ATLAS de HISTOLOGA VEGETAL y ANIMAL

Tcnicas histolgicas

TINCIN

Manuel Megas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Biologa Funcional y Ciencias de la Salud.
Facultad de Biologa. Universidad de Vigo.
(Versin: Enero 2016)
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que el resultado tenga la misma licencia y que se nombre a los autores).
NDICE

Introduccin ................................. 4
El proceso histolgico .................... 5
Tincin .......................................... 7
Ttinciones generale ....................... 8
Histoqumica .................................. 12
Lectinas ......................................... 15
Inmunocitoqumica ........................ 17
Hibridacin in siut ......................... 22

Introduccin
En estas pginas dedicadas a las tcnicas
histolgicas vamos a describir los procesos
experimentales necesarios para obtener secciones
teidas y listas para observar al microscopio
partiendo de tejidos vivos extrados de un animal
o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios
a la obtencin, fijacin, inclusin, corte y tincin
de los tejidos. Todos estos apartados seguirn el
mismo esquema que los captulos dedicados a los
tejidos o a la clula, partir de un esquema bsico
y ampliar la informacin sucesivamente en
pginas adicionales. No dedicaremos demasiado
espacio a los instrumentos, desde el punto de
vista operativo, pero s a la conveniencia de su
uso y a sus capacidades.
La mayora de las tcnicas histolgicas van
encaminadas a preparar el tejido para su
observacin con el microscopio, bien sea ste
ptico o electrnico. Ello es debido a que la
estructura de los tejidos est basada en la
organizacin de los tipos de clulas que los
componen y, salvo contadas ocasiones, las
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Tcnicas histolgicas. Introduccin. 4
caractersticas morfolgicas de las clulas slo se
pueden observar con estos aparatos.
Existen procedimientos rpidos y simples para
la observacin de tejidos y clulas vivas que
reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la
observacin del flujo sanguneo en capilares del
sistema circulatorio. Otra forma de observar
clulas o tejidos vivos es mediante las tcnicas
histolgicas supravitales, en los que las clulas y
los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera
del organismo, como es el caso de los cultivos de
clulas y de tejidos.
Las tcnicas histolgicas postvitales son
aquellas en las que las clulas mueren durante el
proceso, pero las caractersticas morfolgicas y
moleculares que posean en estado vivo se
conservan mejor o peor dependiendo del tipo de
tcnica. Estas pginas estarn dedicadas a este
tipo de tcnicas, puesto que son las ms
comnmente usadas en los laboratorios de
histologa.

El proceso histolgico
Denominamos proceso histolgico a una serie
de mtodos y tcnicas utilizados para poder
estudiar las caractersticas morfolgicas y
moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos
para estudiar los tejidos, es decir, series de
tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu
caracterstica deseemos observar. En el siguiente
esquema se muestran los mtodos y tcnicas
comnmente empleados para el procesamiento
de los tejidos para su observacin con los
microscopios ptico o electrnico. Sin embargo,
hay que tener en cuenta que existen muchas
variantes a estos "caminos" y su eleccin
depender del resultado final que queramos
obtener.
Esquema del proceso histolgico.
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Tcnicas histolgicas. Introduccin. 5
El proceso histolgico comienza con la
obtencin del tejido objeto de estudio. En el caso
de los tejidos vegetales directamente se toman
muestras de los distintos rganos que componen
el cuerpo de la planta, mientras que para los
tejidos animales podemos optar por dos opciones:
coger una porcin del tejido u rgano y
procesarla o procesar primero el animal completo
y luego extraer la muestra que nos interese. En
cualquier caso las muestras son habitualmente
fijadas con unos soluciones lquidas denominadas
fijadores, las cuales se usan para mantener las
estructuras celulares y moleculares inalterables
durante el procesamiento posterior y con una
organizacin lo ms parecida posible a como se

