction of the mother-plant such as flavonoids [21]. This fact raises the possibility
genotype usually with fidelity during multiplication, of studying various light sources effects at different
which allows the propagation of species difficult to wavelengths, focusing on plants in order to verify and
propagate by other methods. modulate the amount of synthe-sized substances.
IJSRST162382 | Received : 15 June 2016 | Accepted : 05 July 2016 | July-August 2016 [(2)4: 01-13]
1
The light also strongly influences hormones from 290 nm (ultraviolet) to 4000 nm (infrared) [21].
biosynthesis. Vegetal hormones are molecules Many of these wavelengths are absorbed by ozone in
responsible for the seedlings development, present in the atmosphere, by the atmospheric oxygen and CO2.
low concentrations [26]. These substances act in all On average, 45% of the radiation coming from the
morphogenetic processes, including those induced by sun are in the range from 380 nm to 710 nm [21]. It is
light. Studies have shown that gibberellin levels in in this spectral range that is the visible light,
events like disestiolation, germination and composed of seven spectral ranges, the seven rainbow
tuberization are directly linked to light, regulated by colors.
phytochrome or cryptochromes. The indole acetic
acid (IAA) and cytokinins levels in disestiolation are In this range, there are also the wavelengths used by
also regulated by phytochrome. The light is able to plants for photosynthesis (photosynthetically active
regulate abscisic acid (ABA), ethylene and radiation, FRG) [21]. However, light is not only
brassinosteroids levels in a phytochromes and utilized by the plant as a source of energy, it also
cryptochromes dependent process [32]. The controls the plant growth and development through
interaction between light, photoreceptors and plant signals. Plants are able to monitor the intensity,
hormones has a strong influence on plant life, even quality, direction and duration of light. As already
regulating tissues and organs development, that is, mentioned, the solar radiation is decisive in many
morphogenesis. physiological processes such as stem elongation,
germination, stomatal conductance, chlorophyll
Studies have shown that the relationship between synthesis.
light and flavonoid biosynthesis is also closely linked.
Flavonoids provide coloring for plants ranging from Due to its characteristics of sessile beings and their
lilacto blue. The ability of these molecules to absorb autotrophic nature, dependent on light energy, plants
wavelength in UV range gives to these substances a have developed environmental recognition
protection function against damage caused by this mechanisms realizing the variations in the quantity
type of radiation [36, 37] and microorganisms or and quality of light they receive, according to the
fungi [36]. vegetation cover in a particular location which can be
closed or opened, light is gradually assimilated by
Other authors have shown that different spectral layers of superimposed sheets.
ranges differently influence the development of plant
organs, leading to changes in several anatomical Thus, the canopy energy is greater than the lower
characteristics such as leaf thickness, leaf area, stem layers, meaning that the light reaching the soil is
diameter, stomata and trichomes density [53, 54, 55]. richer in wavelengths than that reaching the canopy,
Besides morphological and anatomical features, light that is, it tends to contain more light in the red range.
may influence secondary metabolites production such In addition, a few feet below the topsoil, only reaches
as flavonoids. The flavonoid biosynthesis occurs by lengths corresponding to the extreme red [21]. This
secondary and mixed pathways (shikimate and acetate effect is called radiation attenuation [21]. Different
pathways), being regulated by blue and UV light in a species require different amounts of light to its perfect
process mediated by cryptochromes. In this process development. Hence it is so important that plants
occurs the expression of the enzyme phenylalanine recognize the different quantities and qualities of light
ammonia lyase, essential for the first step of where they are located.
fenilpropanodica and chalcone synthase pathways,
the first flavonoid biosynthesis pathway [38]. Due to In this manner, plants can regulate their development
these molecules protective action against in order to seek light. This recognition process is
microorganisms in plants, it makes them a target to through special molecules called photoreceptors, able
pharmacological studies using plants. to recognize different wavelengths. The processes
regulated by light are categorically divided into two
The perception of color and the amount of substances main classes: phytochrome mediated, red light
that plants produce, as a rule, are related to spectral receptors and cryptochromes mediated, blue light /
quality of light they receive. The solar radiation that UV-A receptors [26]. The phytochrome are the most
