Universidad Mayor de San Simn

Facultad de Ciencias y Tecnologa

Departamento de Qumica

GUIA DE LABORATORIO DE
INTRODUCCIN A LA INGENIERA
BIOQUMICA

Cochabamba - Bolivia

0
 LABORATORIO DE INTRODUCCIN A LA INGENIERA BIOQUMICA

El experimento permite desarrollar procesos y habilidades como, la observacin, la manipulacin,

indagacin, la clasificacin, prediccin, asimilacin, la reflexin, y el cuestionamiento alrededor de los
problemas que la cotidianidad nos presenta. Estas habilidades se desarrollan y se hacen parte importante
del experimentador solo cuando se convierten en un acto vivencial para l y el experimento es la
herramienta ms adecuada para conseguir este propsito.

La biotecnologa aplicada es una alternativa muy significativa para la diversificacin de los procesos y la
generacin de nuevos productos. Es conocido que los procesos biotecnolgicos tienen gran difusin y
aceptacin en la mayora de los pases desarrollados, sin embargo no ocurre lo mismo en nuestro pas, en
el que apenas se incursiona tmidamente. Por este motivo, se considera necesario fundamentar y acelerar
la investigacin en biotecnologas con aplicacin en procesos industriales y en este sentido y con este fin
se desarrollo la materia de LABORATORIO DE INTRODUCCIN A LA INGENIERIA
BIOQUMICA.

Cronograma de Actividades

10 Semana

12 Semana

13 Semana

14 Semana
11 Semana
1 Semana

2 Semana

3 Semana

4 Semana

5 Semana

6 Semana

7 Semana

8 Semana

9 Semana
Actividad

Microscopia y Observacin
de Microorganismos

Aislamiento y Cultivo de
Microorganismos

Poder Fermentativo

1er Parcial

Fermentacin Alcohlica

Elaboracin de la
Cerveza

Fermentacin Lctica

Biomasa

2do Parcial

NORMAS Y CUIDADOS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

1
Cuando se trabaja en el laboratorio es necesario, ser cuidadoso, buen observador, obrar con cautela, todo
en bien de realizar un trabajo ms eficiente y evitar accidentes. Con este fin se proponen las siguientes
normas:

El experimentador debe leerlas cuidadosamente, preguntar, si no son claras y luego interiorizarlas

de tal forma que las tenga en cuenta de manera automtica y voluntaria durante las prcticas de
laboratorio.

Use guardapolvo de laboratorio (bata), guantes desechables y lentes de seguridad cuando trabaje
con sustancias peligrosas, trasiegos, pelado de materia prima y cuando realice las prcticas.

Coloque ropa, mochilas y dems cosas en el lugar dispuesto en el laboratorio.

El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al

terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.

Limpie o desinfecte la superficie del mesn al inicio y fin de la prctica; ya que se trabajara con
microorganismos y fermentos.

Tenga cuidado con el uso del mechero, reconocer la posicin de cerrado o abierto.

Antes de utilizar un compuesto fjese en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y
de los posibles riesgos de su manipulacin. Consulte previamente con el docente auxiliar.

No devuelva nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar
con el docente o el auxiliar.

No toque con las manos y menos con la boca los productos qumicos.

No pipetee nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba de goma.

Abra las cajas de Petrie, tubos de ensayo u otros recipientes que contengan medio o cultivos el
menor tiempo posible y cerca del mechero para evitar contaminacin.

Identifique y marque los recipientes con medios de cultivo en uso con fecha, abreviatura del
medio de cultivo, nmero o nombre del grupo.

Maneje tcnicamente el microscopio si no sabe hacerlo pida a su docente o auxiliar las

instrucciones pertinentes.

Informe al docente, en caso de accidente, para tomar las medidas necesarias.

Entregue al auxiliar de laboratorio los materiales empleados durante la prctica.

2
 Deje el saln en perfecto orden y aseo. Disponga en el sitio de desecho el material contaminado
para ser inactivado antes de ser lavado, y el resto de material orgnico sobrante llvelo al lugar
indicado por el docente.

No coma, ni beba ningn tipo de alimento dentro del laboratorio.

No guarde materiales o reactivos dentro de los bolsillos del guardapolvo.

FORMATO DE PRESENTACIN DEL INFORME

Todo informe es individual, se presentara a la siguiente clase de haber terminado la prctica, muy bien
puede ser realizado a mano en computadora y se evaluara sobre cien puntos segn el siguiente criterio
de ponderacin:

TITULO DE LA PRCTICA

1. INTRODUCCIN... 5 pts.
2. OBJETIVOS............. 5 pts.
2.1. Objetivo General
2.2. Objetivos Especficos
3. MARCO TERICO.... 10 pts.
4. MATERIALES Y REACTIVOS.................................................................................... 10 pts.
4.1. Materiales
4.2. Reactivos
4.3. Equipos

5. METODOLOGA.... 10 pts.
6. RESULTADOS 15 pts.
7. OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES.... 15 pts.
7.1. Observaciones
7.2. Conclusiones
8. CUESTIONARIO.... 30 pts.
TOTAL 100 pts.

El docente auxiliar explicara detalladamente cada punto del informe, para una mejor
compresin y realizacin del informe por parte del estudiante

Practica #1 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

3
 MICROSCOPIA Y OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

Introduccin:

La invencin de los aparatos de ptica, el telescopio y el microscopio a finales del siglo XVI y principios
del XVII, han contribuido a modificar la concepcin que el hombre tena de mundo. Con el primero se
comenz a sondear la profundidad del cosmos y con el segundo, el mundo de lo infinitamente pequeo.
El microscopio permite observar objetos no visibles para nuestros ojos y es el instrumento de mayor uso
en el laboratorio. Mediante un sistema de lentes e iluminacin, se puede aumentar el tamao de la imagen
de 40 a 1000 veces. Y por ende se puede observar microorganismos a diferentes aumentos. Un
microorganismo, tambin llamado microbio, es un ser vivo que slo puede visualizarse con el
microscopio, aunque la mayora son microorganismos inofensivos, los hay tambin infecciosos. stos
se pueden multiplicar en el cuerpo y causar enfermedades o dolencias.