encontraban en la muestra viva. Tambin
podemos fijar las molculas de los tejidos por
congelacin rpida. Fijar un tejido es como hacer
una fotografa de dicho tejido, su estructura se
mantendr hasta su observacin. La fijacin por
congelacin se emplea cuando la fijacin qumica
o los procesos histolgicos posteriores alteran las
caractersticas de la muestra que queremos
estudiar, por ejemplo una molcula sensible a
dichos tratamientos.
Normalmente, tras la fijacin se procede a
incluir el tejido para posteriormente obtener
secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea
nuestra seccin ms tenemos que endurecer
nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el
tejido con sustancias lquidas que posteriormente
polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes
(ceras). Tambin se puede conseguir el mismo
efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms
gruesos de 40 Cm se pueden cortar sin necesidad
de inclusin usando el vibratomo. Los medios de
inclusin no son normalmente hidrosolubles por
lo que tendremos que sustituir el agua de los
tejidos por solventes orgnicos liposolubles y
posteriormente sustituirlos por el medio de
inclusin.
Tras la inclusin o la congelacin se procede a
cortar los tejidos, es decir, obtener secciones.
Existen diferentes aparatos de corte que permiten
conseguir secciones ultrafinas (del orden de
nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 Cm), finas
(entre unas 3 y 10 Cm) y gruesos (mayores a 10
Cm). Habitualmente las secciones se procesan
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Tcnicas histolgicas. Introduccin. 6
para poder observarlas y estudiarlas, aunque
ciertos tipos de microscopa, por ejemplo con
contraste de fase, permiten observar secciones de
tejidos sin procesar. Normalmente las secciones
se tien con colorantes que son hidrosolubles, por
lo que hay que eliminar el medio de inclusin
para que los colorantes pueden unirse al tejido.
Las secciones ultrafinas (observadas con el
microscopio electrnico) o semifinas (observadas
con el microscopio ptico) se pueden contrastar
con metales pesados o con colorantes,
respectivamente, sin necesidad de eliminar el
medio de inclusin.
Los tejidos procesados se observan con los
microscopios. Existen dos tipos bsicos de
microscopios: ptico y electrnico. Los primeros
ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos
de observar los tejidos: campo claro,
fluorescencia, contraste de fase, polarizacin o
contraste de interferencia diferencial, mientras
que los segundos permiten un gran poder de
resolucin, pudindose observar caractersticas
ultraestructurales.
Como dijimos al comienzo existen mltiples
variaciones sobre este esquema general de
procesamiento histolgico. Por ejemplo, se
pueden observar tejidos con el microscopio
electrnico de barrido sin necesidad de incluir ni
cortar, pero slo observaremos superficies. En las
siguientes pginas veremos con cierto detalle
algunas de las tcnicas ms empleadas para la
observacin de los tejidos.

Tincin
Los tejidos animales son en su gran mayora
incoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo
de pigmento como hemoglobina de la sangre o la
melanina de la epidermis. En las plantas, sin
embargo, existe una mayor variedad de
pigmentos naturales que permiten su observacin
directa con el microscopio ptico, a lo que
tambin ayuda la presencia de las paredes
celulares, las cuales facilitan la delimitacin
celular y la discriminacin entre diferentes
tejidos. Cuando se inventaron los primeros
microscopios hubo que descubrir cmo teir los
tejidos para poder desentraar sus caractersticas
morfolgicas. Se observ que algunos pigmentos
como el carmn o la eosina, disueltos en agua, se
unan a determinados componentes de las clulas.
La expansin de la industria textil en el siglo XIX
y su necesidad de colorear las telas provoc un
rpido desarrollo de los tintes o pigmentos.
Muchas de estas sustancias fueron usadas como
colorantes en la histologa de los animales y de
las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la
actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo y
perfeccionamiento de nuevas tcnicas y
molculas sintticas que se usan segn las
necesidades del investigador. Con la llegada de la
biologa molecular se han puesto en marcha otras
tcnicas mucho ms sofisticadas para observar
elementos celulares, entre las que se pueden
destacar aquellas que usan anticuerpos,
inmunocitoqumicas, las que usan sondas de
ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o ms
sofisticadas an como las que mediante el diseo
de animales transgnicos permiten identificar y
observar a las clulas que expresan un
determinado gen, incluso en el organismos vivo,
gracias a la fluorescencia de la protena verde
fluorescente (GFP).
No vamos a describir con detalle las tcnicas
ms complejas, al menos no en estas pginas
bsicas, sino las ms comunes, las que se suelen
emplear en un laboratorio para el estudio general
de los tejidos. Dividiremos el conjunto de
tcnicas histolgicas en cuatro categoras.
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 7
a) Tinciones generales. Aquellas que usan
sustancias coloreadas que se unen a componentes
tisulares por afinidad qumica.
b) Histoqumica. Son aquellas tcnicas de
tincin que implican la modificacin qumica de
algunas molculas tisulares para posteriormente
ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
apartado incluiremos tambin a los mtodos de
tincin basados en la capacidad cataltica de
algunas enzimas presentes en los tejidos que
queremos estudiar.
c) Lectinas. Las lectinas son dominios de
protenas, como las selectinas, que son capaces
de reconocer glcidos que forman parte de
polisacridos. Tienen una gran especificidad y se
usan para determinar el tipo de glcido que
aparece en las glucoprotenas de las clulas o de
la matriz extracelular de los diferentes tejidos.
d) Inmunocitoqumica. Son tcnicas
histolgicas muy potentes basadas en la alta
especificidad de unin de los anticuerpos a los
antgenos contra los que se produjeron. Estos
antgenos pueden ser cualquier molcula tisular
que, purificada en inyectada en un animal, sea
capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos
anticuerpos aadidos a una seccin de tejido
reconocern y se unirn especficamente a dicha
molcula.
e) Hibridacin. Son tcnicas basadas en la
unin complementaria de las bases de cidos
nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo,
y de la guanina con al citosina). Esto hace que
dos cadenas complementarias de cidos nucleicos
se unan entre s de forma muy especfica, es
decir, hibriden. Siguiendo este principio se
pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de
ADN o ARN con una secuencia de bases
determinada que llevan una molcula unida para
poder detectarlas. La secuencia de bases de la
sonda es complementaria a otra que est presente
en la clula, normalmente en forma de ARNm.
Con ello podemos observar qu clulas expresan
un determinado gen.

