Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

LA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Objetivo

- Adquirir conciencia de los riesgos potenciales durante el trabajo en el

Laboratorio de Microbiologa
- Reconocer las vas de infeccin ms comunes en el laboratorio
- Identificar los distintos niveles de bioseguridad en Microbiologia y los
requerimientos de proteccin personal, del medio ambiente y de las
muestras en cada uno de ellos.

Introduccion

Las personas que trabajan en un laboratorio QUMICO estn expuestas a

una serie de riesgos potencialmente graves. Comnmente estn en contacto con
sustancias y vapores txicos y explosivos, carcingenos, sustancias custicas,
altos voltajes, radiaciones, etc. En un laboratorio de Microbiologa hay que agregar
otro riesgo: la INFECCION por microorganismos.

La infeccin difiere de la mayora de los otros riesgos en que los efectos no

estn limitados a quien trabaja individualmente ni a sus compaeros de trabajo,
sino que la infeccin tambin puede ser transmitida fuera del laboratorio, a su
familia, contactos humanos casuales, animales domsticos o de experimentacin,
etc. No debe olvidarse que pueden diseminarse agentes no patgenos para los
seres humanos, pero capaces de contaminar medios de cultivo, reactivos o que
afectan la vida de las plantas.

Vas de infeccin ms comunes en el laboratorio

- tracto digestivo: ingestin o transferencia de microorganismos desde

dedos contaminados.
- mucosas: nasal, conjuntiva, aerosoles y manos contaminadas
- piel va percutnea: inyeccin, cortes o escoriaciones.
- respiratoria: es la ms importante. El 80% de las infecciones contradas
en el laboratorio son de origen areo por inhalacin de aerosoles que
transportan microorganismos o virus.

Importancia de la va respiratoria

Se deben tener en cuenta 3 factores principales.

- La facilidad con que se producen pequeas gotas y partculas.

1
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

- Las pequeas partculas (entre 1-4 m) no son retenidas en el tracto

respiratorio y llegan a pulmn.
- La capacidad de la mayora de los microorganismos patgenos para
invadir tejido pulmonar.

La infectividad de un microorganismo depende de:

- el tamao de la dosis
- la susceptibilidad individual
- la virulencia del agente (vara con el microorganismo y la cepa)
- el sitio de invasin

Situaciones de riesgo ms comunes en el Laboratorio

Mecanismo de produccin de aerosoles

La produccin de aerosoles es generada por 2 mecanismos:

- atomizacin de suspensiones lquidas

- molido muy fino de material slido infectado
Muchas tcnicas de laboratorio producen distintos aerosoles mediante burbujeo,
salpicadura, espuma, quemado del ansa, y dos mecanismos adicionales: vibracin
de alta frecuencia y fuerza centrfuga. Los aerosoles tambin se producen cuando
se manipulan cultivos secos, liofilizados o secados con acetona (ej. cuando se
destapan tubos o ampollas).

Tcnicas comunes de laboratorio

Adems de la produccin de aerosoles hay que tener en cuenta el riesgo que se

genera como consecuencia de la deposicin de material infectado sobre distintas
superficies, como la mesada de trabajo, elementos personales como cuadernos,
lapiceras, y las propias manos, a partir de las cuales los microorganismos pueden
ser transferidos a la piel, boca y ojos. Es recomendable el uso de guantes
descartables, barbijo y gafas.

Pipetas y pipeteo

Las pipetas se preparan para conservar su esterilidad hasta que son utilizadas.
Una prctica casi universal es colocar un tapn de algodn en la parte superior
para prevenir la entrada de polvo. Sin embargo, el tapn protege relativamente a
quien usa la pipeta ya que es fcilmente penetrado por microorganismos

2
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

presentes en suspensiones lquidas. Las pipetas contaminadas se descartan

siempre en un frasco con lavandina.

El pipeteo oral debe ser evitado en Microbiologa. Se recomienda el uso de

propipeta.

El ansa

Mediante el flameado (quemado directo a la llama) del ansa o agujas

contaminadas se puede producir diseminacin de organismos, particularmente
cuando se trabaja con inculos semi-slidos (ej. suspensiones de esporas,
colonias de Mycobacterium o esputo). Tambin puede ocurrir con pequeos
volmenes de lquido.

El mismo riesgo se corre cuando se introduce el ansa caliente en un lquido, o se

hace contacto con la superficie de agar de un cultivo.