reaches the Earth covers a spectral range extending characterized photoreceptors and form a family of
International Journal of Scientific Research in Science and Technology (www.ijsrst.com)
2
five proteins (phytochrome A, B, C, D and E) of [33]. The leaf is the organ that most responds to
approximately 125 kDa [27]. environmental radiation, being therefore chosen by
many authors as object of study of spectral quality
Each phytochrome has two forms, in particular and quality effect in plants [34, 33, 24, 22, 35].
spectrally reversible: one that absorbs red light (Pr - Different plant species are adapted to different
biologically inactive) and one that absorbs extreme lighting conditions, with an amount of light to be
red wavelength (Per - biologically active). Pr, when optimum to perform photosynthesis. Plants usually
absorbs light in the 620-680 nm range is converted to have morphoanatomic features related to these
the Per, this by absorbing radiation in the 700-800 nm different light environments. Such characteristics
range becomes Pr. The balance between the two provide the best use of the incident light and
forms, given by red and extreme red proportion in the protection of photosynthetic apparatus [21]. During
environment light, will cause physiological responses its life, plants can be exposed to different lighting
in the plant [28, 21, 27]. conditions, so it is possible to notice that most plants
The greater the amount of far red, the plant is more have developed adaptation mechanisms, mainly
shaded. The amount of red and far red that the plant anatomical, of the individual to the new climatic
receives also indicates the seasons (long or short conditions [22]. This flexibility occurs even at a
days). cellular level, as in the case of different organizations
and developmental changes in mesophyll chloroplasts
This information determines the plants aspects such [21, 22].
as germination, flowering, maintenance or not
plumular hook, chlorophyll synthesis and circadian Some advantages of photoautotrophic micropro-
rhythm. Although in most cases, responses regulated pagation at the expense of natural light compared to
by phytochrome are linked to red light, some studies the conventional method of micropropagation include
show dependent responses of blue and UV-A light plant growth increase. Due to the removal of sucrose
[29,30]. from the culture medium, there are improvements in
the physiological characteristics of the plant, once the
The cryptochromes are a family of blue / UV-A light cultivation environmental conditions are more natural,
photoreceptors extremely important during reducing plant stress during acclimatization,
disestiolation of plants grown in the dark [31]. They increasing the percentage of survival of seedlings [48,
are involved in the inhibition of stem growth 49, 50], elimination of lighting costs and reduced
processes, cotyledon expansion and chlorophyll costs for repairs and maintenance, and also possibility
synthesis. There have been shown that cryptochromes of use of simplified facilities reducing construction
act in coordination with phytochromes in several costs [51].
processes and its action is temperature dependent
[31]. However, phytochrome and cryptochromes, In conventional micropropagation, the heterotrophic
along with other photoreceptors, are not the only or fotomixotrfica nature of plant growth is directly
substances that act in photomorphogenic events. or indirectly responsible for most of the factors
Other substances act on plant tissue, translating in related to the cost of production of micropropagated
them environmental light conditions. These plants [50]. Explants are cultured in flasks without
substances are plant hormones. gas exchange and with high relative humidity (about
98%), high ethylene concentration, low CO2
It is possible to observe that among the environ- concentration (which decreases from 3.000 to 1 mol
mental factors that most influence the plant 9.000mol the dark period to less of 100mol mol-1
development is the lighting. Studies have indicated during the photoperiod), and low photon flux density
that in addition to the amount of light received, the of photosynthetically active. That means that low
spectral quality of it is also important as it can induce lightning (40 - 50mol m-2 s-1) and with sucrose as a
morphoanatomic answers, for example, it can cause major source of metabolic energy [52], once the
different red and extreme red ratios altering the explants show low photosynthetic rate [50]. The
structure of the mesophyll [24] or the stomata density nutrient medium used is composed of essential and
optional components. The standard medium used
universally for micropropagation of medicinal
3
plants is MS medium (Murashige and Skoog) [56], have significant anti-inflammatory action, that can
which has as essential nutrients: inorganic salts, be attributed to inhibition of the enzymes
carbohydrates, vitamins and growth regulators. phospholipase A2 (PLA2), 8 lipo-oxygenates to,
cyclooxygenase and inhibition of nitric oxide