Tinciones generales
La mayora de los tejidos, sobre todo los de los
animales, son incoloros y por ello necesitamos
teirlos para observar sus caractersticas
morfolgicas. Las tinciones generales estn
basadas en el uso de colorantes, sustancias
mediante las cuales se consigue colorear a los
tejidos. Los colorantes son normalmente
hidrosolubles y se caracterizan por unirse a
ciertas molculas presentes en los tejidos gracias
a afinidades electro-qumicas. Se utilizan
normalmente para teir a las clulas y
componentes tisulares que van a ser observados
con el microscopio ptico y por ello se realizan
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo
las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir
de inclusiones en parafina u obtenidas en el
criostato. Los colorantes son los elementos
principales de las tinciones generales. Son
molculas que poseen tres componentes
importantes: un esqueleto incoloro, que
normalmente es un anillo aromtico de benceno,
al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que
aporta el color, denominado cromforo, y otro
que posibilita la unin a elementos del tejido
denominado auxocromo. Al conjunto de estos
tres elementos unidos en una molcula se
denomina cromgeno.
Segn la naturaleza qumica del cromforo hay
varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos,
derivados de la antroquinona, derivados de la
acridina, derivados de iminas quinnicas,
derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,
derivados del xanteno y derivados de las
talocianinas.
Segn la naturaleza qumica del radical
auxocromo los colorantes se clasifican en:
Bsicos: son sales en las que la base aporta el
color, mientras que la parte cida es incolora.
Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido
como el ADN o ciertos componentes de la matriz
extracelular como los glicosaminoglicanos. As,
ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre
todo el ARNr presente en los ribosomas por ser
muy abundante, as como ciertas matrices
extracelulares ricas en componentes cidos.
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 8
Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina,
safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o
la hematoxilina.
cidos: son sales con el anin coloreado y la
base incolora. Tienen apetencia por sustancias
bsicas, sobre todo estructuras proteicas
localizadas en el citoplasma celular y tambin por
el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de
colorantes cidos son la fucsina cida, verde
rpido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porcin cida y otra
bsica, ambas con capacidad para aportar color.
Por tanto un mismo colorante puede teir tanto
las partes bsicas como las cidas de los tejidos.
Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Indiferentes: realmente no se unen a elementos
de los tejidos por afinidad qumica sino porque se
disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante
sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir
a las gotas de lpidos, especialmente en los
adipocitos.
En algunas ocasiones necesitamos resaltar
elementos tisulares de manera especfica y para
ello usamos colorantes que tienen apetencia por
dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin
denominada azn contiene azocarmn y naranja-
anilina-cido actico que tie los ncleos de rojo
y sobre todo destaca el conectivo intensamente
teido de azul. Otra tincin combinada es el
tricrmio de Mallory que tie el colgeno de
verde, las clulas musculares de rojo.
Cuando un colorante se une al tejido y refleja
un color diferente al que tiene en solucin se dice
que ha ocurrido un fenmeno de metacromasia.
Esto se debe a que las propiedades de absorcin
de la luz del colorante cambian al unirse a
componentes celulares. Por ejemplo, el azul de
toluidina se vuelve prpura cuando se une a
ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el
colorante unido al tejido tiene el mismo color que
en solucin se denomina ortocromasia.
Tincin general. Una de las tinciones ms
comnmente usada en histologa es la
 Tcnicas histolgicas. Tincin. 9