El ansa fra, una vez cargada, puede contaminar cuando se producen vibraciones
o rpidos movimientos de aire que causen desprendimiento de pequeas gotas.
Por esta razn, no agite ni sacuda el ansa mientras trabaja.

Las placas de agar

La principal fuente de infeccin resulta cuando cae al suelo y se rompe una placa
de Petri con cultivo. El mismo riesgo se corre cuando se utilizan tubos o botellas
con agar. En esos casos, neutralice la contaminacin con lavandina diluida y
despus de unos minutos comience el operativo de limpieza usando guantes.
Confine los restos de vidrio en un recipiente que luego ser esterilizado.

Tapones y tapas

La remocin de tapones de algodn, tapas a rosca o tapones de goma u otro tipo

de tapa en tubos con caldo de cultivo, tubos de centrfuga, etc., puede crear
aerosoles de varias maneras, sobre todo si los cultivos han sido agitados y hay
material particulado. Oriente la boca del tubo hacia el mechero en el momento de
abrir!

Hay que tener presente que los tapones de medios lquidos (sobre todo si se
agitan previamente) pueden estar humedecidos con material infectivo. Si es
necesario agitar el tubo, hacerlo con suavidad para evitar este inconveniente.

3
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Precauciones

Las medidas preventivas a tomar caen en 6 categoras:

- proteccin fsica del trabajador (guardapolvo, guantes, barbijo, gafas,

uso de propipeta, etc.)
- tcnicas cuidadosas: buen manejo de la tcnica asptica
- mtodos de confinamiento del agente (cmaras de bioseguridad, flujo
laminar vertical, ambientes aislados con presurizacin positiva o
negativa, recipientes con desinfectante para descartar material
contaminado, envases bien tapados, sin filtraciones).
- barreras intangibles (desinfeccin del aire: uso de lmparas UV, reas
estriles)
- desinfeccin en general (empleo de etanol al 70%, alcohol iodado,
lavandina diluida u otros productos segn el caso: piel, superficies
inertes, instrumentos metlicos, etc).
- medidas inmunolgicas (vacunacin del personal cuando sea posible)

4
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Requerimientos recomendados para distintos niveles de bioseguridad en

Microbiologa

Nivel Prcticas y tcnicas Equipamiento Alcance

1 Prcticas Ninguno Agentes bien caracterizados
microbiolgicas que presentan riesgo mnimo
standard para el personal y el medio
ambiente Ej. Bacillus subtilis
2 Personal con GBS clase I II Agentes de moderada
entrenanamiento peligrosidad para el personal
especfico. Acceso y el medioambiente. Ej.
restringido absoluto Salmonella, sangre, fluidos
corporales, tejido humano y
animal
3 Acceso ms restringido. GBS clase II Agentes con potencial de
Registro de visitas y transmisin area que
accidentes. Barreras de pueden causar infeccin seria
contencin fsica: potencialmente letal. Alto
mscaras, guantes, riesgo personal, bajo riesgo
rotores sellados, filtros comunitario Ej.
HEPA Mycobacterium, Coxiella
4 Barreras de aire con el GBS tipo III Agentes exticos productores
exterior. Cambio de Traje de enfermedades letales
ropa y ducha. presurizado para los que no existen
Intercambio de ropa vacunas ni terapia. Ej: virus
sucia a limpia por Ebola
tuberas.
GBS: gabinete de bioseguridad.