Marco Terico:

4
 Definicin de Microscopia Definicin de microbiologa
Tipos de Microscopios Clasificacin de Microorganismos
Partes de un Microscopio Microbiologa Industrial
Sistema mecnico Beneficios de los microorganismos
Sistema ptico Perjuicios de los microorganismos
Sistema de iluminacin Usos industriales de microorganismos

Metodologa:

1) Reconocimiento de un Microscopio ptico

Identifique las partes del microscopio con la ayuda del docente del auxiliar.

2) Preparacin
de las Muestras

Se preparara en
los portaobjetos
muestras de yogurt,
fermentos y
mohos de pan. Su
finalidad es conocer los
tres tipos de

microorganismos que utilizaremos en las practicas (bacteria, levaduras y mohos).

Previo a preparar las muestras, se debe tener prendido el mechero de alcohol, los portaobjetos y
cubreobjetos limpios encima de una franela; y tener al alcance el asa y la punta.

Se esteriliza al fuego del mechero el asa, agitamos un poco para que enfri, introducimos al
recipiente que contiene la muestra, ya sea el yogurt o fermento, sin tocar las paredes.

Extraemos el asa y colocamos una gotita al medio del portaobjetos, lo recomendable es colocar
unas gotas de agua estril inicialmente, para que la muestra no se encuentra muy concentrada y se
pueda observar el microorganismo, en este caso el asa con la muestra se homogeniza en el agua

Seguidamente colocar el cubreobjetos a una

altura no mayor de 1 cm. (Siempre se debe
agarrar el cubreobjetos de los extremos y
nunca de las esquinas)

Para preparar una muestra solida, en este

caso moho de pan.
 Esterilizamos el asa, donde haya mayor presencia de moho, se frota suavemente sin presionar
hasta tener una buena cantidad de hongo en el asa.

Una vez que el hongo este en el asa, lo apoyamos en el portaobjetos y con un gotero, goteamos
agua estril (que penetra por capilaridad en caso que se haya cubierto con el cubre) y el moho se
quedara ah y procedemos a homogenizar.

Inmediatamente cubrimos con el cubreobjetos teniendo el cuidado de no formas burbujas de aire.

Todos estos pasos se deben realizar entre el mechero y el operario, evitando en lo posible de
contaminar la muestra..

3) Observacin de las muestras en el Microscopio

Coloque el objetivo al de menor aumento (4x) en posicin de empleo y baje la platina

completamente, coloque una de las preparaciones sobre la platina sujetndola con las pinzas
metlicas.

Comenzar la observacin con el objetivo de 4x o colocar el de 10 aumentos (10x) si la

preparacin es de bacterias.

Para realizar el enfoque:

Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo

micromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o
ambos.

Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la

preparacin con el micromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el
micromtrico hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con
mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino.

Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operacin.

El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran
dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y
mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo
de inmersin.

1
 Desde el paso cinco se debe hacer para cada uno de los montajes, realizar la descripcin y los
dibujos de cada muestra de forma detallada.

Resultados:

a) Dibujar y describir las levaduras, en un fermento espontaneo, notar las diferentes formas que se
van sucediendo en todo el proceso fermentativo, al principio unas clulas en forma de limn
(apculadas) a medida que el procesos avanza aparecen otras en forma globosa, a veces
alargadas y otras en forma elptica.

4x10 40x10 100x10

Descripcin: Descripcin: Descripcin:

b) Dibujar y describir las bacterias en una muestra de yogurt, observar las dos formas, las de forma
de bacilos y los cocos

4x10 40x10 100x10

Descripcin: Descripcin: Descripcin:

c) Dibujar y describir a los hongos, como se dijo en muestra de pan, se debe tener mucho cuidado
con este tipo de microorganismo, recurdese son productores de muchas enfermedades de la piel.

2
 4x10 40x10 100x10
Descripcin: Descripcin: Descripcin:

Practica #2 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Introduccin:

Los microorganismos estn presentes en todos lados, y no es excepcin alguna que estas estn
involucradas en la formacin de productos fermentados como la cerveza, vinos, quesos, yogurt, etc.
Como as tambin causantes de muchas enfermedades y desperdicios provocada por los microorganismos.

Nosotros trabajaremos con microorganismos industriales, est practica aislaremos levaduras, claro que en
la caja petri crecern varios otros tipos de microorganismos, para un ojo de experiencia, puede distinguir
por las colonias que tipo de microorganismo es.

Es por ello la necesidad de aislar y desarrollar microorganismos especficos, ya sea para fermentacin de
cerveza, vinos, productos lcteos, como as tambin para el rea de salud como la penicilina, entre otras
ms.

Marco Terico:

Crecimiento Microbiano Concepto de Cultivo Puro

Cultivo de de microorganismos Factores fsicos y qumicos que influyen
Medios de cultivo en el crecimiento
Mtodos de Aislamiento Mtodos de conteo

3
 Mtodos de conservacin Caractersticas de las Levaduras
Microorganismos aerbicos Caractersticas de las colonias de las
Microorganismos anaerbicos levaduras

Metodologa:

1) Preparacin del Mosto

Seleccionar una fruta (durazno, uva, frutilla, otros). Preferentemente que la fruta este sana y
fresca.

Estrujar la fruta en su totalidad, es decir junto con su cascara y sus semillas, y colocar en un frasco
de vidrio limpio.

Tapar con algodn la boca del frasco y dejar fermentar por 72 horas mnimamente.

2) Preparacin de Medios de Cultivo en Cajas Petrie

El agar malta se trata de un medio cuya fuente de carbono es el extracto de malta, recomendado
para el aislamiento de levaduras y hongos, sirve para la identificacin selectiva de algunas cepas
de levaduras.