Seccin de un glomrulo de un rin de mamfero obtenida a partir de una

inclusin en parafina y teido con hematoxilinaeosina. Los ncleos aparecen
de color violceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tincin general de hematoxilinaeosina. Los tiempos son aproximativos
porque dependen del grosor de los cortes y de la concentracin de los colorantes. El desparafinado permite
eliminar el medio de inclusin, la parafina. El paso por agua de grifo es tpico de la hematoxilena y se
denomina diferenciacin. Las sales del agua permiten obtener una coloracin ms violcea, en vez de
prpura. La deshidratacin final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos
medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades pticas excelentes.
Adems, conservan las preparaciones durante aos en buenas condiciones. Tras el montado y secado
(evaporacin del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio ptico.
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hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina.
Como vemos se usa un colorante bsico y otro
cido para teir de diferente color a las
estructuras cidas y bsicas de la clula. Antes de
proceder a la tincin, si partimos de cortes de
parafina, tenemos que llevar a cabo unos
tratamientos previos sobre las secciones como es
el desaparafinado, y la hidratacin puesto que
estos colorantes son hidrosolubles. Si partimos de
cortes de criostato esto no se lleva a cabo.
Tincin de semifinos. Cuando se procesa
material para microscopa electrnica es
necesario, a veces, hacerse una idea de qu zona
del tejido vamos a cortar. Tngase en cuenta que
el rea de una seccin para observar con el
microscopio electrnico es muy pequea.
Adems, el proceso de osmificacin que ha de
llevarse a cabo previamente a la inclusin acarrea
el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta
an ms la orientacin de la muestra. Por ello es
frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 Cm de
Proceso de tincin de una seccin semifina. La porosidad de
la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de
tolouidina) hacen que se pueda teir el tejido sin necesidad
de eliminar previamente la resina .
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 10
Seccin semifina de un glomrulo de un rin
obtenida a partir de una inclusin en resina y
teida con azul de toluidina.
grosor con el ultramicrotomo para orientarnos en
la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual
haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos
suelen tener reas ms grandes que las que
posteriormente vamos a usar para la obtencin de
las secciones ultrafinas. El colorante usado para
teir secciones semifinas es
normalmente el azul de toluidina, el
cual puede infiltrase en la resina
calentada en un plancha y llegar hasta
el tejido.
Contraste de ultrafinos. El contraste
no es una tincin, puesto que no
aporta color a la muestra, pero s es
un proceso habitual para poder
observar los componentes
ultraestructurales de la clula. Por ese
motivo lo incluimos en este apartado.
Aunque las secciones para
microscopa electrnica se pueden
observar directamente con el
microscopio electrnico se suelen
tratar previamente con metales
pesados en un proceso denominado
contraste, obteniendo as una imagen
ptima de la ultraestructura celular.
Tngase en cuenta que en la
microscopa electrnica lo importante
no es aadir sustancias coloreadas
sino molculas que puedan interferir
con el camino de los electrones
emitidos por el microscopio y que
 Tcnicas histolgicas. Tincin. 11

chocan contra la muestra. Los electrones que

logran atravesar la muestra inciden sobre una
pantalla fosforescente que emitir destellos de luz
cuando reciban el impacto de un electrn y
permite observar las caractersticas del tejido.
Los metales pesados unidos al tejido impedirn
que pasen los electrones y por tanto se ver una
zona negra en la pantalla fosforescente, mientras
que en aquellas zonas de la clula donde no estn
estos metales provocarn reas luminosas en
dicha pantalla. Por ello todas las imgenes
originales de microscopa electrnica son en
blanco y negro, aunque se puedan colorear
posteriormente con un ordenador.

Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los

tiempos de incubacin en citrato de plomo y
acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas
de hidrxido sdico eliminan humedad del aire y
dificultan la pricipitacin del citrato de plomo. Los
lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo
repetidas veces (en ingls, "deeping") la rejilla en
el agua durante un tiempo de aproximadamente
30 segundos en cada pocillo con agua destilada.

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 12

Histoqumica

Incluiremos dentro de las tcnicas
histoqumicas a aquellas que supongan una
reaccin qumica en la que intervienen molculas
pertenecientes al propio tejido (trataremos la
deteccin de glcidos mediante lectinas y la
inmunohistoqumica en apartados diferentes a
ste, aunque algunos autores las incluyen como
tnicas histoqumicas). El objetivo de la
histoqumica es poner de manifiesto una
molcula o familia de molculas presentes en una
seccin histolgica y estudiar su distribucin
tisular "in situ". Estas molculas son difcilmente
discernibles con colorantes generales. Durante el
procesamiento del tejido previo a la reaccin
histoqumica, como la fijacin o la inclusin, hay
que evitar daar a la molcula que queremos
detectar porque de otra manera resultara en
falsos negativos, es decir, no tener tincin cuando
en realidad la molcula de inters s est presente
en el tejido, aunque deteriorada. En algunas
ocasiones es necesario realizar pasos previos a la
reaccin histoqumica para descubrir la molcula
que queremos detectar, por ejemplo usando un
fijador adecuado, ya que de otra manera no
reaccionara con los reactivos qumicos. Vamos a
dividir las tcnicas histoqumicas en dos grupos:
reacciones qumicas e histoqumica enzimtica.
Las reacciones qumicas consisten en la
modificacin qumica de molculas del tejido
para posteriormente poder colorearlas. Existen
tcnicas histoqumicas para detectar glcidos,
protenas y nucletidos. La tcnica histoqumica
ms empleada es la reaccin de PAS (Periodic
Acid Schiff). Se utiliza para la deteccin de
hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando
estn en cantidades relativamente grandes en los
tejidos. La modificacin qumica del tejido
consiste en la oxidacin mediante el cido
peridico de los enlaces entre los carbonos
prximos que contienen grupos hidroxilos. Esto
provoca la formacin de grupos aldehdos que
sern reconocidos por el reactivo de Schiff, el
cual se combinar con ellos para dar un color
rojizo brillante. Entre los componentes del
reactivo de Schiff est la pararosanilina (un
componente de la fucsina bsica) tratada con
cido sulfrico. Una gran ventaja de la tincin
histoqumica PAS es su capacidad de
discriminacin de tipos de glcidos con pequeas
modificaciones de la tcnica.

