Eletroforese

Eletroforese para separar e s vezes purificar macromolculas

protenas e cidos nuclicos diferentes tamanhos, carga ou
conformao

Quando molculas so colocadas em um campo eltrico, migram

para o plo positivo ou negativo. Protenas (carga lquida negativa ou
positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel

O gel submerso em um tampo que possui ons para a corrente passar
E tambm para manter o pH mais ou menos constante.
Gel: composto de agarose ou poliacrilamida

Agarose um polissacardeo extrado de alga marinha.

Usada em concentraes de 0,5 to 2%. Fcil de preparar.
No-txico.

Gis de Agarose possuem ampla capacidade de separao

mas baixa resoluo
Dependendo da concentrao podem separar fragmentos de
DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
Poliacrilamida um polmero de ligao cruzada de acrilamida. Comprimento
das cadeias do polmero dependem da concentrao usada (3,5 a 20%).
So mais difceis de preparar. Como oxignio inibe a polimerizao precisam
ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotxico e deve ser manipulado com cuidado!!!

Luvas e mscaras devem ser usadas para pesar o p. A poliacrilamida
considerada no txica mas luvas devem ser usadas pela possvel presena
de acrilamida livre

Gis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separao mas

alta capacidade de resoluo. Para DNA a poliacrilamida usada para
separar fragmentos de menos de 500 bp. s vezes podem ser separados
fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferena. Tambm usados
para separao de protenas.
Equipamento e reagentes para gel de agarose:
Uma cuba de eletroforese e um fonte de fora
Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plstico transparente UV.
As extremidades so abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese

Pentes para fazer poos aonde as amostras sero aplicadas

Tampo de eletroforese (corrida), Tris-acetato-EDTA (TAE) ou

Tris-borato-EDTA (TBE).

Tampo de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra
Migrao: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp)

Brometo de Etdeo, corante fluorescente usado para corar cidos nuclicos.

Ateno: Luvas sempre pois o brometo de etdeo um agente mutagnico

Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com EtBr
Ateno: sempre usar proteo nos olhos (UV)
http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg
Tampo de amostra
 VISUALIZAO APS A ELETROFORESE
O corante mais comum para gis de agarose o brometo de etdio
(EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA
(ou RNA)

Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV

podemos ver as bandas de DNA.

http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
SYBR Green > Molecular Probes 1995
> Revolucionou a deteco de DNA em gis

A intensidade da fluorescncia do SYBR

Green aumentada em 100X quando se
liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas
de DNA.

Junto a sua sensibilidade superior o SYBR

Green tem outras vantagens sobre o EtBr:
- muito menos mutagnico,
- Pode ser adicionado diretamente
amostra antes da eletroforese.
Eletroforese Vertical
 VISUALIZAO APS SDS-PAGE

Coomassie Blue

Coomassie Brilliant Blue R250,

se liga inespecificamente a
praticamente todas as
protenas. menos sensvel
que corar com a prata mas
efetivo tambm, alm de ser
fcil de corar.

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22772/22772049.jpg
 Mtodo da Prata

A maior vantagem a sensibilidade sobre

os outros mtodos. Tipicamente 50X maior
que com Coomassie* Brilliant Blue R-250.

Sensibilidade maior oferece vantagens

como menos amostra no gel e anlise de
amostra diluda.

A prata pode detectar tambm cidos

nuclicos, glicoprotenas e lipoprotenas.