Preparar el agar segn la cantidad requerida previo a los clculos realizados en las cajas petrie y
tubos de ensayo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

Cada caja petrie recibe un promedio de 20 ml 0,5 cm de espesor, y cada tubo de ensayo recibe
9ml del agar.

Previo a ello esterilizar en autoclave todo el material de vidrio que se usara: cajas petries, tubos de
ensayo, pipetas y otros materiales a usar envueltas en papel madera preferentemente.

Fig. 1
Una vez preparada la solucin de agar que se utilizara, se esteriliza en autoclave previo al
preparado de los medios. (Fig.1)

El mismo paso se prosigue en los tubos, echndole 6 ml y tapndolo con algodn, una vez
esterilizado se lo inclina para su solidificacin. (Fig.2)

4
 Fig. 2
3) Sembrado

Previo al sembrado en las placas se prepara diluciones del mosto virgen, en 5 tubos de ensayo que
contienen 9 ml de Suero Ringer. (Fig. 3)

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Fig. 3
Con una pipeta graduada se extrae 1ml del mosto virgen (10-1) y se trasvasa al tubo 10-2 , se mezcla
homogneamente y se extrae 1ml para despus trasvasar al 10-3 y as sucesivamente.

Para hacer un sembrado por extensin, en una caja petrie ya con el agar solidificado y esterilizado
se coloca 1ml de la dilucin cualesquiera, seguidamente con el Asa Drigalsky expandir por toda la
placa. (Fig. 4a)

Para hacer un sembrado por versacin, en una caja petrie limpia y esterilizada se coloca 1ml de la
dilucin, seguidamente encima se pone el agar malta, se la tapa y se gira suavemente para
solidificar. (Fig. 4b)

Una vez terminado el proceso de siembra, se lleva a la mufla a temperatura de 27C.

Fig. 4
a

5
4) Crecimiento y Seleccin de Levaduras

Pasada 48 horas despus del sembrado en las cajas petries, seleccionamos e identificamos las
posibles colonias definidas de levaduras, seleccionamos mximo 4 colonias por caja petrie.

Observar el crecimiento, la morfologa, la coloracin, caractersticas, etc y diferenciarlas de un

hongo u otro agente externo o contaminante.

A las 72 horas del sembrado, colocar las cajas petrie, en la congeladora para evitar la
confrontacin y contaminacin de las colonias.

Realizar todas las observaciones por un mximo de cinco das y realizar el conteo y determinar las
Unidades Formadoras de Colonias. [UFc]

5) Aislamiento de Levaduras

Una vez seleccionada las cuatro colonias definidas posibles levaduras, se procede a aislar en tubos
de ensayo que contienen el agar solidificado en forma de pico de flauta.

Con un asa de aguja picamos la colonia y sembramos por estra en el tubo ya con el agar
solidificado e inclinado y lo tapamos con algodn previamente esterilizado al fuego. (Fig 5)

Fig. 5

6) Confirmacin de levaduras por microscopia

Se selecciona dos tubos segn la coloracin de indicador del medio que se utilizo.

Se procede de la misma manera de la Prctica #1 los incisos 2 y 3. Es decir mediante microscopia

identificar las posibles levaduras.

Resultados:

a) Realizar los clculos para el preparado del agar para los medios en las cajas petrie y tubos de
ensayo.

b) Realizar los clculos para el preparado del suero Ringer al 2% para las diluciones en los tubos.
6
 c) Calcular las UFc presentes en las cajas petries.

UFc
N de colonias Factor de Dilucin
g de muestra

d) Dibujar, describir y detallar todo lo que observo por el microscopio.

Practica #3 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

PODER FERMENTATIVO

Introduccin:

Se entiende por poder fermentativo o poder alcoholgeno la capacidad que tienen las levaduras para
producir alcohol , por tanto, corresponde al mximo porcentaje de etanol que una levadura es capaz de
producir al fermentar un mosto estril con exceso de azcares, graduacin Brix igual o superior a 24
Brix. El poder fermentativo es la medida del porcentaje (v/v) de etanol que una cepa de levadura es
capaz de producir y paralelamente estudiar la cintica fermentativa.

Los grados Brix (smbolo Bx) miden el cociente total de sacarosa disuelta en un lquido. Por ejemplo una
solucin de 25 Bx tiene 25g sacarosa por 100 g de la solucin.

Marco Terico:

Definicin de levadura Flora Blastomictica

Fisiologa de levaduras Fermentacin espontanea
Criterios de seleccin de una levadura Poder Fermentativo
Ciclo de crecimiento de poblaciones de Cintica fermentativa
levadura Biotecnologa de las fermentaciones
Estudios de Mller-Thurgau alcohlicas

Metodologia:

1) Preparacion del mosto de uva

Obtener uvas enteras, maduras, sanas y limpias y sobre todo que estn frescas, aproximadamente
Kg. de uva luego procedemos a estrujarlas de forma suave, importante saber que las semillas
deben de quedar enteras.

Con una tela filtrante limpia y planchada, filtrar 250 ml de la uva estrujada a un recipiente limpio
y seco.

7
 Medir los grados Brix iniciales del mosto obtenido con un refractmetro. [C1]

Hacer los clculo necesarios para agregar la cantidad de azucar para el mosto, con tal de tener
una concentracin entre 23 - 25 Bx. [C2]

Pasar a un matraz Erlenmeyer de 200 ml exactamente 100 ml del mosto.

Se tapa con algodn limpio y se lo esteriliza en autoclave a 121C y 1,2 atm por 15 minutos.

2) Siembra de una levadura en el mosto esteril (Metodo Gravimetrico del Microvinificador)

OJO: previo a esta parte de la practica, se debe tener seleccionada una levadura joven, obtenida en la
practica #2.

Con una asa de aguja esterilizada se pica la levadura y se procede a la inoculacion dentro el
matraz esterilizado una vez que se enfrio el mosto. Trabajar alrededor de la flama del mechero.

Tras la inoculacion, se sustituye el tapon de algodn por una valvula Mller que contiene acido
sulfurico concentrado que evita la entrada de oxigeno y permite la salida de CO 2. Previamente la
valvula debemos esterilizar a vapor de agua.

Pesar el matraz [M0] una vez asegurada la valvula Mller y pesar cada 24 horas a 30C, es decir a
la misma hora cada dia, hasta que se alcance un peso constante [Mf] usando la misma balanza.

Resultados:
OJO: Una vez terminada la prueba, es decir, que el microvinificador dejo de liberar CO 2 y el peso sea constante, se
procede a realizar varias determinaciones.

a) Anotar la concentracion inicial del mosto [C1] y realizar los calculos necesarios para obtener un
mosto aproximado de 24Bx aproximadamente [C1].

b) Determinacin del pH.

Determinar el pH0, es decir el pH del mosto antes del autoclavado.

Determinar el pHf, es decir el pH del mosto inoculado una vez que dejo de liberar CO2
Con ambos datos corroboramos que en el proceso fermentativo se producen acidos.

c) Determinacin del poder fermentativo

Para poder fermentativo se debe tener la masa inicial y la masa final del matraz con su valvula
Mller.

PF M f M 0 2,5

8
 Donde:
PF Poder Fermentativo expresado en % [v/v] de Etanol
M 0 Peso inicial del matraz junto con la valvula de Mller en [g]
M f Peso final del matraz junto con la valvula de Mller en [g]
2,5 Factor que sale de la estequiometria de la reaccion

d) Determinacin de alcohol (metodo picnometrico)

Se toma 50 ml del fermento en un matraz aforado de 50 ml.

Se tranfiere el contenido del matraz aforado al balon de destilacion, se enjuaga el matraz aforado
con dos porciones de 5 ml de agua destilada, incorporandola al balon de destilacion.

Se efectua la destilacion, recogiendo 35 ml del destilado. Seguidamente se la enrasa a 50 ml con

agua destilada.

Determinar la densidad relativa del alcohol mediante el metodo del picnometro:

M Picnometro Alcohol M Picnometro
relativa
C

M Picnometro Agua M Picnometro
Una vez obtenido la densidad relativa del alcohol y la temperatura ambiente, se determina el
% [v/v] de etanol mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura, Tablas Windsord.

e) Determinacion de azucar residual (azucar reductores)

El residuo de la destilacion, aproximadamente 15 ml, lo enrasamos con agua destilada en un

matras aforado de 50 ml.

Y con el refractometro medimos los grados Brix, con este dato determinamos azucar residual del
mosto.

a) Determinacion de Acidez Total (la acidez valorable se utiliza durante las operaciones de
elaboracin y acabadopara normalizar los vinos y para descubrir alteraciones indeseables debidas
a bacterias, fermentos, etc.)

Primeramente colocamos 200 ml de agua recientemente hervida en un matraz Erlenmeyer,

neutralizamso est agua, colocando unas gotas de fenoftaleina y valorando con NaOH 0,1 N
seguidamente colocamos 5 ml del fermentado y homogenizamos.
0
Procedemos a titular con NaOH 0,1N hasta que se de el cambio de color ligeramente rosado.
1
0
Calculamos el %Acidez Total: Rango permitido = 0,5 g/100ml en Ac. Actico. 2
0
3
0
60
% Ac.Total V NaOH C NaOH 100 4
0
V M 1000 5
0
Donde:
% Ac.Total en g/100ml Acido Actico

9
 V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ]
C NaOH Concentracion del NaOH [ N ]
V M Volumen de la muestra[ml ]
b) Determinacion de Acidez Volatil (se debe a los acidos grasos presentes, como formico, acetico,

butirico,etc. Una acidez alta indica presencia de microorganismos danios)

Se utiliza el equipo de destilacion diseado

para el efecto, es decir por arrastre de vapor.

Se coloca 10 ml del fermento en el tubo Sellier,

y el agua del balon debe hervir.

Una vez que hierva dicha agua, se cierra la

valvula de escape y se forza a que el vapor
entra en el tubo de Sellier.

Se debe obtener 60 ml aproximadamente del

destilado y pasar a un matraz Erlenmeyer y
agregar 4 gotas de indicador fenoltaleina.

Se procede a titular con NaOH 0,1N hasta que vire de color ligeramente rosado.

60
% Ac. Acetico V NaOH C NaOH 100
V M 1000

Rango permitido = 0,12 g/100ml Ac. Actico

f) Calculo de la Cintica Fermentativa (graficar en papel milimetrado)

Para determinar cinetica fermentativa se debe pesar el matraz cada 24 horas hasta que el peso
sea constante a 30C, lo cual nos indica que ya no esta liberando CO 2 y completamos la
siguiente tabla.

Peso Tiempo
[g] [horas]
Prdida de peso [g]

Tiempo [hrs]
10
Curvas de cinetica fermentativa de las cepas para su comparacion y analisis cualitativo de
resultados:

a. Correcta
b. Rapida
c. Con problemas de acabado
d. Con problemas de arranque

11
Practica #4 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

FERMENTACIN ALCOHLICA

Es algo lmpido y no es agua,

Es algo fluido y no es aire,
Es una luz sin fuego
Y un espritu sin cuerpo
Introduccin:

En la fermentacin alcohlica, los azcares, fructosa, glucosa y sacarosa, son transformados, por
levaduras fermentativas del gnero Saccharomyces, en un gran nmero de componentes bioqumicos,
entre los que destaca el etanol y el gas carbnico como productos mayoritarios.
Segn gay Lussac se tiene:

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir degradan los azcares de forma
incompleta generando etanol, CO2 y energa. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan
solo 1 g de levadura por cada 100 g de azcares consumidos.