Tincin con hematoxilinaeosina (imagen de la izquierda) y PAShematoxilina (imagen de la derecha) de

las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las clulas
caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacridos,
mientras que en una ticin general aparecen transparentes, sin teir.

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 13

Tincin con hematoxilinaeosina (imagen de la izquierda) y PAShematoxilina (imagen de la derecha) de

las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las clulas
caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacridos,
mientras que en una ticin general aparecen transparentes, sin teir.

La histoqumica enzimtica o como la parafina puesto que la deshidratacin y

histoenzimologa se basa en la capacidad que
tienen algunos enzimas del tejido de mantener
funcional su centro activo tras el proceso de
fijacin. Estos enzimas y las clulas que los
poseen se ponen de manifiesto mediante una
reaccin enzimtica que convierte a unos
sustratos solubles e incoloros en productos
insolubles y coloreados. Los sustratos son
especficos para el enzima y los productos se
depositan en el lugar preciso donde se produjo la
reaccin, es decir, donde se localiza el enzima.
Las enzimas que se pueden detectar son variadas
como las peroxidasas, fosfatasas,
deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa,
etctera. Hay que tener en cuenta que cuando
queremos detectar una actividad enzimtica es
recomendable no incluir el material en medios
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la temperatura elevada pueden daar la
conformacin de la enzima y por tanto la
actividad de su centro activo. Por ello estas
tcnicas se realizan normalmente en secciones
obtenidas por congelacin o con el vibratomo.
La actividad NADPH diaforasa se asocia a la
enzimas sintasas del xido ntrico en sistema
nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha
relacionado con el control del flujo sanguneo y
con ciertos aspectos de la fisiologa del sistema
nervioso. Esta tcnica permite detectar neuronas
que expresan la enzima sintasa del xido ntrico
de una forma sencilla y rpida. La reaccin es
NADPH + tetrazolio = NADP+ + formazn. Es
el formazn el producto coloreado e insoluble que
se puede observar con el microscopio ptico,
incluso con el electrnico.
 Tcnicas histolgicas. Tincin. 14

Criostato. El mecanismo de rotacin y corte del criostato se

encuentra dentro de una cmara refrigerada.

Los pasos para la deteccin histoqumica de la actividad diaforasa es muy sencilla.

Tras una fijacin, preferentemente por perfusin, hay que permeabilizar el tejido con un
disolvente de lpidos como el TritonX100. El revelado se produce a 37 oC y el final de
la reaccin se controla mediante observaciones peridicas. La concentracin de los
sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) vara segn el tejido o el proceso de fijacin.

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 15

Lectinas

Aparte de las tcnicas de tincin generales y
las histoqumicas, ms especficas, existen otras
que se usan para detectar molculas tisulares con
una alta especificidad. Ello es posible gracias a la
capacidad que tienen ciertas molculas como las
lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y
unirse slo a una molcula determinada presente
en el tejido. En esta pgina vamos a tratar sobre
el uso de las lectinas para la deteccin en los
tejidos de distintos tipos de glcidos de manera
especfica. En muchos textos la tcnica de las
lectinas se incluye dentro del apartado de la
histoqumica.
Las lectinas son protenas que tienen dominios
o secuencias de aminocidos que son capaces de
reconocer y unirse a glcidos terminales que
forman parte de cadenas de oligosacridos, bien
libres o formando parte de otras molculas como
las glicoprotenas. Por ello se dice que las lectinas
reconocen glicoconjugados. Las lectinas estn
ampliamente distribuidas en los tejidos animales
y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por
ejemplo, la salida de los linfocitos desde el
torrente sanguneo hacia los tejidos daados se
produce gracias a la accin de unas lectinas
denominadas selectinas que expresan las clulas
endoteliales prximas al lugar de la lesin. Es
decir, el linfocito puede salir por la pared
endotelial gracias a la unin de las selectinas
endoteliales a los glcidos de la membrana del
linfocito. En el laboratorio de histologa las
lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la
distribucin tisular de distintos tipos de azcares
de manera especfica. Se pueden usar diferentes
tipos de lectinas en base a su especificidad de
reconocimiento de azcares determinados. Hay al
menos cinco grupos de lectinas segn se unan a
manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina
(Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc),
a fucosa (Fuc) o a cido silico (Neu5Ac),
respectivamente.
Comercialmente hay disponibles docenas de
lectinas diferentes que se nombran segn el
organismo animal o la planta de la que se
obtienen. En el siguiente cuadro se listan las
lectinas usadas comnmente segn el glcido que
reconocen.

