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Biosntesis de Protenas I

c. Nucleicos y replicacin
A. Glavic
/08/17
Unidad bsica de los cidos nucleicos: un nucletido, contiene base
nitrogenada unida por el carbono 1 a una azcar de 6 carbonos, en el
carbono 5 est unido un grupo fosfato. En los trifosfatos hay tres
grupos fosfatos unidos. Cada nucletido est unido al siguiente a travs
de un enlace fosfodister.

ARN: tiene grupo OH en el 2 C, el ADN no lo tiene.

Polimerizacin de nucletidos: presencia de grupo OH en el 3 y el


grupo fosfato en el 5.

Las molculas se escriben desde el 5 al 3: relacin con el grupo fosfato.

Bases nitrogenadas

anillos heterocclicos. Son anillos resonantes, con una nube pi que hace
que las molculas sean relativamente planas. El hecho de que sean
resonantes y tengas los hidrgenos permite el enlazamiento de las
hebras.
- Pirimidinas: un anillo. Timina, Citosina, Uracilo
- purinas: dos anillos. Adenina y Guanina
Es sencillo transportar citosina en timina (importante en mutaciones)

Nuclesido: base+azcar
nucletido: base + azcar + fosfato: sal en el ph fisiolgico.

Grupo OH del carbono 2: muy reactivo. ARN ms inestable que el


ADN.

Fosfato beta: difosfato

En las reacciones enzimticas de fosforilacin, donde se transfiere un grupo fosfato: el que se


transfiere es el gamma si el nucletido es un trifosfato, o beta si el nucletido es un difosfato.

ADN: el fosfato que queda constituyendo la cadena es el fosfato alfa, los otros dos son eliminados
en la polimerizacin.

Polimerizacin: adicin de nuevos nucletidos en la elongacin de la cadena.