Many explants or in-vitro plants have the ability to production, through modulation of enzyme iNOS
grow photoautotrophicly, i.e. without sucrose in the [35, 37, 59].
culture medium and under environmental
conditions, which promote photosynthesis [50]. The Table 1- Taxonomy of Kalanchoe pinnata
photosynthetic process, contrary to what occurs in (Lamarck) Persoon:
the respiratory chain, need an external source of
energy, without which it does not occur, showing Kingdom Plantae (Plantas)
that there is a strong relationship between light and sub Kingdom Tracheobionta (vascular
plant)
plants, photosynthetic organisms. Since, during
Super division Magnolioliophyta
photosynthesis, light is not only a regulation factor, (Flowering plant)
it acts as an important component in the Class Rosidae
biochemical reaction [21], being able to interfere in Order Saxifragales
several physiological factors, such as chlorophyll Family Crassulaceae Stonecrop
family [39]
production, stem stretching regulation, in enzymes Genre Kalanchoe
production and other substances such as Species Kalanchoe pinnata
anthocyanins, a type of flavonoid [21]. In this sense, (Lam.) Per [14]
it is understood that the light is a determining factor Verea pinnata, Crassuvia
floripendia, C. calyculata,
for plants to be able to, from inorganic molecules, Cotyledon calycina,
synthesize carbohydrates. Bryophyllum calycinum,
Synonyms Crassula pinnata, Sedum
Kalanchoe pinnata Description madagascariense, B.
germinans, C. rhizophilla.
[13]
The Brazilian flora is extremely rich, because in it Source Uncertain. It is believed
to be the Mauritius
there are thousands of species of medicinal plants, Islands, Africa, India and
and among these plants there is Kalanchoe pinnata, Indian Ocean islands
which despite being widely used by the population, Distribution It is distributed through-
still has few studies proving its medicinal hout India and grown in
wild gardens in the hills
properties. It is a perennial plant, therefore easily of northern and western
found in several climates and regions of the world, India, Deccan and Bengal
and easy handling due to their morphological [18]. In Brazil, they can
characteristics (Table 2). be found from Sao Paulo
to Bahia, mainly in the
coastal zone.
The different species of the genus Saio, Folha-da-fortuna,
Kalanchoe (Crassulaceae family) are known in Brazil Coirama, Roda-da-
popular medicine in many countries as it can be fortuna, Folha-da-costa,
Folha-grossa, Erva-da-
observed in Table 1. As used in treatment of costa
inflammatory processes and in several diseases. Regional India Zakhm-hayat
This fact favors the search for new bioactive Names Arabia kushnulhayat
molecules. Among the main active principles of Walking Koppata
Kalanchoe pinnata, there are the polyphenols [59], stick
Sanskrit Asthi-bhaksha
which are flavonoids, antioxidants, mucilage and
telugu Simajamudu
others (Table 3). Among the present flavonoids,
Tamil Ranakalli
there is quercetina43, which has shown significant kannada Ganduklinga
action in the leishmaniasis treatment [41]. malayalam Elamurunga
Persian and Chubehayat [17, 19]
Quercetin and kaempferol are flavonoids Urdu
widely spread throughout the plant kingdom and
4
Table 2 : Morphological characteristics of Kalanchoe pinnata:
Dimension Sublenhosa plants, perennial fleshy, 1.5 meters high; succulent stems, hermaphrodite, tubular, penduladas, pale
green or yellow reddish.
Seeds Oblong small soft - ellipsoid, striatum bad, soft. The leaves often produce, at the ends of the lateral nerves, buttons
furnished with roots, stems and leaves, which drop off at the same time become new plants [13].
Sheets Juicy, Dimensions: length 7-20cm 4-9cm wide on average, 10 to 25 leaves, or occasionally when lower generally
have 8-12 and 6-8 in size, the upper usually 3-5 or sometimes 7 - leaflets, long and pointed, the united petioles by a
ridge around the stem. Leaflets ovate or elliptical, serrated [17].
With 10-14 mm long, produce numerous seeds per fruit in closed chalice and corolla. [13]
Fruits
Trunk succulent stems, hollow, rarely branched. [13]
One of the main features of Kalanchoe pinnata is its According to Fukuoka [59], the natural fertilization
ease in micropropagation in aquatic environments is defined by natural conditions, soil regeneration
and on land, having high adaptability to different with the soil itself, returning to the soil what it
climates and easy handling conditions (Table 3). hasgiven, such as fruits, vegetables and grains. The
Due to these factors, it was decided to replace the soil is enriched progressively mind, and the content
synthetic medium MS [56] for water and earth of natural mind-nutrients present is balanced with
through composted with natural bio-fertilizer and the help of natural fertilizer from the own culture
humus, and bio-organic materials used in developed in this soil. In Table 3 below the optimal
biofertilizers, provided from waste solids reuse fruit. growth conditions for the Kalanchoe pinnata.
Table 3. Characteristics of a better climate adaptation and management:
Life Cycle Perennial