Deteccin de lectinas mediante mtodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del pie de
Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda
muestra la deteccin de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su posterior
revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrn). En la imagen de la derecha se
muestra la deteccin de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un
anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la
localizacin de la fucosa (color azul).

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 16

Para poder observar el lugar de

unin especfica entre la lectina y
su glcido tenemos que unir a la
lectina un marcador que nos
produzca una seal visible con el
microscopio ptico o electrnico
de transmisin. Normalmente el
marcaje consiste en la unin de
una enzima como la peroxidasa de
rbano o la fosfatasa alcalina. Es el
resultado de la reaccin enzimtica
lo que se puede observar. Tambin
se usa como marcador una
molcula fluorescente que se
puede observar directamente en el
tejido con un microscopio de
fluorescencia. Cuando la enzima o
la molcula fluorescente estn
directamente unidas a la lectina se
denomina mtodo de deteccin
directa y cuando se unen a la
lectina mediante una molcula
interpuesta se denomina deteccin
indirecta. Las molculas
interpuestas ms comunes son la
biotina o anticuerpos especficos
(inmunoglobulinas tipo G)
Pasos para la deteccin de glcidos con lectinas. Los tiempos obtenidos contra la lectina.
pueden variar segn el material o la lectina usada. En este
ejemplo se usa un mtodo de deteccin indirecta puesto que la
La tcnica con lectinas se suele
lectina lleva unida una protena intermendiaria que es la biotina,
complementar con una serie de
la cual ser reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin
tratamientos que sirven para
biotincomplex") que contiene molculas de la enzima
obtener ms informacin acerca de
peroxidasa. Es la reaccin de este enzima tras aadir los
la composicin sacardica de los
sustratos apropiados, diaminobencidina ms perxido de
glicoconjugados. Por ejemplo, la
hidrgeno, la que produce productos insolubles y visibles con el
desulfatacin se usa para
microscopio ptico. El paso de BSA (albmina de suero bovino)
demostrar las uniones tipo steres
sirve para saturar posibles sitios de unin inespecficos de la
de sulfato de las cadenas
lectina. Si en vez de cortes en parafina hubisemos usado
terminales y la eliminacin tipo
cortes de vibratomo podrmos procesar, tras la reaccin de la
beta permite conocer si las cadenas
peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reaccin
sacardicas son uniones con enlaces
con el microscopio ptico y tambin con el electrnico de
tipo O (uniones covalentemente a
transmisin.
grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces
convalentes a grupos amino). En
este ltimo caso la alcalinizacin
de los cortes elimina las uniones
tipo O.

