ENZIMOINMUNOANLISIS

El enzimainmunoanlisis (EIA) es una metodologa que permite cuantificar anticuerpos o

antgenos en muy baja concentracin (menos de 1 ng/ml) en la mayora de los lquidos
biolgicos y sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha usado ampliamente en el estudio de
la respuesta de anticuerpos frente antgenos complejos. En el laboratorio de inmunologa se
utiliza corrientemente para detectar y cuantificar autoanticuerpos y diversas protenas e
inmunoglobulinas en baja concentracin en los lquidos biolgicos. Los EIA pueden ser
clasificados en dos tipos: homogneo y heterogneo.

ENZIMOINMUNOANLISIS HETEROGNEO.

Mediante la reaccin indicadora la actividad enzimtica asociada al complejo Antgeno-

Anticuerpo, para la cual es necesario eliminar previamente del medio de reaccin la enzima
(unida al conjunto) no asociada al complejo, y en definitiva con la concentracin del
componente en estudio.

En este sistema la reaccin antgeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador

enzimtico. Requiere la separacin de las fracciones ligadas y libres resultantes de la
reaccin inmunolgica. En esta modalidad, los reactivos son los anticuerpos y el antigeno
marcado con la enzima.

FUNDAMENTO:

El antgeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de forma que

cuanto mayor sea la cantidad de antgeno presente en la muestra problema, mayor cantidad
de antgeno marcado con l, la enzima quedara sin unirse al anticuerpo. En este caso la
actividad de la enzima no se anula por la unin de antgeno anticuerpos.

Se separa los complejos antgeno-anticuerpo (marcado y no marcado), se aade el sustrato

de la enzima para que se produzca la reaccin enzimtica y se mide su actividad.
 La actividad ser inversamente proporcional a la cantidad de antgeno en la muestra. De
esta forma al aadir el sustrato el producto formado est directamente relacionado.
Ventajas:

Menos interferencias, mas especificas y sensibles.

Instrumentacin menos costosa.

Admite mayor tamao de muestra, as disminuye el lmite de detencin.

Ms verstiles en cuanto al tipo de analto.

Desventajas:

Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio etanol en fro o PEG.

Unin de la forma unida a una fase slida (EIA, partculas magnticas).
Centrifugacin.

ENZIMOINMUNOANLISIS HOMOGNEO.

Este ensayo no requiere la separacin de las fracciones ligadas y libres resultantes de la

reaccin inmunolgica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antgeno marcado
con la enzima. Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la
marcada por la enzima.

Cuando el antgeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al
centro activo de la enzima, por lo que anula su actividad.
A mayor concentracin de la molcula problema, menor cantidad de antgeno marcado
se unir al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antgeno libre con la enzima activa dando
una mayor actividad.
En resumen, a mayor concentracin mayor actividad, sin necesidad de separar las
fracciones.

FUNDAMENTO

Consiste en utilizar una enzima o conjugado tal que su propia incorporacin al complejo
antgeno-anticuerpo lleve asociada una modificacin (activacin o inhibicin) de la
actividad enzimtica ya sea porque se produzca un impedimento fsico para el posterior
acceso del sustrato al centro activo de la enzima, ya sea por un cambio conformacional en
esta. El caso es que la modificacin sea proporcional a la cantidad de complejo formado y,
por tanto la medida de la actividad enzimtica en el medio de reaccin indicar la
concentracin del componente problema sin necesidad de separar previamente el conjugado
no unido.

Normalmente el EIA homogneo se utiliza principalmente para la medicin de

componentes de baja masa molar (haptenos), ya que esta tcnica, para que la unin del
Anticuerpo al conjugado impida el acceso del sustrato hasta el centro activo de la enzima,
es preciso que el hueco que quede entre el anticuerpo y la enzima sea pequeo, por lo cual
ocurre si esta se encuentra unida a una pequea molcula de hapteno. Por este motivo el
sistema homogneo ha sido tradicionalmente aplicado en el laboratorio clnico solo para
componentes de baja masa molar, tales como medicamentos y hormonas, si bien el avance
tecnolgico ha permitido la aplicacin de este principio a la medicin de la concentracin
de macromolculas.

La ausencia de la etapa de separacin en el EIA homogneo presenta como principal

ventaja que los mtodos pueden ser fcilmente adaptados a los analizadores habitualmente
utilizados en el laboratorio clnico que los mtodos EIA heterogneos que requieren
analizadores especiales para ellos.

La ausencia de la etapa de separacin el en EIA homogneo puede suponer tambin un

inconveniente, ya que los componentes de la matriz del espcimen estarn presentes
durante el proceso, pudiendo interferir en la reaccin inmunolgica o en le enzimtica,
disminuyendo la detectabilidad. Este efecto puede producirse midiendo la actividad
enzimtica mediante mltiples lecturas.

La mayora de los EIA homogneo son rpidos y sencillos de realizar y se adaptan muy
bien a la automatizacin; inicialmente fueron diseados para la detencin de molculas de
bajo peso molecular como hormonas y drogas, en actualidad se utilizan para molculas ms
complejas como protenas.

Ventajas:

Ms preciso.
Son ms rpido y sencillos de realizar.
Ms utilizados en drogas de abuso y monitoreo de frmacos que se adaptan a la
automatizacin.
 Sin pasos de separacin no se requiere la separacin del antigeno unido del no unido.
Pueden desarrollarse anlisis sensibles por el efecto de amplificacin de las enzimas.
Los reactivos son relativamente baratos y alcanzan una larga vida media de
conservacin.
Pueden desarrollarse mltiples anlisis simultneamente
Se pueden realizar una amplia variedad de configuraciones analticas.
El equipo utilizado es relativamente barato y accesible.
No hay riesgos de radiacin durante el marcado ni en la eliminacin de los productos
de desecho.

Desventajas:

Son mas costosos en reactivos.

En general solo sirven para frmacos.
Los anlisis homogneos alcanzan actualmente una sensibilidad no es tan elevada
con la que se consigue con los radioinmunoanlisis
Aunque se han desarrollado EIA homogneos para grandes molculas proteicas, es
necesario emplear en ellos reactivos inmunoqumicos complejos

TCNICAS DE UNIN COMPETITIVAS:

EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique)

Fue el primer tipo de EIA homogneo desarrollado, en esta tcnica la unin del ligando
marcado con la enzima al anticuerpo origina un cambio en la actividad de la enzima, el cual
generalmente consiste en una disminucin de la misma. Aunque se piensa q en la mayora
de estos casos la inhibicin de la enzima es debida a un impedimento estrico que bloquea
fsicamente el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, la inhibicin de ciertas
enzimas puede ser debida a cambios conformacionales inducidos en esta por la unin de
anticuerpos.
Cuando mayor es la concentracin del ligando problema en el espcimen, mayor es la
concentracin del ligando marcado no unido al anticuerpo en el medio de reaccin ,
aumentando simultneamente la actividad cataltica en el mismo. La mxima activida
cataltica se alcanza cuando todo el ligando marcado se encuentra en forma libre (no
unido al anticuerpo), o todo el anticuerpo esta unido al ligando presente en el espcimen.

ECIA

En esta tcnica el producto de una reaccin enzimtica es canalizado o dirigido

directamente hacia una segunda enzima, para la que acta como sustrato; y se basa
precisamente en que la velocidad de esta reaccin ocupada es mayor si estas dos
enzimas estn coinmovilizadas que si estn separadas en la solucin.

TCNICAS DE UNIN NO COMPETITIVAS:

EEIA

Esta tcnica es til para medir anticuerpos y antgenos polivalentes y evita la necesidad
de disponer de antgenos marcados. Consiste bsicamente en que una cantidad limitada
de anticuerpos marcados con una enzima (B -galactosidasa) y un exceso de anticuerpo
sucinilado (cargado negativamente) forma un complejo antgeno-anticuerpo con
el ligando antignico polivalente presente en el espcimen la enzima unida al complejo
transforma un sustrato en producto que, en este ambiente cargado negativamente, queda
insolubilizado formando una segunda fase.
EIA homogneo con anticuerpos bioespecficos.

En esta tcnica se realizan anticuerpos bioespecficos, en los cuales la parte de

anticuerpo especfico contra el antgeno problema se combina con la parte especfica
contra un inhibidor de la enzima. As una vez unido el componente problema, el
centro del anticuerpo biespecfico donde se une el inhibidor de la enzima. Asi una vez
unido el componente problema, el centro del anticuerpo bioespecfico donde se une
el inhibidor de la enzima es entonces directamente proporcional ala concentracin del
antgeno en el espcimen. El intervalo de medida y fexibilidad pueden aunmentarse
reduciendo la flexibilidad de los anticuerpos hibridos en la regin bisgra por
modificacin qumica.
EIA homogneo con sustratos insolubles.
 En esta tcnica el anticuerpo especfico contra el antgeno problema se une
covalentemente a la enzima (como la alfa- amilasa o dextrano) que actan sobre
sustratos insolubles de masa molar muy elevada. De esta forma se ha conseguido
detectar la presencia de antgenos en el espcimen. Cuando estos antgenos se unen a
su anticuerpo, se impide el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, por lo que
la formacin del producyo es inversamente proporcional a la concentracin del antgeno
en el espcimen. Para aumentar el impedimento estrico y eliminar las interferencias
debidas a factores reumatoides, en vez de unir a la enzima molculas de IgG
completas, se han unido fragmentos Fab. Algunas protenas no ferritinas y la alfa-
fetoproteina, han sido medidas con xito mediante procedimientos basados en esta
tcnica, habindose detectado concentraciones de hasta 8 y 20 ug/L respectivamente.
Enzimas y sustratos utilizados en EIA.