Direccin de aire limpio Direccin de aire contaminado

5
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

REGLAS A TENER A CUENTA EN CADA SESIN DE TRABAJOS PRCTICOS

1. Reportar los accidentes al docente a cargo del Trabajo Prctico, no importa lo

insignificante que puedan parecer.
Se debe reportar toda enfermedad o lastimadura tan rpido como sea posible.
La prdida de tiempo en la identificacin de una infeccin de laboratorio puede
tener graves consecuencias.
2. Tratar a todos los microorganismos como patgenos potenciales para el ser
humano, o contaminantes para los cultivos vecinos. Rotular todo el material
infectivo para prevenir confusiones. Los nmeros en cdigo no son
adecuados.
3. Usar ropa y elementos de seguridad (ej. guardapolvo, guantes, mscara, etc).
4. Manejar los materiales cuyo potencial patgeno se desconoce (ej. esputo,
suero, material fecal, microorganismos no identificados) como si fueran
infectivos, ya que probablemente lo son.
5. El laboratorio debe permanecer siempre limpio. La mesada debe estar libre de
todo material que no sea esencial. La superficie debe limpiarse antes y
despus de cada sesin de laboratorio con una solucin germicida. Todo el
material contaminado, cultivos, pipetas, tapones, etc., deber ser esterilizado
antes de ser lavado.
6. Antes de dejar el laboratorio, sacarse el guardapolvo, lavarse cuidadosamente
las manos con agua y jabn y desinfectarlas.
7. Tener un desinfectante listo para ser usado en suficiente volumen para llevar a
cabo una descontaminacin de emergencia en el caso de salpicaduras.
Asegurarse que el desinfectante sea activo contra el organismo que est
siendo manejado.
8. Nunca comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio, o pipetear con la
boca. Usar propipetas o pipetas automticas. Siempre recordar que las manos
o guantes pueden estar contaminados y ser capaces de transferir la infeccin
al cuerpo.
9. Nunca llevar a cabo una accin apresuradamente, en particular aqullas que
pueden producir burbujeo, salpicaduras, volcaduras o contaminar superficies
que es necesario mantener limpias (ej. las tapas de las botellas).

Bibliografa

- Ferrari S., Mattana C., Digenaro M.S. y Favier G. 2011. Manual de

Seguridad en el Laboratorio de Microbiologa. Nueva Editorial
Universitaria. ISBN/ISSN 978-987-1595-68-6, UNSL, San Luis,
Argentina.
- Microbiological safety cabinets. Reproducido de Collins C.H. Laboratory
Acquired infections (2nd ed). Extrado del curso de posgrado Cultivo
celulares y sus aplicaciones biotecnolgicas. 1994. Laboratorio de
Virologa, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA. Buenos
Aires.

6
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

ESTERILIZACION

OBJETIVOS

- Definir y diferenciar los conceptos de esterilizacin, desinfeccin y

pasteurizacin
- Conocer diferentes mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin y
desinfeccin utilizados en el Laboratorio de Microbiologa y sus
aplicaciones
- Adquirir conocimiento en la preparacin de materiales y medios de
cultivo a esterilizar y en el manejo de equipos usados en esterilizacin.
- Aplicar controles de esterilizacin y esterilidad a los procesos

INTRODUCCIN

A. CONCEPTOS

ESTERILIZACIN: Tratamiento mediante el que el objeto queda libre de todo

organismo vivo. Consigue eliminar a todos los microorganismos patgenos,
saprofitos y formas de resistencia. stas tcnicas se usan exclusivamente sobre
objetos inanimados, nunca en seres vivos. Procedimiento mediante el cual la
probabilidad de que el objeto tratado contenga un solo superviviente sea infinitamente
pequea, produciendo ausencia absoluta de toda forma viable de vida (la
probabilidad de sobrevivencia de un microorganismo es de 1 x 10 -6, es decir 1 en
un milln). El procedimiento fsico o qumico que se emplee para la
esterilizacin seguir una cintica (curva de muerte) exponencial, que depender del
mtodo, de el ente sobre el que se aplique y de la carga microbiana presente. Se
aportarn las condiciones necesarias para acabar con las formas de vida ms
resistentes, para tener la seguridad de que se han destruido las ms sensibles.
Muerte: Prdida irreversible de cualquier capacidad para reproducirse
DESINFECCIN: Eliminacin de todos los microorganismos patgenos, pero no
necesariamente de todas las formas microbianas. Uso de agentes qumicos para
eliminar la infectividad potencial de un material mediante la destruccin de las
formas vegetativas de los agentes patgenos. No implica la eliminacin total de los
microorganismos, ya que las esporas pueden sobrevivirAplicacin sobre objetos

7
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

inanimados. Proceso o tcnica de destruccin de microorganismos patgenos y

saprofitos productores de enfermedades transmisibles y que pueden ser aplicado sobre
seres animados u objetos inanimados, si se acta sobre:
Bacterias: bactericida
Hongos: fungicida
Virus: virucida
PASTEURIZACIN: es un proceso donde se aplican alternativamente altas y
bajas temperaturas para reducir en un 97-99% la poblacin microbiana presente
en leche y otros alimentos. No es sinnimo de esterilizacin.

ANTISEPSIS: Se aplica sobre tejidos vivos, para inhibir o destruir microorganismos.