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 17

Inmunocitoqumica
La inmunocitoqumica es una tcnica para la Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se
localizacin de molculas en los tejidos mediante usan en las tcnicas inmunocitoqumicas son del
el empleo de anticuerpos. Es una tcnica que tipo G, producidas por unas clulas del sistema
gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la inmunitario denominados linfocitos B durante la
estandarizacin de su protocolo se ha convertido respuesta inmune. La produccin masiva de
en un mtodo sencillo, rpido y muy potente. Se anticuerpos se produce en un animal cuando le
basa en la gran especificidad y alta afinidad que inyectamos una molcula, en este caso nuestra
tienen los anticuerpos para reconocer a molculas molcula problema, que reconoce como extraa.
y unirse a ellas. Adems, la conjugacin o Estos anticuerpos pasan al suero sanguneo que
combinacin de los anticuerpos con enzimas o se extrae del animal inmunizado y a partir del
con sustancias fluorescentes permite detectar cual se purifican. stos se usarn posteriormente
cantidades nfimas de molculas presentes en el en la tcnica inmunocitoqumica. Las molculas
tejido. complejas como la protenas tienen en su
estructura varios determinantes antignicos, es
decir, lugares que son
capaces de desencadenar
una respuesta inmune. Ello
implica que cada
determinante antignico
activar un clon, lnea de
linfocitos B, que producir
anticuerpos contra l. Los
anticuerpos de todos los
clones de linfocitos B
activados por la molcula
inyectada irn a parar al
suero. Cuando se emplean
sueros purificados de este
tipo en inmunocitoqumica
se dice que se estn
empleando anticuerpos
policlonales. Existe una
tcnica que perimite aislar
y cultivar en el laboratorio
(in vitro) de forma
inividualizada a cada uno
de los clones de linfocitos B
activados durante la
respuesta inmune. Cada uno
de esos cultivos producir
un solo tipo de
inmunoglobulina G que
reconocer slo a uno de
los determinantes
Esquema resumido de las diferencias en la obtencin de anticuerpos antignicos de la molcula
policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha). inyectada. A estos
anticuerpos se les denomina
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monoclonales ya que proceden de linfocitos que
producen inmunoglobulinas idnticas.
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse
en dos dominos: la fraccin cristalizable y la
variable. El dominio variable es el que se encarga
de reconocer al determinante antignico de
nuestra molcula. Hay dos sitios de unin por lo
que cada inmunoglubulina podra reconocer a dos
molculas o determinantes antignicos, que han
de ser iguales. La fraccin cristalizable tiene una
estructura similar para todas las
inmunoglubulinas G producidas por los
individuos de una misma especie.
Para que un anticuerpo se una a su
determinante antignico localizado en una
molcula, sta no debe alterarse. De otro modo
ese determinante antignico no ser reconocido
por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijacin
del tejido debe elegirse para preservar al mximo
a la molcula que queremos detectar. As, se usan
Mtodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios
unidos especficamente a una molcula del tejido.
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 18
diferentes fijadores segn el tipo de molcula en
la que estemos interados. Tambin es necesario
considerar el mtodo de obtencin de los cortes.
Inclusiones en parafina pueden daar las
molculas por lo que en la mayora de los casos
se suele trabajar con cortes de vibratomo o con
secciones obtenidas por congelacin.
Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la
molcula que queramos detectar, no son visibles
con el microscopio por lo que la tendremos que
conjugar (unirla) a otras molculas que nos den
una seal visible. Estas molculas que aportan
visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos
tipos: molculas fluorescentes y enzimas. Las
primeras se pueden observar con el microscopio
de fluorescencia mientras que las segundas
pueden convertir determinados sustratos solubles
en productos insolubles y coloreados. La seal
aparece all donde est la sustancia fluorescente o
el enzima, que es donde se ha unido la
inmunoglubulina.
El mtodo del marcado con sustancias
fluorescentes tiene una serie de ventajas
que veremos ms adelante, pero tiene la
desventaje de que no son marcajes
permanentes puesto que la luz emitida
por la molcula fluorescente se
desvanece con el tiempo. Sin embargo,
las secciones procesadas con
anticuerpos unidos a enzimas pueden
deshidratarse, montarse y mantenerse
permanentemente para su obeservacin.
Las enzimas habituales que se unen a
las inmunoglobulinas son la peroxidasa
y la fosfatasa alcalina.
La conjugacin directa de un
marcador (enzima o fluorescente) con la
inmunoglobulina se denomina mtodo
de deteccin directa. Hoy en da se
suele emplear el mtodo de deteccin
indirecta, que consiste en colocar una
serie de intermediarios entre la
inmunoglobulina y la molcula
marcadora. Inicialmente se us el
mtodo indirecto denominado
peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver
figura anterior), pero actualmente es
 Tcnicas histolgicas. Tincin. 19

Deteccin de la molcula tirosina hidroxilasa mediante

inmunocitoqumica usando un anticuerpo primario sin
marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el
complejo avidiabiotinaperoxidasa.

Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido

previamente fijado. Inmediantemante despus se incuban en una solucin de bloqueo que
satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta concentracin de
protena como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del
complejo avidinabiotinaperoxidasa se procede a lavar los cortes en una solucin
tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los anticuerpos.
La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido
de hidrgeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio tico.
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ms frecuente usar el mtodo del complejo
avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura
anterior). El mtodo indirecto permite una mayor
versatilidad de la tcnica y mayor intensidad de
seal frente a una misma cantidad de antgeno.
La inmunofluorescencia se basa en las
propiedades de los fluorocromos. Son molculas
que emiten luz visible cuando se les ilumina con
una determinada longitud de onda. Aunque la
inmunofluorescencia se puede usar para detectar
a una sola molcula tisular, su verdadero
potencial se muestra cuando necesitamos una
mltiple inmunodeteccin, es decir, dos o ms
molculas presentes en una misma clula o
matriz extracelular de forma simultnea. Esto es
posible porque existe una gran variedad de
fluorocromos que son capaces de emitir luz
visible tras ser excitados con diferentes longitudes
de onda, luego seleccionando el intervalo de
longitudes onda con el que iluminamos un tejido
podemos excitar de modo individual, y
secuencial, varios fluorocromos que hayamos
usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes,
para detectar molculas diferentes. Tomando
fotografas tras cada excitacin y superponiendo
dichas imgenes podemos averiguar si las
molculas se expresan, por ejemplo, en la misma
clula.