Puesto que la calidad de los mtodos EIA dependen en gran medida de las enzimas
utilizadas, estas han de cumplir ciertos requisitos para que puedan ser utilizadas como
marcadores. La actividad cataltica es medida bsicamente mediante la medida
espectromtrica, fluorimtrica o luminimetrica del producto formado. Aunque las
fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rbano pueden ser medidas con mayor
detectabilidad por fluorimtria y luminomtria que es espectrometra, el lmite de
deteccin global del EIA disminuye solo de 2 a 10 veces como mximo. A pesar de
ello, la medida espectromtrica del producto es, salvo excepciones, el mtodo de
deteccin ms frecuente para EIA.

INTERFERENCIAS COMUNES:

Interferencia exgenas:

En estas estn interferencias debidas a la preparacin, la recogida y la conservacin

del espcimen. Las interferencias debidas a las diferentes matrices de los calibradores
utiloizados y de los especmenes problemas.

Las interferencias debidas a los cambios en las propiedades de la superficie de plstico

originados por la unin de protenas u otras molculas, puduedo alterarse el tipo,
la cantidad o estabilidad de estas uniones.

Tambin son interferentes exgenos las ocasionadas por la saturacin incompleta de

los centros de unin al anticuerpo (o el antgeno) especfico en la fase slida, lo que
puede favorecer la unin de otros reactivos que minimicen o eliminen tales uniones.
 Interferencias endgenas:
Espcimen hiperlipdico: su efecto puede ser reducido o minimizado mediante la
dilucin del mismo. Presencia de anticuerpos heterfilos: (anticuerpos humanos contra
inmunoglobulinas animales utilizadas en la reaccin) cuando en un mtodo se
utilizan anticuerpos (heterfilos) contra inmunoglobulinas de ratn (tras la
mordedura, o despus del tratamiento con anticuerpos monoclonales, por ejemplo),
estos pueden reaccionan contra anticuerpos monoclonales empleados en aquella
tcnica, originando una interferencia endgena. Esta reaccin puede ser minimizada
aadiendo suero de la especie animal en cuestin al medio de reaccin. As, puede
observarse la composicin de algunos reactivos a base de anticuerpos monoclonales
la presencia de una cantidad adicional de inmunoglobulinas de ratn.

CONCLUSIONES
 El enzimoinmunoanlisis (EIA), est conformado por aquellas reacciones
serolgicas que utilizan conjugados enzimticos, para poder visualizar la reaccin
Antgeno-Anticuerpo. Se basa en la deteccin de un antgeno o anticuerpo inmovilizado
sobre una fase slida que mediante sus formas complementarias, directa o
indirectamente producen una reaccin cuyo producto, por ejemplo un colorante,
puede ser medido espectrofotomtricamente.
La EIA utiliza las propiedades catalticas de las enzimas para detectar y
cuantificar las reacciones inmunolgicas. Una sola molcula de enzima puede
catalizar la conversin de millones de molculas de sustrato en millones de
molculas en productos. Esta capacidad de amplificacin hace posible detectar la
presencia de una pequea cantidad de enzimas y, como consecuencia, de pequeas
cantidades de los complejos marcados formados. Consta de dos etapas: en la primera
etapa se produce la reaccin del antigeno y el anticuerpo marcado. En la segunda etapa
se aade el sustrato y se termina la actividad enzimtica de la enzima marcadora.
Para determinar las actividades de las enzimas marcadoras pueden utilizarse
diversos sustratos. Inicialmente, se utilizaron sustratos de las enzimas que producan
compuestos medibles fotomtricamente. Sin embargo, en los ltimos aos se estn
utilizando sustratos que dan compuestos fluorescentes o luminescentes, lo que a
incrementado la sensibilidad de prueba.

Esta tcnica es de gran importancia ya que utiliza las propiedades catalticas de

las enzimas para detectar y cuantificar las reacciones inmunolgicas para el diagnstico
de diversas enfermedades.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Fuentes, A. (1998). Bioquimica clnica y patologa molecular [libro en lnea].

Consultado el 10 de septiembre de 2011en:
http://books.google.com.mx/books?id=cKGyh_81v-
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J. M. Gonzlez de Buitrago. 1998. Bioqumica Clnica. Editorial McGraw-Hill.
Interpanamericana.
Grabar P. y Burton P. 1968 Immunoelectrophoresis. Toray S.A. Barcelona.