Los antispticos son sustancias aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o
detiene el crecimiento o la accin de microorganismos por inhibicin de su
actividad o por su destruccin. Son sustancias orgnicas o inorgnicas que sirven
para la antisepsia cutnea y para neutralizar la infeccin inhibiendo la
proliferacin de grmenes. Es importante que rena las siguientes caractersticas:
Determinar caractersticas del agente tpico: no absorbible, reduccin rpida de
la flora, espectro de actividad
Evaluar seguridad y eficacia en reducir el recuento de microorganismos
Aceptacin por el personal que lo va a usar y que sea econmico

B. TCNICAS DE ESTERILIZACIN

Existen diversos mtodos fsicos de esterilizacin y de inhibicin del

crecimiento microbiano, como pueden ser el calor, la filtracin y la radiacin, pero
el ms ampliamente usado es el calor, ya sea hmedo seco, los cuales tienen
diferente penetrabilidad.
El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal
bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y
substancias, con el propsito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este
proceso se llama Esterilizacin y al material, cultivo medio de cultivo

8
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

sometido a ste, se le denomina entonces Estril, es decir, desprovisto de toda

forma viviente.
Cuando se efecta experimentalmente la esterilizacin de una poblacin
microbiana, contenida en un medio de cultivo en todo el material utilizado en
microbiologa es de suma importancia conocer los diversos mtodos de
esterilizacin los cuales se dividen en:

I. Esterilizacin por agentes fsicos:

a. Esterilizacin por calor
b. Esterilizacin por radiacin

II. Esterilizacin por agentes mecnicos:

Esterilizacin por filtracin:

a. Fluidos lquidos
b. Fluidos gaseosos: aire

III. Esterilizacin por agentes qumicos:

xido de etileno, glutaraldehido, formaldehido

IV. Esterilizacin en fro:

gas plasma

I.a.- ESTERILIZACION POR CALOR:

Tyndalizacin: bao Mara a ebullicin

- calor hmedo vapor fluente

Autoclave a presin: 121C durante 15-20 min.

- calor seco Aire caliente (estufa): 160-180C durante 1.5-1 h

respectivamente.

- calor directo Llama directa: al rojo, flameado.

9
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

I.b- ESTERILIZACION POR RADIACION

a. luz ultravioleta
b. radiaciones ionizantes

II.a- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS LIQUIDOS

Se aplica a aquellas sustancias que se alteran por contacto con el agua o por
accin del calor.

-membranas filtrantes Filtros standard

(actuales) Filtros especiales
Ultrafiltros

II.b- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS GASEOSOS

La eleccin del mtodo de esterilizacin depende del tipo de material a

esterilizar, as como la finalidad que se persiga.

MTODOS FSICOS
I.a.- ESTERILIZACIN POR CALOR

La esterilizacin por calor es uno de los mtodos ms comnmente

utilizados en el laboratorio, es muy til para la cristalera, los medios de cultivo y
para la esterilizacin de los medios despus de su utilizacin y este puede ser:
a. Calor Hmedo
b. Calor Seco
c. Calor Directo

a. Calor Hmedo
Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilizacin se hace por el
vapor a presin en una autoclave u olla de presin.

Descripcin del autoclave.

Es un cilindro de acero inoxidable que consta de los siguientes elementos (Fig. 1):

10
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Descripcin de la olla.
Es de forma cilndrica de acero inoxidable y consta de los siguientes elementos:
1) Un cuerpo cilndrico con topes hermticos; 2) Una tapa que contiene un
indicador de presin y temperatura, una vlvula de seguridad y una espita de
escape de vapor (Fig. 2).

Figura 2. El tipo olla de presin es el ms comn, es un aparato para agua

hirviendo a presin. Tiene una cmara vertical de metal provista de una tapa
metlica fuerte que se aprieta y cierra hermticamente mediante un aro de goma.
Se disponen en la tapa una espita para la salida del aire y el vapor, un indicador
de presin y una vlvula de seguridad. El agua del fondo de la autoclave se
calienta mediante mecheros de gas exterior, un calentador elctrico de inmersin
o un serpentn de vapor.

11
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

b. Calor Seco
La esterilizacin se hace por medio de un horno que permite alcanzar
temperaturas ms elevadas (150- 180C) que no pueden soportar los medios de
cultivo y el material de goma plstico, se utiliza ms para la esterilizacin del
material de vidrio (matraces, probetas, etc.) y en los instrumentos.

Descripcin del Horno pasteur o estufa punpinel (Fig. 3)

Es de forma rectangular, tiene doble pared que permite circular el calor producido
por unos picos de gas una resistencia elctrica. Se utiliza para esterilizar
material de vidrio, porcelana y tambin para objetos metlicos. El material deber
introducirse en la estufa una vez limpio y seco, una vez introducido hay que
procurar que estos no toquen las paredes de la estufa, porque alcanza
temperaturas muy altas. Una vez introducido el material, se cierra la estufa y se
enciende, dejndolo calentar hasta 180 , dejndolo a estas temperaturas por
espacios de tiempo variables, dependiendo del tipo de material que se ha
introducido. Una vez transcurrido el tiempo deseado se apagar y se dejar enfriar
totalmente antes de sacar el material.

c. Calor Directo

Se utiliza en asas bacteriolgicas. La esterilizacin se efecta directamente

en la flama del mechero (Fig.4).

12
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Figura 4. La esterilizacin adecuada del material es importante para obtener los

resultados esperados.

I.b.- ESTERILIZACIN POR RADIACIN

a. Radiacin ultravioleta.
Su efectividad como agente letal y mutgeno depende de la longitud de onda.
La longitud de onda ms efectiva como bactericida se encuentra en el espectro de
240 a 280 nm, con un ptimo a 260 nm, que corresponde con la mxima absorcin
del DNA.
La radiacin UV conduce a la formacin de uniones covalentes entre
residuos de pirimidina adyacentes entre s ubicados en la misma hebra, dando
lugar a la formacin de dmeros de pirimidina. stos interfieren en el apareamiento
normal de las bases y el resultado final es la inhibicin de la sntesis del DNA.
Este tipo de radiacin presenta algunos inconvenientes para ser usada como
agente esterilizante. Su energa es baja y su capacidad de penetracin es escasa.
Por lo tanto su aplicacin principal consiste en el control de infecciones
transmitidas por el aire, donde se la emplea para la desinfeccin de reas
cerradas como las salas de hospitales, quirfanos y laboratorios.

b. Radiaciones ionizantes.
Es tipo de radiacin es de alta penetracin e incluye rayos x y . Su accin
letal se produce en forma indirecta. A medida que las radiaciones ionizantes
atraviesan el H2O provocan la ionizacin de sus molculas.

13
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilizacin de material

quirrgico, mdico y de laboratorio descartable y en general en procesos de
esterilizacin en gran escala.

II.a. FILTRACIN DE FLUIDOS LIQUIDOS

Es el principal mtodo para esterilizar lquidos que contienen componentes

sensibles al calor, tales como vitaminas, protenas sricas, antibiticos y
soluciones salinas definidas. Consiste en hacer pasar lquidos por un material que
posee poros ms pequeos que las bacterias e incluso ms pequeos que los
virus, con lo cual aquellos quedan libres de microorganismos, segn el tamao de
dichos poros.
Para cualquier tipo de filtro, hay dos sistemas de filtracin: 1) al vaco por
succin o 2) mediante presin positiva.

Fig 5 Equipo de Filtracin

II.a. FILTRACIN DE FLUIDOS GASEOSOS

Se aplica en la industria farmacutica, en ciruga, etc., para disminuir al mnimo la

probabilidad de contaminacin del aire. Se usan filtros HEPA y ULPA.

14
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Existen bsicamente 2 tipos de reas estriles:

La segunda corresponde a los ambientes de los GBS.

III.- MTODOS QUMICOS:

Por sus efectos en los microorganismos los agentes qumicos pueden ser
de dos tipos bsicos: bactericidas (matan al microorganismo) son esterilizantes y
bacteriostticos (simplemente impiden el desarrollo del microorganismo).

AGENTES QUMICOS BACTERICIDAS:

Oxido de etileno: Se emplea en forma gaseosa para esterilizar
superficies expuestas, materiales porosos, instrumentos, materiales
plsticos, filtros.

15
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Formaldehido: Es un agente alquilante que se combina con grupos

NH2, -COOH y SH en los cidos nucleicos y protenas.
Glutaraldehdo

C. TCNICAS DE DESINFECCIN

Por lo general los agentes bacteriostticos tienen un efecto reversible; es

decir, que al eliminar el agente, los microorganismos vuelven a su actividad normal
y pueden crecer si se les coloca en las condiciones que necesitan para su
crecimiento.

AGENTES QUMICOS BACTERIOSTTICOS: MECANISMOS DE ACCIN

El cloro (hipoclorito de Na): es un agente altamente corrosivo; su

actividad se neutraliza con materia orgnica.
Acidos: por efecto de pH.
Alcalis: por efecto de pH.
Sales: por vestigios de metales pesados que las acompaan. Ej.
sales de Hg, Cu, Ag (sales de metales pesados) y otros metales suelen utilizarse
como antispticos.
Iones de metales pesados: envenenamiento de enzimas a nivel de
grupo SH.
Jabones: desnaturalizantes de protenas y disolucin de lpidos.
Alcoholes alifticos: desnaturalizantes de protenas Ej. etanol,
isopropanol. Son ms activos cuando estn diluidos en agua (50-70% de alcohol
en agua). Son solventes de lpidos y desnaturalizan protenas.
Eteres: desnaturalizantes de protenas.
Alcoholes aromticos: Ej. fenoles y cresoles: disolventes de lpidos
y desnaturalizantes de protenas.
Halgenos: desnaturalizantes de protenas (sobre puentes
disulfuro).

16
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Colorantes: sensibilizacin fotodinmica (desnaturalizacin de

protenas)
Alquilantes: inactivan macromolculas por puentes alquilantes entre
=NH y NH2.
Detergentes sintticos: desnaturalizacin de protenas y disolucin
de lpidos. Ej. Tensioactivos catinicos: actan afectando las membranas
celulares mediante interacciones de carga con los fosfolpidos. Se utilizan para
limpieza de material contaminado y superficies de trabajo.
Tensioactivos aninicos: su accin se manifiesta a travs de una
eliminacin mecnica de los m.o., por lo tanto su accin no es desinfectante. Se
utilizan para el lavado del material ya decontaminado.

D. MANIPULACIN EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD

La muestra puede ser:

Muestra Contaminada (proteccin)
Muestra estril (evitar su contaminacin)
En ambos casos los mecanismos son los mismos, se trata de evitar el trasiego de
microorganismos entre el material y el medio ambiente o el manipulador.
Aspectos a tener en cuenta
1. Zona de trabajo limpia y en condiciones extremas estril (Mecheros, Gabinetes de
seguridad biolgica en los laboratorios de manejo de muestras de alta peligrosidad,
Campanas de extraccin para drogas voltiles y txicas).
2. El material empleado para manipular la muestra debe de mantenerse estril
(flameado) o desecharse en condiciones de seguridad tras su empleo.
3. El ambiente (aire) ser estril por UV, filtracin., antes del manejo.
4. El manipulador utilizar mtodos de barrera (gorros, mascarillas, guantes) para
proteger la muestra de su flora
5. Terminado el proceso, todo el material empleado deber de ser lavado y
esterilizado si se va a reutilizar o esterilizado y desechado en recipientes especiales.

17
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Todo el proceso va a estar condicionado por el nivel de bioseguridad que queramos

alcanzar, dependiendo del material a emplear y del o de los microorganismos de los
que nos queramos proteger o proteger a la muestra.

ACTIVIDADES A REALIZAR

MATERIALES
Placas de Petri Frascos de vidrio
Tijera Pinza
Caja de metal Aceite
Pipetas de vidrio Gasa
Alcohol Hipoclorito de Sodio (lavandina)
Probeta Agua destilada
Medio de cultivo Ansa
Mechero de bunsen Placas de Petri con medio de cultivo
Cultivo de bacterias/hongos

1) Preparacin del material a esterilizar:

Material de vidrio
Placas de petri: se envuelven individualmente con papel (Autoclave).
Tubos con o sin tapn de algodn: se arman grupos de 10 tubos, y se
envuelven en papel. (Autoclave).
Pipetas (de 0,1;0,2;0,25 y Huddleson : se introducen en tambores metlicos
(pipeteros) y se esterilizan en estufa o autoclave.
Pipetas: (de 1, 2, 5, 10, 25 ml). Se introduce un trozo pequeo de algodn
en la boca de la pipeta, se envuelve en papel blanco o manteca, se indica su
capacidad y con una flecha la boca de la misma. Se preparan en haces de 10-15
pipetas del mismo volumen envueltas en papel con la punta hacia arriba.
(Autoclave).

18
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Frascos vacos con tapa a rosca de plstico: Se colocan tapados con la

tapa semi enroscada, con un capuchn de papel de aluminio o envueltos en papel
madera. (Autoclave).
Materiales metlicos: tijeras, esptulas, pinzas, etc. Se envuelven
individualmente, se colocan en cajas metlicas que cierren hermticamente.
(Estufa/Autoclave)
Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en
frascos de vidrio que en el fondo contengan un trozo de algodn, se cierra el
frasco dejando la tapa media floja. (Autoclave)
Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapn de
algodn y capuchn de papel. (Estufa)
Medios de cultivos: se colocan en frascos individuales con tapn de algodn
y capuchn de papel. (Autoclave)
Soluciones tampones, antibiticos: se filtran

NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el

rotulo se debe indicar el tipo de material y la fecha de esterilizacin. El material
que se ha esterilizado en autoclave se lleva a estufa de 37C hasta que est
completamente seco.
Una vez que ha finalizado el proceso de esterilizacin, el material deber ser
guardado correctamente (cajones, armarios, heladeras, etc.) a fin de evitar
contaminaciones y asegurar la duracin del proceso de esterilizacin. El tiempo
promedio que dura la esterilizacin es de 1 a 3 meses, paso dicho tiempo el
material deber ser re esterilizado por ms que no haya sido utilizado.

2) Preparacin de alcohol al 70 % (Cambio de su pH) y lavandina 10%

(formacin de hipoclorito de sodio) para su uso como desinfectante.

19
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

3) Anlisis de la importancia de la esterilizacin del ansa: Tcnica de

esterilizacin con calor directo. Estas se deben esterilizar antes y despus de
llevar a cabo la siembra de cualquier tipo de bacteria.
a. Poner el ansa directamente en la parte azul de la flama durante algunos
segundos.
b. Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfra en las paredes
superiores del recipiente de cultivo.

4) Armado de equipo de filtracin para esterilizar lquidos.

5) Anlizar el siguiente temario:

a. Preparacin del autoclave: instrucciones, condiciones operativas y

precauciones con respecto al material a esterilizar.
b. Controles fsicos, qumicos o biolgicos de esterilizacin en autoclave
durante el proceso.
c. Control de esterilidad sobre los medios de cultivo esterilizados en autoclave:
para ello tomar no menos del 10% de los tubos o recipientes con medio de cultivo
y colocar en estufa de incubacin a 37C durante 24 h.
Funcionamiento de una olla a presin tanto en esterilizacin como en
tyndalizacin.

BIBLIOGRAFA

-Velzquez L. Esterilizacin y desinfeccin. 2012. Apunte de Teora. Microbiologa

General, FQBF, Universidad Nacional de San Luis. De lectura obligatoria para
este Trabajo Prctico.
-Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biologa de los microorganismos. 10. Edicin.
Pearson-Prentice Hall.
-www.google.com (imagen)

20
 Trabajo Prctico N 1 Bioseguridad-Esterilizacin 2013

Cuestionario de revisin:

1. En ausencia de un agente antimicrobiano qu otros factores pueden inhibir el

crecimiento de los microorganismos?

2. Mencione las principales diferencias entre ESTERILIZACIN, DESINFECCIN

y ANTISPSIS.

3. a. Qu ocurre con la viabilidad de los microorganismos si los coloco en el

frezer (-20C)? y en el horno (120C)?

b. Un microorganismo A es expuesto a calor hmedo, 100C durante 15 minutos y

otro B a 140C durante 15 minutos. Finalizado el tiempo se observa que el
microorganismo B sigue viable, Cmo se puede explicar esto?

4. Donde considera que deben esterilizarse los siguientes elementos: Pinza de

metal, algodn, medio de cultivo lquido, glucosa, antibiticos, jeringas, agujas
para jeringas, suero, prtesis. Por qu?

5. Diferencie entre agente BACTERICIDA y BACTERIOSTTICO.

6. Qu es la pasteurizacin? En qu alimento/s se realiza este tipo de control

microbiano?

7. Cul es la importancia de la esterilizacin del material de ciruga en una sala

de operaciones de un hospital?

8. Por qu es esencial la dilucin del alcohol para que sea efectivo como agente
desinfectante? Y la lavandina?

21