Agar nutritivo

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Agar nutritivo.

El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy til porque
permanece slido incluso a relativamente altas temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difcilmente
observables.
El agar nutritivo contiene normalmente (p/v):1

0,5% de peptona;
0,3% de extracto de carne/extracto de levadura;
1,5% de agar;
0,5% de cloruro de sodio;
agua destilada;
pH casi neutro (6,8) a 25 C.
El caldo nutritivo se hace exactamente igual, excepto por la omisin del agar.
Caractersticas del medio
Medio preparado: mbar claro a medio ligeramente opalescente.

El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseado para aislar
selectivamente bacilos Gram negativos y entricos (encontrados normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la
base de la fermentacin de la lactosa.1 El cristal violeta y las sales biliares inhiben el crecimiento de organismos grampositivos, lo
que permite la seleccin y el aislamiento de bacterias gramnegativas. Las bacterias entricas que tienen la habilidad de
fermentar lactosa pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato lactosa y el indicador de pH rojo neutro.

Los ingredientes necesarios para este medio son los siguientes: sales biliares (medio inhspito para el crecimiento de
bacterias Gram positivas, excepto Enterococcus y algunas especies de Staphylococcus), colorante cristal violeta (inhspito para
cierto tipo de bacterias Gram-positivo), indicador rojo neutro (el cual marca microorganismos que fermenten la
lactosa), lactosa, peptona y cloruro sdico.

Agar MacConkey con colonias Lac+ (izquierda) y colonias Lac- (derecha).

Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo as las bacterias gram negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las
que no pueden (Lac-).
Lac+[editar]
Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el
pH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparicin de colonias de color rosadas o rojas. Algunas bacterias en cambio
fermentan la lactosa de manera lenta, estas siguen siendo Lac+ por ejemplo: Serratia y Citrobacter.
Lac-[editar]
Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando amonaco,
lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras.
El agar Sabouraud es un medio de cultivo que por sus caractersticas funciona como medio de enriquecimiento para hongos y
que en caso de contener cloranfenicol u otro antibitico, se convierte en un medio selectivo para los mismos. El medio
contiene peptonas1 y una elevada concentracin de glucosa que favorece el crecimiento de los hongos sobre las bacterias. Es
utilizado para el cultivo de hongos, especialmente dermatofitos, aunque tambin pueden desarrollarse en l cierto tipo de
bacterias filamentosas tales como Nocardia.
Contiene normalmente:6

40 g/L glucosa
10 g/L pluripeptona
15 g/L agar
0,05 g/L [cloranfenicol]
pH 5.6

Salmonella Shigella Agar.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces,
alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.
La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la
mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el
indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen
colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05).

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0
Extracto de carne 5.0
Lactosa 10.0 Suspender 60 g del polvo por litro de agua
Mezcla de sales biliares 8.5 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2
Citrato de sodio 8.5
o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.
Tiosulfato de sodio 8.5
Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 ml por
Citrato frrico 1.0 placa. Secar la superficie del medio unos
Agar 13.5 minutos en la estufa.
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 0.2

Siembra
Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.
Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-
114-05).

Incubacin
Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Caractersticas del medio
Medio preparado: rojo naranja.

Agua Peptonada.

Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de inters sanitario.

Fundamento

Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucin fisiolgica para recuperar clulas
de enterobacterias daadas por procesos fisicoqumicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base
para la fermentacin de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestin.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de carne 10.0 Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua
destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar
Cloruro de sodio 5.0
en autoclave a 121C durante 15 minutos.
pH final: 7.2 0.2

Siembra
Por inoculacin directa del material en estudio.
Como diluyente: realizar las diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que se le quiera dar.
Incubacin
Aerbica, a 35-37 C durante 18-24 horas.
Caractersticas del medio:
Medio preparado: mbar claro.

Christensen Medio (Urea Agar Base).

Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica.

Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

Fundamento
En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos
alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la
enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como
especies de Enterobacter o Klebsiella.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Triptena 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua
Glucosa 1.0 destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar
Cloruro de sodio 5.0 en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Fosfato monopotsico 2.0 Enfriar a 50C y agregar 50 ml de una solucin
de urea al 40% previamente esterilizada por
Rojo de fenol 0.012
filtracin o cloroformo. Fraccionar en tubos
Agar 15.0 de hemlisis y solidificar en pico de flauta con
fondo profundo.
pH final: 6.8 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir
mayor tiempo de incubacin.
Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

Incubacin
En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C.
Limitaciones
-Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo
el medio de cultivo luego de varios das de incubacin.
-No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente.

Caractersticas del medio

Medio preparado: amarillo

Agua Triptona.

Medio lquido recomendado para enriquecimiento y para verificar la produccin de indol por los microorganismos.

Fundamento
El agua triptona, por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, y debido a su alto contenido de
triptofano, es un buen sustrato para la produccin de indol.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Triptona 10.0 Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua
destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar
Cloruro de sodio 5.0
en autoclave a 121C durante 15 minutos.
pH final: 7.5 0.2

Siembra
Inoculacin directa del material en estudio en tubos conteniendo agua triptona.

Incubacin
Aerbica, a 35-37 C durante 24-48 horas.

Prueba del Indol

Utilizar el reactivo de Kovacs o de Erlich: se considera un resultado positivo el desarrollo de un color rojo.
Caractersticas del medio:
Medio deshidratado: mbar claro
Medio preparado: mbar claro

Manitol Salado Agar.

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos
y otros materiales de importancia sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS
Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el
manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa
negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin
exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y
minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se
modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del
mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o
prpura.
 Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de carne 1.0
Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
d-Manitol 10.0
calentando a ebullicin durante 1 o 2
Cloruro de sodio 75.0
minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a
Agar 15.0 118-121C durante 15 minutos.
Rojo de fenol 0.025
pH final: 7.4 0.2

Siembra
Sembrar en superficie un inculo denso de la muestra.

Incubacin
De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la incubacin durante 3 das a 32 C, en aerobiosis.

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

MR-VP Medio

Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias.

Fundamento
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de
carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada, se
originarn productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil metil
carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como rojo de metilo, para
revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de
productos finales neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar hidrxido de potasio a los cultivos de
ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual
reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua
Glucosa 5.0 destilada. Calentar suavemente agitando
hasta disolver. Distribuir y esterilizar en
Fosfato dipotsico 5.0 autoclave a 118-121C durante 15 minutos.
pH final: 6.9 0.2

Siembra
Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio.

Incubacin
En aerobiosis, a 35-37C por 3 das.

Revelado de pruebas bioqumicas

a-Prueba del rojo de metilo:

Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.

b-Prueba del Voges Proskauer:

Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar
vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

Resultados

1-Prueba del rojo de metilo:

Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.

2-Prueba de Voges Proskauer:

Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos despus de una completa agitacin del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.

Limitaciones
En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie mediante el revelado por la
metodologa descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de
color rojo.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro, transparente sin precipitado.

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y
energa.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de
carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el
magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de
pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de
utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente
produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido
tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio
alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por
Cloruro de sodio 5.0 litro de agua destilada. Dejar reposar 5
Fosfato dipotsico 1.0 minutos y mezclar calentando a ebullicin
Fosfato monoamnico 1.0 durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y
esterilizar en autoclave a 121C durante 15
Sulfato de magnesio 0.2
minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Azul de bromotimol 0.08
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubacin
A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Limitaciones
-Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo.
-Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes
de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados
falsos positivos.

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde.