PRACTICA N 4 _ TECMICA DE TINCION PARA DETERMINAR LA FORMA,

TAMAO Y AGRUPACION CELULAR _COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAN

DE GRAM

I. FUNDAMENTO TEORICO
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin
diferencial empleado en bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre
todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian
Gram (1853-1938), que desarroll la tcnica en 18841. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder realizar una
primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose bacterias
Gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias Gram
negativos a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
Las bacterias normalmente se multiplican por fisin transversal binaria. En
muchas especies, las clulas hijas resultantes de un evento por fision tienden a
dispersarse por separado en medio, debido a la actuacin de las fuerzas fsicas
(movimiento browniano, cizallamiento, corrientes de convencin, etc.)
Esto hace que al observar al microscopio una poblacin de estas bacterias
veamos mayormente clulas aisladas. Pero en algunas especies las clulas hijas
pueden permanecer unidas entre s(al menos durante cierto tiempo tras la
divisin de a que proceden) debido a que al tabique sea incompleto o a la
insistencia de campas mucosas que retienen juntos los productos de la divisin.
La observacin a microscopio de las bacterias nos permite diferencias cuatro
formas bsicas que son:
Cocos: estas son clulas bacterias en forma esfrica que se pueden
agrupar individualmente en parejas (diplococos), formando racimos
irregulares en varios planos de divisin (estafilococos), formando
cadenas (estreptococos) , dos planos perpendiculares (ttradas cuatro
clulas en un plano) o mltiplos tres planos ortogonales (sarcinas
paquetes pequeos).
Bacilos: son clulas en forma de bastn alargado, que a su vez pueden
tener varios aspectos: cilindros, fusiformes, en forma de maza, etc.
 Atendiendo a los tipos de extremos , estos pueden ser: redondeados (los
ms frecuentes) , cuadrados, biselados , afilados y que pueden
presentarse individualmente , en parejas (diplobacilos) , formando
cadenetas (estreptobacilos), bacilos en empalizada o en paquetes de
cigarrillos (debido a giros de 180), dos bacilos en ngulo (en forma de
letra V o L) , varios bacilos formando letras chinas.
Espirilos: al igual que los bacilos tienen un eje ms largo que otro , pero
dicho eje no es recto , sino que sigue una forma de espiral , con una o
ms de una vuelta de hlice generalmente no se agrupan.
Vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen una forma de coma,
pero en el espacio suelen corresponder a una forman en espiral con
menos de una vuelta de hlice.
Otros tipos de formas:
Filamentos, ramificados o no anillos casi cerrados, formas con
prolongaciones (con prostecas).
Estos distintos tipos de morfologa celulares deben de haberse originado
por mecanismos evolutivos, a saber, por seleccin y estabilizacin
adaptiva frente a las distintas presiones ambientales presentes en
diferentes nichos ecolgicos.

La observacin microscpica de las bacterias se facilita cuando han sido coloreadas se

acostumbra a fijar las bacterias en la lmina portaobjetos para poder colorearla con
facilidad. La fijacin puede hacerse con solventes o con calor. En cualquier caso se trata de
hidratar la clula y coagular sus protenas.

Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o compuestas
(diferenciales) cuando se utilizan dos o ms colorantes.

Coloraciones simples: los colorantes sencillos permiten apreciar la forma,

disposicin y tamao relativo de las bacterias y en algunos casos alguna
estructura que tome una coloracin ms oscura, pero no muestran detalles finos
de la estructura interna. Es una solucin del colorante en alcohol o en agua, por
 ejemplo el azul de metileno, nigrosina o tincin negativa, azul de lactofenol,
etc.
La tincin simple puede ser directa para teir la estructura microbiana mientras
el medio permanece sin colorear, y tincin simple indirecta, cuyo objetivo es
teir el entorno que rodea la estructura microbiana mientras esta permanece sin
teir.
La tincin con azul de metilo puede ser til para teir grnulos metacromaticos
(tincin directa).
La tincin negativa permite observar las bacterias con color translucida sobre
un campo oscuro (tincin indirecta).
La tincin de azul de lactofenol es til para la identificacin de estructuras y
esporas de hongos (tincin directa).
Coloraciones diferenciales o compuestas: reciben el nombre tambin de
contraste, y se denominan asi por que se utiliza una mezcla de coloraciones
simples que permiten diferenciar estructuras celulares internas, grupos de
bacterias, etc. En estas coloraciones se utiliza un colorante primario que luego
es removido de algunas clulas o estructuras con una solucin (generalmente
agua o alcohol), posteriormente se aplica el colorante secundario o de contraste.

El mtodo permite distinguir estructuras inter e intracelulares. Por ejemplo:

La coloracin de Gram (idea por Cristian Gram en 1884) es una coloracin compuesta
porque utiliza un colorante primario (cristal violeta) y otro de contraste (safranina y
fuscina), se llama diferencia porque permite distinguir dos tipos de bacterias segn su
composicin de la pared celular, las bacterias Gram positivas quedan teidas de color
violeta y la Gram negativas de color rojo,se utiliza el lugol (solucin de yodo)para formar
un complejo cristal violeta yodo que es ms grande que los poros de las bacterias Gram
positivas (por la presencia de pectidoglucano en grandes cantidades presentan poros ms
pequeos) como para ser arrastrado al aplicar la solucin de alcohol acetona que desintegra
la gram cantidad de liquidos presentes en las paredes de las bacterias Gram negativas
deshidratndolas y haciendo que los poros de estas permanezcan lo suficientemente
abiertos como para adquirir el colorante de contraste (y de hecho que son ms grandes por
la baja concentracin de pectidoglucano) y observarse de color rojo.