Climate Enjoy warm weather
luminosity Enjoy light full sun and half-shade
pruning Not necessary, but cut dry parts can be carried out, and to contain the spread, remove new
growth if you want
Cultivation It must be used substrate that has good drainage, which does not accumulate water which will
cause the death of the plant. Mixing Tip: two pieces of coarse sand construction, a part of
common garden and land part of the plant. It supports soil with low humidity, and also
develops in water
Fertilization At the site preparation, apply about two NPK tablespoons of 04-14-08 formula per square
meter
Propagation Vegetative from seedlings, and shoot buds formed along the sheet margins, producing young
plants [40]
Medicinal plant Her daughter medicinal properties have been used in the treatment of various diseases.
Chemical constituents Mucilage, tannins, organic acids, minerals, quercetin glycosides [41, 43]. bufadienoldeos
[44, 45].
Toxic plant Special care should be taken with small children, pets and master-mind with grazing animals
Use Quite showy ornamental effect, is very well in rock gardens forming together with other
succulents
The objective of the research was to investigate the Extracts of developed sheets were evaluated by
development of the crop in water and soil with humus spectrophotometry, as the concentration of flavonoids,
(natural biofertilizers) of Kalanchoe pinnata leaves, which is, the minimum necessary to justify the
(Lam Pers), kept under natural light (photoperiod).
5
medical activities of the extracts of Kalanchoe pinnata leaves described in Table 4.
Table 4: Medicinal Uses Worldwide:
Furunculous [20], Intestinal problems, arthritis, ulcers, athlete's foot, abscesses, bubos,
Brazil bronchitis, burns, calluses, conjunctivitis, corns, dermatosis, coughs, earaches, eczema, fever,
urinary insufficiency, rheumatism, itch, glaucoma, infections, headache, kidney stones, scurvy,
tumor, wart, sedative, whooping cough, wounds, inset stings, lymphatic disorders, mouth sores,
respiratory infections, mouth sores, erysipelas [10]. Immunosuppressant, leishmaniasis [41,
43], diabetes [41, 42, 43] hemostatic, antiseptic, healing topical, inflammation (stomach pain)
[15, 16]
USA Chicken pox, stomachache, fevers [10]
Mexico Inflammations, wounds, eye infections, headaches, menstrual disorders [10]
Ecuador Bruises, broken bones [10]
Guatemala Diarrhea, pain, skin problems, aches [10]
Nicaragua aches, burns, colds, pain, fever, headache, respiratory infections, coughs, childbirth [10]
Bangladesh Coughs, fever, constipations, mucus, epilepsy [11]
Bacterial infections, boils, broken bones, ulcers, urethritis, sore, skin problems, nausea,
Peru migraine, intestinal problems, eye infections, epilepsy, gas, headache, heartburn, inflammation,
cancer (lymphoma), bronchitis, conjunctivitis, coughs, earaches [10]
South America Asthma, tumors, headaches, colds, earaches, chest colds, sores, strains [10]
Nigeria Coughs, earaches, pimples, inflammation, eczema10, cut umbilical cord in new born baby [7]
West Indies Ulcers, menstrual disorders, urinary disorder, hypertension [10]
Other places Arthritis, asthma, burns, bruises, constipation, malnutrition, headaches, migraines, nephritis,
respiratory infections, earaches, diabetes, paralysis, rheumatism, swelling [10], and to induce
vomiting of blood, expel worms, cut umbilical cord in new born baby [7]
Vietnam Anti-inflammatory and antibacterial [8]
Orissa Diarrhea [5, 2]
India
Karnataka Leaf juice externally, applied to scabies and leucoderma and leaf decoction applied over, cuts to
stop bleending [10, 12]
Maharashtra The leaves in used against cough dysentery [4]
in Himalaya Leaves are applied on wound, bruises, insect bite, swelling [9]
Arunachal Leaf extract is taken in empty stomach is used in the treatment urinary bladder stones and fewer
Pradesh in childrens [3]
II. METHODS AND MATERIAL the fermentation, the fruit biomass was placed in glass
containers covered with fabric. Subsequent to
A. Humus preparation fermentation, biomass was added to the earth for the
humus formation, through composting method.
The papaya, banana, orange, mandarin and mango Fermented biomass was evaluated to their chemical
residue were gathered and milled with the aid of an composition of trace elements as well as dosage of total
organic waste processor in order to form a biomass of ash, moisture, protein, carbohydrates, glucose, fructose,
fruits. They were then added to water ratio gradient in fiber and lipids.
order to obtain the best uniformity for the process of B. Determination of the chemical composition of
fermentation the kefir grains, for cleaving complex biomass fruit
sugars and free reducing sugars, providing among these The chemical composition of biomass (consisting of
microelements to facilitating uptake by plants. During papaya, orange, mango, banana and tangerine waste)
International Journal of Scientific Research in Science and Technology (www.ijsrst.com) 6