Deteccin con inmunofluorescencia de dos antgenos en una seccin de tejido

nervioso: la molcula calbindina (a la izquierda) y parvoalbmina (a la derecha),
usando fluorescena y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante
un mtodo de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y
prolongaciones nerviosas. Las flechas blancas indican clulas que poseen
ambas protenas (calbindina y parvoalbmina) mientras que la flechas azules
indican cuerpos celulares que slo expresan parvoalbmina. Obsrvense las
zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 21

Deteccin simultnea de dos molculas situadas en misma seccin mediante

inmunofluorescencia. La razn de que los dos anticuerpos primarios procedan de
dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro
animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de
ratn y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario
reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

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Hibridacin in situ
No se puede considerar a la hibridacin in situ
como una tcnica de uso general. Sin embargo,
aporta una informacin sobre la fisiologa de las
clulas y los tejidos que no es posible obtener con
otras tcnicas. La hibridacin in situ se usa
ampliamente en investigacin en desarrollo
embrionario, diferenciacin de clulas madre,
manipulaciones genticas o cambios en la
fisiologa celular frente a seales externas, entre
otras. Permite descubrir la expresin de un gen
mediante la deteccin de su transcrito procesado,
el ARN mensajero. Podemos descubrir qu
clulas expresan un gen determinado y cundo lo
expresan. La expresin gnica es un testimonio
directo de la funcionalidad celular. Existe otra
aplicacin de la hibridacin in situ y consiste en
la localizacin fsica de un gen sobre un
cromosoma.
La hibridacin in situ se basa en la
complementariedad de bases de nucletidos. Del
mismo modo que en la inmunocitoqumica se
usan los anticuerpos, en la hibridacin in situ se
usa una secuencia de nucletidos, denominada
sonda, que es complementaria a la secuencia del
ARN mensajero que queremos detectar y que
est conjugada con una molcula que luego
pondremos de manifiesto y que nos sirve de
marcador.
Quiz una de las razones por las que la
hibridacin in situ no es comn todava en los
laboratorios de histologa es porque sintetizar una
sonda es complicado y generalmente no se puede
usar en una especie animal o vegetal distinta a
aquella para la que se ha producido dicha sonda.
Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero)
en dos especies distintas tienen secuencias que no
son idnticas y por tanto hay que fabricar una
sonda para cada especie. Sin embargo, una vez
obtenida la sonda el proceso de hibridacin es
sencillo.
Para obtner una sonda de un ARNm deseado lo
primero que tenemos que hacer es conocer la
secuencia de bases de dicho ARNm. Si esa esa
secuencia est publicada en las bases de datos en
Internet todo el proceso se simplifica enormente
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 22
puesto que hoy en da se pueden pedir
comercialmente la sntesis de forma qumica de
secuencias largas de ARN (hasta 1000
nucletidos es comn). Incluso, se pueden
comprar las sondas ya marcadas, con lo que nos
ahorramos una gran cantidad de tiempo en el
laboratorio.
Sin embargo, en muchos casos no conocemos
la secuencia de bases del gen deseado por lo que
hay que averiguarlo primero para obtener
posteriormente la sonda. Para obtener una sonda
hay primero que clonar la secuencia de bases del
gen (ARN mensajero) que queremos detectar.
Clonar implica realizar una serie de pasos: 1)
Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los
ARN mensajeros se retrotranscriben
(transcripcin inversa), es decir, se hacen copias
complementarias de ADN de todos los
fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen
hebras de ADN denominadas cDNA. 2)
Mediante la tcnica de PCR ("polymerase chain
reaction") se consiguen multitud de copias de
manera especfica de la secuencia de ARN
mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas
copias se integran en un plsmido y
posteriormente se introduce en bacterias. 4) Se
cultivan las bacterias para que proliferen y as
tambin conseguir gran cantidad de plsmidos,
que se duplican en cada divisin bacteriana. 5)
Los plsmidos se extraen y purifican. 6)
Mediante un proceso de transcripcin similar al
que ocurre en el ncleo de las clulas, a partir de
estos plsmidos se consiguen numerosas rplicas
complementarias a nuestra secuencia inserta, que
ser tambin complementaria a la secuencia del
ARN mensajero que queremos detectar. El
resultado de la transcripcin realizada repetidas
veces es un gran nmero de cadenas de ARN
denominadas sondas. Durante su sntesis es
cuando se aaden los nucletidos conjugados con
las molculas marcadoras que nos servirn para
detectarla una vez la hibridacin se haya
producido. Normalmente son molculas
pequeas como la digoxigenina y la biotina,
aunque tambin se pueden utilizar molculas
fluorescentes, que se unen a los nucletidos que
 Tcnicas histolgicas. Tincin. 23

formarn parte de la sonda. otras tcnicas como la inmunocitoqumica o

La hibridacin in situ se puede combinar con tinciones generales.

Esquema resumido del proceso de hibridacin in situ. NBT (nitro

blue tetrazolium) y el BCIP (5Bromo4chloro3indolyl fosfato,
sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el

receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una
lamprea

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 Tcnicas histolgicas. Tincin. 24

Esquema del proceso de hibridacin in situ sobre secciones de

criostato.

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