Bases nitrogenadas: son capaces de interactuar con los fotones de longitudes ultravioleta
(260nm).
Existe una polaridad. El extremo 5 queda un grupo fosfato libre, mientras que en el 3 queda
un OH libre, que es esencial para la adicin del siguiente nucletido entrante.
53 independiente de la cadena en que se hable.
Las protenas se escriben amino carboxiterminal
Avery, Mcleod, Mcarty (1944): Demostr que el ADN es el constituyente que es capaz de
entregar todas las caractersticas de un organismo. Letalidad de la infeccin de una bacteria
en un ratn. Tenan dos tipos de cepas de la misma bacteria (una virulenta y otra no). Tomar
las virulentas pero muertas, se inyectaron y el ratn sobrevivi. Si se combina estas
virulentas muertas con no virulentas, lo que ocurre, es que ahora la mezcla de bacterias es
capaz de matar a los ratones. Lo que se transfiere de la bacteria muerta a la viva, es el ADN,
para transformar las no virulentas en virulentas. Con DNAasa. El DNA es el material
gentico.
Hershey, Chase (1952): DNA material que permite construir a los organismos. Se utilizaron
bacteriofagos (virus capaces de infectar las bacterias). Unos se produjeron con fosfato
radioactivo y otros con azufre radioactivo. El fosfato es un constituyente de los ac. Nucleicos
(material gentico radiactivo). En el caso del azufre eran las protenas de la cpside las
radioactivas. Se tomaron bacterias no radioactivas y se inyectaron con ambos fagos. Solo
fueron radiactivas las que se inyectaron con fosfato. Las protenas no eran las encargadas
de producir nuevos fagos, si no que el cido nucleico.
Transformacin: incorporacin de un DNA en una bacteria. Los mtodos de
transformacin son qumicos y fsicos (electroporacin, genera poros en la superficie de la
bacteria, a travs de ellos se incorpora DNA de al medio)
Transfeccion: equivalente de transformacin para eucariontes. Incorporacin de un
material gentico en el citoplasma, en el ncleo. Mtodos qumicos (lipofeccion, toma el
material gentico, lo engloba en una vescula de lpidos y la vescula cuando entra en
contacto con la clula, se abre e ingresa el material a la clula) y mtodos fsicos como la
electroporacin.
Con virus: En vez de usar vesculas con un DNA, un virus fue construido con un DNA que
uno quiere ingresar a la clula eucarionte y que la clula exprese.
Transgnesis: incorporacin en el genoma de un organismo multicelular de una
construccin particular. DNA bacteriano, de otro organismo, etc
DNA: polmero de nucletidos que se organiza de manera antiparalela. Direccionalidades
opuestas: una hebra tiene una composicin diferente a la otra y su secuencia difieren
53.
Regla de chargaff: % de adenina es equivalente al % de timina y el % de guanina es
equivalente al % de citosina. Propio de cada especie. Todos los tejidos de vaca tienen un %
que es igual para todas las vacas. Complementariedad excluyente.
Adenina=Timina
GuaninaCitosina
Puentes de hidrogeno: estabilizan la hebra de DNA. Organismos que viven en condiciones
de alta temperatura tienen ms citosina y guanina.
Todas las clulas (excepto gametos) tienen el mismo material gentico, la composicin
adenina-timina y guanina-citosina es la misma para todas las clulas. Hay clulas (inmune)
generan rearreglos del genoma que son distintos en las distintas clulas.
La informacin del genoma no es solo la informacin contenida en la secuencia de
nucletidos. Hay modificaciones que sufre el DNA que agrega informacin en trminos del
genoma.
Hebra DNA: Crick, Watson, Wilkins y Franklin.
Cada hebra puede servir de templado.
Borde de la hebra: azcar + fosfato
interior: bases apareadas.
La doble hlice es una hebra dextrgira que tiene un surco mayor y otro
menos, relacionado con el espacio que queda en posicin a las bases y es el
surco mayor donde interactan protenas que lean, por ejemplo, factores de
transcripcin. En eucariontes el DNA est asociado a histonas que forman un
nucleosoma, la asociacin es electroesttica, interactan con los fosfatos de
la cadena.
36 A en una vuelta completa. Hay 10 nucletidos por vuelta completa. La
distancia entre base nitrogenada es de 3,4 A.
La repulsin/interaccin de las nubes electrnicas de las BN
contiguas: torsin de la hebra.
DNA cambia su configuracin por la cantidad de iones y agua
presente.
Forma B: mas abundante.
No son totalmente planas las bases nitrogenadas: tienen un Angulo
en la orientacin de la doble hlice, no estn totalmente en 90,
tienen una torsin.
Forma Z: gira en el otro sentido. Formada por
condiciones de metales. Cierta secuencia de
nucletidos tambin tiende a formar cristales de este
tipo.
sugar pucker conformation: como se dispone un
carbono dentro del anillo de la pentosa.
glycosyl bond conformation: enlace del carbono 1
endo: hacia dentro de la estructura del nucletido. El carbono 2 esta apuntando hacia
dentro de la conformacin de la molcula.
Secuencias:
Palindrome: hay dos ejes de simetra.
invertido repetido: un eje de simetro. Secuencia sobre la misma
hebra, hay una copia exacta en el sentido opuesto.
Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especificas
(palindrome)
Hay un equilibrio entre las dos configuraciones. Depende de la
temperatura, etc.
En la estructuracin como doble hlice, las interacciones
atpicas juegan un papel fundamental son: apareamiento entre
las bases nitrogenadas y las interacciones a partir de las nubes
electrnicas.
Enlace fosfodister: covalente. Requieren mas energa para
ser roto.
Apareamiento de las bases: puentes de hidrogeno. No