Las levaduras han sido utilizadas para la produccin de etanol. Saccharomyces Cerevisiae es la levadura
ms comnmente utilizada. El etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las
levaduras es crtica para obtener rendimientos altos.

Marco Terico:

Fermentacin alcohlica Procesos metablicos aerbicos

Bioqumica de la fermentacin Procesos de fermentacin y asimilacin
Factores que influyen en la fermentacin Definicin de Enologa
Productos secundarios de la fermentacin Microbiologa de fermentaciones vnicas
Fermentacin Malolctica Fermentacin espontanea
Procesos metablicos anaerbicos Sustratos: Sulfatizacin

Metodologa:

NOTA : No es recomendable utilizar para la prctica frutas tales como: mango, papaya, guanbana, guayaba,
etc; ya que estas tienen mucho muclago y son muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentacin.
Se sugiere utilizar frutas tales como: mora, uva, pia, maracuy, naranja, manzana, frutilla, durazno entre otras.
Caso contrario consultar con el docente o el auxiliar, como manejar esas frutas, recurdese todo es posible.

Elaboracin de Sidra Vino

1) Preparado del Pie de Cuba

12
 Sin importar que fruta sea la que escogi, se procede a: lavar, pelar y trozar en cubitos. En caso
que la fruta tuviera semillas se los separa de la pulpa.

El trozado de la fruta se coloca en una licuadora, en est operacin se aumenta agua para su
molienda y se corrige con azcar el contenido final de brix, hasta que se tenga un jugo
aproximadamente de 3 litros.

Se filtra el jugo de la fruta a un recipiente y se mide la cantidad de azcar que contiene el mosto,
si es necesario una correccin le agregamos azcar hasta obtener entre 21Brix o un poco ms
para vino y 16Brix o un poco ms para sidras. Se coloca entre 20 y 30 ppm de SO 2 como
inhibidor de enzimas y posibles contaminaciones.

Una vez obtenido el mosto de la fruta y con los Bx corregidos, trasvasamos los 3,5 litros al
botelln de vidrio. (Botelln verde de vino seco)

Procedemos a inocular con la levadura ya seleccionada de la tercera prctica, caso contrario una
levadura comercial, teniendo en cuenta el procedimiento que se debe hacer para evitar la
contaminacin.

Una vez terminada la inoculacin de la levadura, tapamos el botelln con algodn limpio y
estril.

2) Trasiegos

Pasada los primeros 3 das de fermentacin del pie de cuba, se procede al primer trasiego.

Usando una manguera de goma y una varilla de vidrio, se la introduce con cuidado por la boca
del botelln hasta partes del contenido teniendo el cuidado de no levantar el precipitado
(borras de fermentacin) que se formo en la base.

Del otro extremo de la manguera aspiramos hasta que fluya el fermento, a otro botelln limpio y
seco.

Una vez extrado todo el lquido lmpido y sin burbujeos al botelln, extraemos 10 ml del
fermento a un vaso de precipitado y lo llevamos a ebullicin del 50% del volumen total del
mosto.

Una vez que ebullo aproximadamente el 50% del volumen extrado, lo enrasamos con agua
destilada a 10ml y procedemos a leer los grados Brix con el refractmetro.

Consultando con el docente el auxiliar, se agregara los siguientes reactivos, segn la

concentracin de Bx del pie de cuba:
Sulfitos Urea Fosfatos
Brix
[ppm] % [p/v] % [p/v]
>6 100 0,15 0,1

13
 <5 150 0,10 --

Pasado los 3 das siguientes, se procede con el segundo trasiego, y se procede con los mismos
pasos mencionados anteriormente.

Una vez que el pie de cuba nos de menor a 5 Bx, se pasara a la siguiente etapa del proceso.

Se coloca una dosis de 150 ppm de SO2 con el objeto de estabilizar tempranamente el fermento.

3) Clarificado

Una vez terminada el ultimo trasiego y nos de menor a 5 Bx, se le agregara bentonita 0,7g/L.

La bentonita se preparara con 24 horas de anticipacin, se calcula la cantidad requerida para el

fermento, y se la mezcla con agua potable en una relacin de 1:10 de su peso agregndole agua.

Pasada las 24 horas del preparado de la bentonita, se notara que la bentonita se hincho, se le
agrega al pie de cuba despus de haber realizado el ultimo trasiego.

Se deja actuar a la bentonita por 24 horas y despus se procede a filtrar el mosto clarificado, y se
agrega nuevamente SO2 100ppm.

Despus se procede a verificar su estabilidad, realizando controles de calidad.

Recurdese que en est etapa se distingue un vino de una sidra, los vinos deben tener ms de 11
de alcohol y las sidras menores a 8 GL.

Se debe tener cuidado con la estabilidad de las sidras, es conveniente que se pasteurice o de lo
contrario se sulfite convenientemente.

Resultados: (Ya sea para la sidra para el vino, son los mismos clculos realizados en la Practica #3)

a) Determinacin de Acidez Total y Acidez Voltil.

60
% Ac.Total V NaOH C NaOH 100
V M 1000

Donde:
% Ac. Acetico g/100 mlde Acido Acetico
V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ]
C NaOH Concentracin del NaOH [ N ]
V M Volumen de la muestra[ml ]

14
Rango permitido = 0,5 g/100ml Acidez total Rango permitido = 0,12 g/100ml Acidez voltil

b) Determinacin del Grado Alcohlico (Mtodo del Picnmetro)

Una vez obtenido la densidad del alcohol y la temperatura del ambiente, se determina el Grado
Alcoholico [GL] mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura. (Tablas de
Windsord)

M Picnometro Alcohol M Picnometro

TAmb M Picnometro Agua M Picnometro

c) Determinacin de Sulfito Total (se usa este antisptico que est como bisulfito HSO-3 o sulfito
SO-23 o mejor SO2 , que reacciona con el acetaldehdo, glucosa, fenoles a este SO2 se lo llama
sulfito total y al resto sulfito libre)

Para su determinacin es necesario hidrolizar con un lcali fuerte y despus acidulando y

valorando directamente, es el procedimiento de Ripper.

Se toma 20 ml del fermento y 25 ml de NaOH 1 N, se vierten en matraz Erlenmeyer de 250 ml,

se mezclan se tapa el matraz y se deja 10 min, para lograr la hidrlisis.

Luego se le agrega 5 ml de almidn y 10 ml de Ac. Sulfrico 1:3, se valora rpidamente con

disolucin de yodo 0,02N hasta coloracin azulada.

V I 2 C I 2 32 1000
SO2 Total
V Muestra
SO2 Total mg / L ppm
V I 2 Volumen de la titulacion gastada [ml ]
C I 2 Concentracion de I2 N
V Muestra Volumen de la muestra [ml ]
Rango permitido=300-350ppm

d) Determinacin de Sulfitos Libres

Primero se acidula para reducir la oxidacin de los polifenoles por el yodo y despus se valora con
el yodo, hasta el punto final, con almidn como indicador.
Se toma 50 ml de la muestra del fermento y se introduce a un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

Se adiciona 5 ml de almidn como indicador, 5 ml de Ac. Sulfrico 1:3 , rpidamente se valora el

acido sulfuroso libre con yodo 0,02 N.

El punto final es el primer oscurecimiento azulado persistente durante la valoracin.

V I 2 C I 2 32 1000
SO2 Total
V Muestra
SO 2 Libre mg / L ppm
V I 2 Volumen de la titulacion gastada [ml ]
C I 2 Concentracion de I2 N
15

V Muestra Volumen de la muestra [ml ]

 Rango permitido=20-30ppm

e) Determinacin de Azcar Residual.

El residuo de la destilacion, aproximadamente 15 ml, lo enrasamos con agua destilada en un

matras aforado de 50 ml.

Y con el refractometro medimos los grados Brix, con este dato determinamos azucar residual del
mosto.

f) Propiedades organolpticas.

Desde el momento que se prepara el pie de cuba, se debe degustar el mosto y anotar los cambios que
suceden en cada trasiego hasta el producto final:

Propiedades Pie de
1er Trasiego 2do Trasiego 3er Trasiego Producto Final
Organolpticas Cuba

Olor
Sabor
Textura
Color
Brillo
Aspecto
Aroma
Grados Brix

Practica #5 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

ELABORACIN DE LA CERVEZA

Introduccin:

La cerveza es una bebida alcohlica, no destilada, de sabor amargo que se fabrica con granos de cebada u
otros cereales cuyo almidn, una vez modificado, es fermentado en agua y frecuentemente aromatizado
con lpulo. De ella se conocen mltiples variantes con una amplia gama de matices debidos a las
diferentes formas de elaboracin y a los ingredientes utilizados. Generalmente presenta un color ambarino
con tonos que van del amarillo oro al negro pasando los marrones rojizos. Se la considera "gaseosa"
(contiene CO2 disuelto en saturacin que se manifiesta en forma de burbujas a la presin ambiente) y
suele estar coronada de una espuma ms o menos persistente. Su aspecto puede ser cristalino o turbio.

16
Marco Terico:

La malta El lpulo
La cebada El agua, su papel principal
Bioqumica de la Germinacin de la Tipos de Cerveza
Cebada Calidad de la cerveza

Metodologa:

a) Germinacin

Seleccin del grano: este proceso es delicado ya que debe observarse con sumo cuidado que los
granos tengan una textura homognea, cualquier defecto afecta a la estabilidad del producto
final.

Remojado del grano: se pone a remojar el cereal en diferentes ciclos de remojo llegando a
reblandecer e hinchar el grano por la absorcin del agua.

Lavar la cebada de 3 aguas para eliminar partculas de tierra presentes en la misma.

Remojar la cebada (24 horas), colocar el agua al nivel de la cebada en un recipiente de

plstico, vidrio acero inoxidable.

Colocar NaOH al 0.1% durante 6 horas, luego cambiar el agua por otra hasta completar
las 24 horas.

La cebada tiene que tener aproximadamente 50% de humedad en donde el embrin se

pone activo para la posterior germinacin.

La cebada se coloca en un embase de plstico, vidrio acero inoxidable en una forma

rectangular una altura de 15cm cada da, rociar con agua y remover para mantener la
humedad y facilitar la germinacin.
En los siguientes das se realiza la misma operacin disminuyendo la altura 5cm, hasta
tener una altura mxima de 5cm donde comenzara la germinacin.

Germinado: en este momento de los granos sale un diminuto brote verde (plmula y la radcula)
de unos centmetros de longitud, en este momento (previo a la aparicin de la raz), la planta
emite un enzima que convierte el almidn en azcar para alimentarse, en este justo instante se
interrumpe el germinado (secado). El proceso se hace siempre removiendo para que la
germinacin sea homognea en todos los granos, esta fase suele durar unos das. El grano
empieza a germinar el a 1 el tamao de las raicillas y 3 veces el tamao del grano, ah se para
la germinacin.

17
 Secado del grano: se seca el grano con el objeto detener la germinacin, se lo puede realizar en
un horno a una temperatura de 80C al sol. Posteriormente se realiza la trituracin del grano
germinado con unos rodillos concntricos (batan) sin deshacer la cascarilla.
b) Cocimiento

Lista de adjuntos para un volumen aproximado de 1,9 L

Malta (se usa de tres tipos) 250g

Lpulo (dos tipos) tenemos pelles inicio 0.11g

Lpulo antes de hervir 0.32g

Yeso 0.11g

Acido fosforito 0.3 ml

Sal 0.06g

Arrocillo 43g

Azcar 19g

La sacarificacin (conversin del almidn en maltosa y dextrinas) se llevara a cabo segn el

siguiente temple de cocimiento.