was determined according to the methodology of the with soil). Then, the micropropagation development
AOAC [57]: moisture (925.45); protein (960.52); lipids monitoring was made, measuring the dimensions of the
(920.39) and ash (923.03). The conversion factor used roots and formation, and the growth of buds in relation
for determining the protein content was 6.25. The energy to the cultivation time.
value was calculated using the general factors of
Atwater and considering the energy from dietary fiber
(DF) [58]. The analyzes were performed in triplicate and
the results expressed in g per 100 g of sample in the
integral base. The DF content was determined according
to AOAC method 991.43 [57]. The analysis was done in
quadruplicate and the results expressed as g / 100g
sample basis. Dosages of glucose and fructose were
made in triplicate by Waters chromatograph column for
detection of sugars (Shodex SC 1011); refractive index
detector; Mobile phase: EDTA-Ca 0,187g / l.
Chromatography conditions: column temperature: 72
C; detector temperature: 45C, mobile phase flow: 0.6 ml
Figure 1. Illustrative Photo Kalanchoe pinnata. Source:
/ min. Detector sensitivity 32, Volume injection: 10L,
running time: 30 minutes. Author's photo
C. Photoautotrophic Micropropagation D. Preparation of the Kalanchoe pinnata leaves

extract
The leaves of Kalanchoe pinnata, initially developed in
soil, were transferred to individual containers in which
were placed submerged in water. The jars were kept at There were extractions of leaves developed to evaluate
room temperature, covered by a synthetic porous fabric the concentrations of flavonoids. The alcoholic extract
(TNT), provided direct daylight (photoperiod). Initially, of 100 g of cereal leaf was macerated in ethanol, and
the dimensions and leaflets of each sheet were transferred quantitatively into 100 mL volumetric flask,
measured. After a period of seven to ten days of and the final volume with grain alcohol.
permanence in the same water, the size of sprouts from
the leaflets and their roots were measured as shown in E. Determination of total flavonoid, catechin
equivalents
Fig. 1, and the water was changed. Each bud, with its
leaves and roots were transferred to the humus (prepared
from biomass fruit fermented with kefir and composted
It was transferred 0.5 ml of K. pinnata extract solution catechin (purity = 98%) in the concentration of 500,0g
into a 25 mL volumetric flask and was added 0.100 mL / ml in cereal alcohol. From the stock solution dilutions
of 10% aluminium chloride with 4.3 ml of grain alcohol. were prepared at concentrations of 0.084; 0.05; 0.028;
We adopted the same experimental procedure dilutions, 0.017; 0.0076 g / L, which was reacted with 0.100 mL of
described below, for the preparation of the absorbance 10% aluminum chloride solution (v / v), completing the
of the response curve as a function of the concentration volume with ethanolic grain alcohol. After 40 minutes of
(mg / ml) ranging from 60 to 260 (mg / mL) of total rest, we proceeded to read in a spectrophotometer at 510
flavonoids equivalent of catechin using the equation of nm using as white cereal alcohol solvent plus aluminum
the line from the calibration curve of the standard chloride solution. Elaborated the analytical curve,
secondary reference catechin being evaluated linearity. checking the linearity of the method, using visual
observation and appropriate statistical analysis,
Linearity obtaining - the equation of the line and the linear
correlation coefficient. Equation 1 is the equation of the
To check the linearity, it was elaborated analytical curve calibration curve of the standard secondary reference
with the stock solution of standard secondary reference
7
catechin, where y is absorbance and x is the C. Statistics of K. pinnata.micropropagation
concentration of standard secondary reference catechin:
y = 10.121 x 0, 0475 (1)

r2 = 0, 9936
From the obtaining of a line to the calibration curve and

the correlation coefficient (r2) .9936 was verified the
linearity of the method.
III. RESULT AND DISCUSSION
A. Quantification of equivalent total flavonoids

catechin in Kalanchoe pinnata extract.
In Table 5 it can be seen the results of

quantification of total flavonoids, catechin Figure 2. K. pinnata with 11.5cm long and 6.5cm
equivalents in Kalanchoe pinnata extract, with an wide; ANOVA: p < 0.05 ***
average of 42.39 mg / mL.
Table 5 spectrophotometric dosage of the equivalent

total flavonoids catechin present in Kalanchoe pinnata
extract to 510nm. EKP: Kalanchoe pinnata extract .: CF:
concentration of total flavonoid, catechin equivalents.
Concentration
of EKp (g/mL) Absorbance CF g/mL)
60,0 0,2230 17,34
100,0 0,3320 28,00
140,0 0,4219 36,00
180,0 0,5543 50,00
220,0 0,6030 54,00
Figure 3. K. pinnata with 15.7 cm long and 10
260,0 0,7456 69,00
cm wide; ANOVA: p <0.05 ***
Average: 42,39
B. Kalanchoe pinnata Micropropagation
Water-soaked sheets produced roots from all the leaflets,

and buds (buds) with leaves in most leaflets, from 7 to
10 days. In a similar period, the sheet cultivated on earth
developed, on average, two shoots 10 days and 40 days
from the main stem height reached an average of 8 cm
from each bud, 8 new sheets for each sprout dimensions
Similar to that of the mother sheet. In water, the leaves
are multiple and diminutive dimensions, three times
smaller, and remains in this size and had to be
transferred to new culture in water or on land.
Figure 5. K. pinnata with 14cm long and 9
8
Figure 6. K. pinnata with 11 cm long and 5.5
Figure 7. K. pinnata with 18cm in length and 12.5 in
width;
ANOVA: p <0.05 ***
Figure 4. K. pinnata in length and 13cm 9.7 cm wide;

ANOVA: p <0.05 ***
Figure 8. K. pinnata with 10,5cm long

and 5,4wide; ANOVA: P < 0, 05 ***
9
IV. CONCLUSION
The micropropagation of Kalanchoe pinnata proved

to be auspicious, since it presented a high capacity for
reproduction by fotoautotrophic micropropagation in
water with the use of natural light, and soil humus
with derived bio-organic fertilizer. Observe a
satisfactory value the concentration of micronutrients
present in the biomass of fruits needed for plant
nutrition, this fact makes possible the replacement of
synthetic media, which implies lower costs allowing
obtaining of one rich source of active ingredients for
herbal, water extracts (poultices) or cereal alcohol
(tinctures).
The photoautotrophic plant micropropagation, in

Figure 9. K. pinnata (all sheets with varying addition to increasing the growth of in vitro explants,
sizes) ANOVA: P <0.05 *** also minimizes the risk of microbial contamination,
reduces production costs, improves the physiological
characteristics of the plant and facilitates their
A. Determination of the chemical composition of acclimatization to ex vitro conditions due to have
been grown in conditions natural.
biomass fruit
Table 6 - Proximate analysis of biomass of fruits V. ACKNOWLEDGEMENTS

Biomass fruit (I) (II) (III) (IV) Average
(g/100 g) Agency CAPES, Prof. Dr. Marco Antnio Sthephano
Carbohydrates 4 4,9 4,8 -- 4,56 (FBT-FCF-USP), Prof.. Dra. Marina Ishii (FBT-
Lipids 0,02 0,03 0,02 -- 0,023 FCF-USP), Dr Aline de Oliveira Santos (FBA-FCF-
Proteins 0,4 0,5 0,8 -- 0,56 USP), Dr Caroline Matos de Mello (IPT- USP)
Ash 2 1,98 2 -- 1,99
Humidity (%) 89 89 89 -- 89
Fibers 5 4,8 4,9 4,9 4,9
Glucose (g/L) 7,756 7,54 7,15 -- 7,483
Fructose (g/L) 9,107 8,80 8,31 -- 8.756
10
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13

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

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Dissertao para obteno do grau de

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