Coloracion de esporas: esta coloracin ayuda a identificar la presencia de esporas

(tpicas de los generos Bacillus sp. y Clostridium sp.)en el interior de la celula y
distuinguir su forma y ubicacin. Utiliza un colorante primario el verde de malaquita y
uno de contraste , la safranina o fuscina.

Coloracin de capsulas: permite identificar la presencia o ausencia de una estructura

externa que envuelve a algunas bacterias como por ejemplo de genero Klebsiella sp.
Utiliza un colorante primario, la tinta china y otro de contraste safranina o fuscina.

Tincin para bacilos acido alcohol resistente: permite distinguir dos grupos de bacterias
unas que se decoloran al aplicar soluciones acidas y otrasn que no se decoloran. esta
tcnica utiliza una solucin de fuscina fenicada de Ziehl Nielseen como colorante
primario la cual se aplica sobre el frotis y se somete al calentamiento por cinco minutos
sin dejar secar el colorante, posteriormente se lava con agua destilada varias veces y se
decolora con alcohol acido por 20 segundos, se lava nuevamente con agua destilada y
se aplica el colorante de contraste azul de metileno dejndolo actuar por 30 segundos y
lavando nuevamente con agua destilada. De esta manera los bacilos resistentes al
alcohol acido se tien de rojo y los no resistentes toman el color azul. La diferencia en
la coloracin no se debe a reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared
celular sino a la estructura fsica de la misma. Los microrganismos pertenecientes al
gnero Mycobacterium sp. Son caractersticos alcohol acido resistentes

Tincin de flagelos: permite observar los flagelos bacterianos con la ayuda de un

mordiente especial (dos soluciones)que los hace ms gruesos y por lo tanto visibles al
microscopio ptico.

Los colorantes acidos tien los componentes bsicos de la celula, por ejemplo la
nigrosina
Los colorantes bsicos tien componentes acidos de la celula, por ejemplo: azul de
metilen , cristal violeta, safranina,fuscina y el verde malaquita.
 II. OBJETIVOS
Practicar algunos mtodos de coloracin bacterianas
Observar al microscopio algunas formas bacterianas
Describir las caractersticas de las diferentes formas observadas
Adquirir destreza en la prelacin de frotis bacterianos

III. MATERIALES Y METODOS

Cultivos bacterianos
Porta y cubre objetos
Asa bacteriolgica metalica
Mechero
Colorantes bsicos
Aceites de inmersin
Lugol
Alcohol _acetona
Microscopio
Papel absorbente
Pinzas de madera

Procedimiento

Elaboracin del frotis: hacer un extendido a partir de un cultivo bacteriano en un

portaobjetos al cual se le a adicionado una gota de solucin salina o agua destilada.
Para ello tome el asa y esterilcela al rojo y luego de enfriar toma una pequea
 nuestra de una colonia y diluyada en la gota de agua destilada o solucin salina
homogeneizando muy bien para obtener una pelcula fina.
Fijar la preparacin exponiendo el porta objetos rpidamente a la llama el mechero
evitando un excesivo calentamiento. Despus de este procedimiento las bacterias
quedan fijas y listas para la aplicacin del colorante.
Coloque el portaobjetos sobre la parrilla de coloracin.
Cubre el extendido con una pequea cantidad de azul de metileno y djelo actuar
por un minuto.
Lave con agua hasta eliminar el exceso del colorante.
Seque la preparacin al aire o al mechero
Examine las preparaciones teidas al microscopio, con lente de inmersin.
COLORACION DE GRAM
Repite los tres pasos anteriores
Cubra el extendido con cristal violeta. Djelo actuar por 1 o2 minutos.
Lave el exceso de colorante con un chorro de agua suave
Cubra el extendido con lugol (solucin de yodo), durante 1 o 1 . este acta como
un mordiente formando el complejo CV-1
Lave con agua
Cubra el extendido con safranina , djelo actuar durante 15 a 30 segundos
Lave con agua , seque y observe al microscopio con lente de inmersin
IV. RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Microorganismo: bacterias

Aumento del objetivo: 100

Aumento del ocular: 10

Aumento total: 1000

Agrupacin: cocos

Tincin: coloracin simple

V. CONCLUCIONES Y RECOMENDACIN
Para poder conocer los detalles morfolgicos de las bacterias es necesario
recurrir a tcnicas de coloracin. Los colorantes empleados pueden ser
naturales o sintticos.
las formas de coloracin muestran las diferentes formas, tamaos y
aspectos de las colonias va a servir como un dato para la clasificacin de la
bacteria
La forma de una bacteria como organismo individual viene dada por la
rigidez de su pared. Es igualmente una caracterstica de cada tipo
bacteriano. Las bacterias suelen adoptar fundamentalmente alguna de las
formas siguientes: esfrica, cilndrica, helicoidal, filamentosa o formas
intermedias de los casos anteriores.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecn
ologia/practico4.pdf
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicr
o/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf
https://biologialiga.files.wordpress.com/2008/08/bacteria2010.pdf
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.
pdf
http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&
view=article&id=35&Itemid=50
 https://ocw.ehu.eus/pluginfile.php/9499/mod_resource/content/1/tecnica
smol/tema1pdf.pdf

ANEXOS :