10 min 15 min 20 min 15 min 15 min

45C 50C 62C 70C 75C

Se debe tener el agua limpia y pura a 45C, en ese momento se coloca la malta, se agita y se va
colocando los adjuntos, el lpulo se divide en dos, en todo momento a medida que se va
cumpliendo los tiempos y temperaturas se debe ir agitando (la subida de una temperatura a otra
es de 0,5 a 1 C/min.

A la temperatura de 62C se hace la prueba del almidn (conversin) terminado el tiempo

sealado (debe ser caf claro, en caso de ser oscuro o azul, indicativo que tiene almidn sin
conversin) o en caso se deja unos 10 min ms.

Cuando se finaliza se debe controlar los grados Brix, lo deseable es de 10 a 12 (recuerde que
usted decide su grado alcohlico que va tener su cerveza), aqu se puede aadir de azcar ms, o
en caso empezar con un poco ms de malta (una cantidad ms elevada le dar un mejor
cuerpo, todo lo sealado aqu es aproximado, la practica hace al maestro.

La segunda parte del lpulo se coloca a los 75C (la industria tiene olla de presin donde se
produce una extraccin alta de los cidos alfa).

18
 Cuando se termina el proceso se filtra, con ayuda de un cedazo se forma la capa filtrante
formada por la cascarilla, lo aconsejable es que los primeros filtrados retornen nuevamente a la
filtracin.
c) Fermentacin del Mosto

Terminado este proceso se enfra hasta 30 a 35C, se airea y se coloca la levadura, la proporcin
es de una cucharilla para todo este volumen. Se tapa el recipiente con algodn y se deja
fermentar segn el tiempo indicado por el docente o auxiliar.

Resultados:

a) Determinacin de Acidez Total

60
% Ac.Total V NaOH C NaOH 100
V M 1000
Donde:

% Ac. Acetico g / 100ml de Acido Acetico

V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ]
C NaOH Concentracin del NaOH [ N ]
V M Volumen de la muestra[ml ]
60 Factor del equivalente del acido mayoritario
b) Determinacin del grado alcohlico GL
Una vez obtenido la densidad del alcohol y la temperatura del ambiente, se determina el Grado
Alcoholico [GL] mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura. (Tablas de
Windsord)

M Picnometro Alcohol M Picnometro

TAmb M Picnometro Agua M Picnometro

Practica #6 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

FERMENTACIN LCTICA

Introduccin:

La fermentacin lctica es aquella que se lleva a cabo por las bacterias cido lctica cuya actividad se
desarrolla en ausencia de oxgeno (anaerobiosis), y se manifiesta en la transformacin de los azcares
presentes en el vegetal, en cido lctico, etanol y dixido de carbono.

Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas), hongos, algunos protozoos y en
los tejidos animales; en efecto, la fermentacin lctica tambin se verifica en el tejido muscular cuando, a
causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportacin adecuada de oxgeno que permita el

19
desarrollo de la respiracin aerbica. El acido lctico es un compuesto incoloro compuestos de formula
CH3CHOHCOOH. Se da bajo formas ptimamente activas, dextrgira y levgira, frecuentemente
denominados acido D-Lctico y acido L-Lctico. En su estado natural es una mezcla ptimamente
inactiva compuesta por agentes iguales de ambas formas D y L, conocida como mezcla racemica.

Marco Terico:

Fermentacin Lctica Proceso de fermentacin acido lctica

Ventajas y desventajas de la F. Lctica Factores que influyen en la F. Lctica
Fermentacin Homolctica Glucolisis
Fermentacin Heterolctica Productos que se obtienen de la F.
Rutas metablicas Lctica

Metodologa:

Elaboracin de Yogurt Saborizado

1) Recepcin
Para el efecto, se requerir 3 litros de leche recin ordeada y fresca.

Previo a la elaboracin se debe analizar su estado organolptico y fisicoqumico, teniendo en cuenta

primordialmente que la leche tenga un grado de acidez bajo y formacin de coagulo.

Estabilidad frente al agregado de alcohol - Test del alcohol

Colocar 1 ml de leche en un tubo de ensayos y agregar igual volumen de etanol 70%. Agitar
y observar si coagula.

Acidez en la Leche

Medir exactamente 20 ml de muestra y colocar en un Erlenmeyer de 250 ml.

Diluir con aproximadamente 2 veces su volumen con agua destilada.

Agregar 6 gotas de fenolftalena al 1%, y titular con NaOH 0,1N hasta color rosa dbil pero
persistente durante 30seg. Expresar los resultados en % en cido lctico [p/p]

2) Filtracin

Una vez que la leche haya pasado satisfactoriamente los anlisis de estado de conservacin, se
prepara una tela blanca, lavada, enjuagada con abundante agua, preferentemente planchada.

Se filtra toda la leche a un recipiente limpio y seco, la cual retendr todos los residuos
contaminantes provenientes del ordeo de la vaca. Es indispensable realizar esta operacin ya que
las partculas como pelos, bosta, mosquitos, residuos vegetales entre otros residuos pueden
deteriorar nuestro producto.

20
 Despus del filtrado se debe agregar azcar blanca refinada (no es azcar en polvo) en una relacin
de 90 g/L.

3) Pasteurizado

Utilizando una olla de acero inoxidable o aluminio, la leche filtrada se calienta hasta una
temperatura de 85 C durante 10 minutos.

Es recomendable que la leche se mantenga a esta temperatura en forma constante, porque a

temperaturas mayores, se desnaturalizan las protenas y bajan la calidad del producto terminado y
temperaturas menores no eliminan la carga bacteriana y el producto se deteriora por contaminacin
microbiana.

4) Enfriamiento

Una vez concluida el pasteurizado, 10 min. a temperatura constante, se procede a realizar el choque
trmico a travs de un bao Mara.

Llevamos la olla a otro recipiente ms grande, que contiene agua fra, y bajamos la temperatura de
la leche a 45 C.

Esto con el fin de hacer un descenso rpido de la temperatura y evitar que se desarrollen de nuevo
las bacterias que sobrevivieron finalmente despus de la pasteurizacin.

5) Inoculacin
La leche esta a una temperatura ambiente de 40 a 45 C que es la temperatura en que se desarrollan
ptimamente las enzimas del cultivo de yogurt.

Adicionamos a la leche la cantidad de cultivo necesario para que esta se fermente dando como
resultado las caractersticas de aroma, sabor y textura propias del yogurt.

Para adicionarlo correctamente debes diluirlo en un poquito de leche hasta deshacerlo

completamente y luego homogenizar en la totalidad de la leche.
6) Incubacin
Esta operacin consiste en mantener la mezcla anterior a una temperatura promedio de 40 a 45 C.

Durante 3 a 4 horas. Transcurrido este tiempo se observa la coagulacin del producto adquiriendo la
consistencia de flan.

7) Adicin de aditivos

Transcurrido el tiempo, se corta suavemente el proceso de incubacin.

21
 Agregar el saborizante del agrado que desee moviendo suavemente, teniendo en cuenta la relacin
que indique el envase, caso contrario consultar con el docente auxiliar.

Resultados:

a) Propiedades organolpticas de la leche

Degustar la leche antes del proceso de elaboracin y el yogurt en si, llenar el siguiente cuadro:

Propiedades Organolpticas Leche fresca Yogurt

Olor
Sabor
Textura
Color
Aspecto
Aroma
Presencia de sedimento

b) Estabilidad frente al agregado de alcohol - Test del alcohol

Verificar si el coagulado sale negativo o positivo

Estabilidad de la Leche =

c) Acidez en la Leche
VNaOH C NaOH 9
% Ac. Lctico
VMuestra

Rango permitido= 0,16% Ac. Lctico

Practica #7 Lab. Introduccin a la Ing. Bioqumica

PRODUCCION DE BIOMASA

Introduccin:

Las protenas, grasas, carbohidratos, minerales y vitaminas son una fuente de materia y energa,
asimilables por el hombre y los animales a travs del consumo de alimentos.

Las protenas son polmeros biolgicos de alto peso molecular conformados por 20 residuos de
aminocidos y dos amidas de aminocidos di carboxlicos (asparagina y glutamina).. su importancia est
en las funciones que desempea en el organismo vivo. Estas protenas contenidas en la racin alimentaria
suministran el nitrgeno y los aminocidos esenciales necesarios al organismo para la sntesis de las
22
sustancias proteicas y otros compuestos nitrogenados. Entre los aminocidos fisiolgicamente
importantes, 8 en el adulto y 9 en el nio deben hallarse contenidos en los alimentos, pues el ser humano
es incapaz de sintetizarlos.

En la actualidad se estn desarrollando varios mtodos de obtencin de las llamadas protenas

unicelulares (biomasa), utilizando varios tipos de microorganismos y medios de cultivos diferentes o usos
de derivados residuos de origen agrcola o industrial.

Con el manejo adecuado de la biomasa, industrias grandes vieron por conveniente comercializar este
producto (recurdese que estos microorganismos tiene un determinado ciclo de vida) para uso en
animales, por el alto contenido de aminocidos.

Marco Terico:

Definiciones Preparacin del sustrato

Usos de la biomasa Condiciones de Asimilacin
Produccin de levaduras y bacterias Separacin de biomasa
forrajeras

Metodologa:

Los requerimientos de la clula son grandes, respecto a materia y energa se pueden utilizar varios
medios, como melazas, hidrolizados de almidn o excedentes frutcolas.

El medio de cultivo para nuestro estudio ser el pltano.

1) Preparacin

Se tomara unos 50 g de pltano en 400 ml de agua, se licuara y se filtrara, se dosificara con sulfato
de amonio en un rango de 1,5 % y se autoclavara, en caso que el mosto no sea limpio, se filtrara
nuevamente las gomas producidas y se esterilizara.

2) Inoculacin

Se utilizara, una levadura comercial, lo ideal sera usar la especia Candida (alto rendimiento en
biomasa), el uso est por los 2 g/L, el control del pH es importante debe estar entre 4 y 5, se
corrige con Ac. Ctrico 1 N y NaOH 1 N.

3) Fermentacin aerbica

Se utilizara un Seiker con una revolucin de aproximadamente 180 rpm y una temperatura de 25-
30C, el tiempo es de 24 hrs.

Resultado:

Controles de calidad:
Se realizara lo siguiente: azucares iniciales, azucares residuales a horarios de 8 hrs o a convenir
con el horario de uso de laboratorio.

Procedimiento
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 Del mosto inicial se tomara solo unas gotas para la lectura con el refractmetro, teniendo el
cuidado de no contaminar el medio, se utilizara una varilla de vidrio estril y se trabajara con un
mechero, en las diferentes horas, se tomara por lo menos 5 ml con pipeta estril y se llevara a una
centrifuga de tubos y se tomara unas gotas para la lectura en el refractmetro.

Para el control del crecimiento microbiano, en los mismos tiempos se toma 1 ml de la muestra y se
coloca en la cmara de Neubauer unas gotas. Se tapa con el cubre y se le en 5 cuadrados de 16
cuadrados pequeos, se toma el promedio y se usa la ecuacin.

4000 1000 D
C N Celulas
V 80

C Expresado en celulas/cm3
D dilucin
V volumen de la Muestra

Cuando se termina de fermentar, nos basamos en el consumo de azucares del mosto, lo ideal seria
que lleguemos a rangos de 2Brix.

Al final se proceder a filtrar en papel filtro y a hacer secar la biomasa en una estufa a 100C, y se
evaluara su rendimiento, basndonos en la masa inicial.

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