covalentes. Tienen distintas energias.
Equilibrio entre hebra y hebra desnaturada. Depende de la
ruptura y formacin de los puentes de hidrogeno. La forma en que
se rompan puede ser entregar energa (T) o entregar energa de
forma entrpica (ingresar molculas como urea).
Cuando los nucletidos estn organizados en una hebra de DNA, las bases
estn orientadas en una forma determinada y la capacidad de interactuar
con los fotones es menor. Cuando esta desnaturada, es mayor.
tm: punto medio. Temperatura de desaturacin. El 50% de las molculas
estn como hebra simple.
curva roja: 85C
curva azul: 83C
La composicin de BN es diferente.
Cada organismo tiene una tm particular. (todas las clulas de un mismo
organismo)
Importante para la polimerizacin en cadena. Es necesario en
hebra simple.
Southern blot: analizar secuencias o fragmentos de DNA
northern blot: Analiza secuencias de RNA.
Si uno tiene una muestra de un tipo que contiene ciertas
secuencias de DNA con distintas secuencias. Y uno tiene una
muestra 2 (mezcla compleja de DNA) donde exista
complementariedad se formarn los hbridos. Si uno tiene
marcada una de las dos, uno puede decir si en la otra muestra
existen secuencias de DNA similares a la otra muestra. En
liquido es difcil identificar las hibridadas. (300 pares de bases
suficiente)
Si aumento la temperatura exijo ms al sistema respecto a cuantas
veces deben estar complementando.
Estringencia de hibridacin: Bajo la temperatura para que pueda
aparecer la seal.
(barrido de temperatura) 55-60
Cmo se replica el DNA?
la reaccin de polimerizacin: el 3 OH libre, el oxgeno,
hace un ataque nucleoflico sobre el fosfato alfa,
desplazando a los fosfatos beta y gama de los nucletidos
entrantes, formando el enlace fosfodister. El fosfato
que se libera es de alta energa, no requiere ATP para ser
catalizado, la polimerizacin otorga la energa.
Mtodo secuenciacin Sanger.
Cmo conocer la secuencia, utilizando la complementariedad y polimerizacin?
utilizando nucletidos que carecen del OH en el 3, se va a incorporar en la hebra que est
en polimerizacin, pero carecer del OH para generar la siguiente polimerizacin, se va a
cortar la elongacin de la cadena en ese momento. Si uno tiene un DNA con una secuencia
que desconoce y coloca un partidor y hace reaccionar de sntesis de DNA en presencia de
distintos de dinucletidos, en mezcla, se va a producir extensiones del partidor hasta donde
se encuentre el dinucleotido. Los productos de elongacin que van a detenerse en distintas
posiciones (partidor con marca radioactiva, se forman bandas)
Secuenciador automtico: ocupa nucletidos fluorescentes, se hace en un capilar que
separa los distintos tamaos. Un detector ve la fluorescencia de un tipo u otro.
Replicacin de DNA
Meselson y Stahl (1957): utilizaron el cambio de masa de un isotopo como evidencia del
tipo de replicacin que se produca.
tipos de replicacin:
- conservativa: la hebra original completa es heredada a una clula
- semiconservativo: una hebra es heredada a la clula hija y la otra se sintetiza nueva.
- dispersivo: trozos de cada hebra se van a la clula hija.
Una bacteria crezca con N15, que tenga un DNA pesado, que ser la
parental. Tomamos la bacteria y la movemos a a un medio con N14 y
le damos el tiempo para que replique 1 vez, una generacin de
bacterias nuevas, se extrae el DNA, se ve le gradiente y el DNA se
posiciona en distintas alturas dependiendo del peso. Hay una banda
nica en una posicin ms arriba. Si se espera una generacin ms,
aparece una fraccin en el N14.
conservativa: nunca aparecera la franja intermedia hibrida
dispersivo: cada generacin se ira moviendo a pesos ms ligeros, no
apareciera banda nueva a un peso ms liviano.
Horquillas de replicacin: burbujas en la hebra, que progresa en
ambas direcciones.
Hay una hebra que se sintetiza de forma continua,
que se polimeriza de forma directa, la lectura es e
35 y se agrega 53. En la otra no se puede,
porque se leera 53 y eso hara que la
polimerizacin fuera 35, lo que no es posible.
la hebra tiene que darse una vuelta, se construye a
partir de fragmentos de okazaki.
Para que ocurra una elongacin se necesita:
hebra templado
partidor: otorga 3 OH libre
enzima que catalice la reaccin. DNApolimerasa
Para que ocurre la sntesis es necesario que la hebra se abra,
hebra expuesta para que se produzca el reconocimiento de los
nucletidos y as la entrada de los nucletidos correspondientes.
Mg: disminuyen la densidad electrnica del fosfato para que se
produzca el ataque nucleoflico y se forme el enlace fosfodister.
El sitio cataltico solo permite los apareamientos correctos.
Bajo nivel de error: capacidad del proofreading que es capaz de
sacar nucletidos.
Cada hebra corre por los sitios catalticos asociados a los clamp
que le dan procesividad, que es cunto tiempo va a estar
la enzima asociada con la hebra templado para producir la
elongacin de la hebra que se est sintetizando.
Primasa: sintetiza el partidor. A partir de cada primer se
incorpora un nucletido naciente.
En la hebra lder solo se necesita un primer, en la hebra
retrasada una para cada fragmento de okazaki. Cuando se
sintetizan todos los fragmentos de okazaki, tiene estos
primer RNA y un gap y tiene que ser unido por la enzima
DNAligasa. Hay un fosfato libre. Utiliza ATP para activar al
fosfato. La enzima es conjugada con el nucletido y
transfiere esto al fosfato terminal en el 5 y los electrones
son capaces de hacer el ataque nucletido y se libera el
amp. Antes es necesario quitar el primer.