UNIVERSIDAD TECNOLGICA

DE XICOTEPEC DE JUREZ
Organismo Pblico Descentralizado del Gobierno del Estado de Puebla.

Identificacin taxonmica de levaduras

antagonistas de hongos patgenos en
frutos

MEMORIA DE ESTADA

Para obtener el ttulo de:

TCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO EN QUMICA REA

BIOTECNOLOGA

Presenta:

DORALICIA CALVA CRUZ

Matricula:

140462

Xicotepec de Jurez, Puebla. Agosto 2016.

 DEDICATORIAS

A mi madre que confi en m y me motivo da con da en seguir adelante, nunca

rendirme, que siempre me dio un buen ejemplo y por esforzarse conmigo.

Al Dr. Miguel ngel Plascencia Espinoza por su gua y orientacin pacientemente,

durante mi estancia en el Centro de Investigacin en Biotecnologa Aplicada del
Instituto Politcnico Nacional (CIBA IPN).

A mi asesor de estada interno al M. en C. Luis Eduardo Miranda Domnguez por

poyarme, orientarme y soportarme estos 4 meses, es un muy buen profesor.

A mis maestros de la Universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez que gracias

a todos los conocimientos que me aportaron logre llegar hasta donde estoy. Va por
todos ustedes que se mantuvieron constantes en mi crecimiento educativo.

II
 AGRADECIMIENTOS

Agradezco a:

A Dios por permitirme llegar hasta aqu y concluir con mi trabajo.

Dr. Miguel ngel Plascencia Espinoza por su dedicada atencin y paciencia al

orientarme a realizar el presente proyecto.

Centro de Investigacin en Biotecnologa Aplicada IPN por permitirme realizar el

proyecto dentro de sus laboratorios y por confiarme el material que necesite.

M. C. Luis Eduardo Miranda Domnguez gracias por su perseverancia, sus buenos

consejos sobre cmo mejorar mi proyecto y sobre todo porque es de las pocas
personas que en realidad realizan como se debe su labor dentro de una institucin
escolar.

Mi madre por apoyarme incondicionalmente durante mi estancia.

Compaeros CIBA IPN que me orientaron en las dudas surgidas.

A mis hermanos que me abrieron las puertas de su casa en ese lapso de estancia
en Tlaxcala.

III
A mis amigas de la UTXJ que siempre me apoyaron en demasiadas cosas, me
aguantaron, aceptaron tal y como era y siempre confiaron en mi a: Vernica Reyes
Picasso, Marisol Snchez Urbano, Araceli Ramrez Cuevas y Katia Padilla Galindo,
ustedes cuatro fueron un motor indispensable en la universidad las estimo
demasiado.

De todo corazn muchas gracias, quedare eternamente agradecida con

todos ustedes.

Los quiero mucho:

Doris

IV
El presente proyecto se llev a cabo dentro de los
laboratorios del Centro de Investigacin en Biotecnologa
Aplicada del Instituto Politcnico Nacional (CIBA-IPN)
Tepetitla Tlaxcala Mxico, bajo la direccin del Dr. Miguel
ngel Plascencia Espinoza

V
VI
VII
0
 INDICE

DEDICATORIAS -----------------------------------------------------------------------------II
AGRADECIMIENTOS ----------------------------------------------------------------------III
ABREVIATURAS ----------------------------------------------------------------------------5
GENERALIDADES DE LA EMPRESA ------------------------------------------------7
RESUMEN ------------------------------------------------------------------------------------8
ABSTRACT -----------------------------------------------------------------------------------10
1. INTRODUCCIN -----------------------------------------------------------------------12
2. MARCO TERICO ---------------------------------------------------------------------13
2.1. Control biolgico -------------------------------------------------------------------13
2.2. Antagonismo ------------------------------------------------------------------------14
2.3. Levaduras como agentes de control biolgico------------------------------14
2.4. Propiedades de una levadura de control biolgico------------------------15
2.5. Aislamiento de levaduras antagonistas --------------------------------------18
2.6. Pruebas de confrontacin en placa -------------------------------------------18
2.7. Pruebas de confrontacin in vivo ----------------------------------------------19
2.8. Mecanismo de accin -------------------------------------------------------------20
2.8.1. Antibiosis ---------------------------------------------------------------------20
2.8.2. Colonizacin e inoculo ----------------------------------------------------20
2.8.3. Competencia por nutrientes ---------------------------------------------21
2.8.4. Parasitismo ------------------------------------------------------------------21
2.8.5. Produccin de enzimas lticas ------------------------------------------21
2.8.6. Integracin del biocontrol con otros mtodos------------------------22
3. JUSTIFICACIN -------------------------------------------------------------------------23
4. OBJETIVOS-------------------------------------------------------------------------------24
4.1. Objetivo general --------------------------------------------------------------------24
4.2. Objetivos especficos -------------------------------------------------------------24

1
5. METODOLOGA ------------------------------------------------------------------------25
5.1. Colecta de las muestras. ---------------------------------------------------------25
5.2. Aislamiento de levaduras de la superficie de hojas y fruta---------------25
5.2.1. 1 Microorganismos utilizados--------------------------------------------26
5.3. Determinacin del antagonismo de levaduras in vitro. -------------------27
5.4. Determinacin del antagonismo de levaduras in vivo. -------------------28
5.5. Evaluacin preliminar de Colletotrichum gloeosporioides en frutos---28
5.6. Accin antagnica de levaduras seleccionadas en frutos. --------------29
6. RESULTADOS ---------------------------------------------------------------------------30
6.1. Aislamiento y purificacin de levaduras de la superficie de hojas y
frutas. ---------------------------------------------------------------------------------30
6.2. Influencia de los medios en el crecimiento de Colletotrichum
gloeosporioides---------------------------------------------------------------------32
6.3. Pruebas cuantitativas de antagonismo de levaduras in vitro. ----------33
6.4. Evaluacin preliminar de C. gloeosporioides en frutos. ------------------38
6.5. Efecto de los antagonistas en el desarrollo de la antracnosis en
frutos. ----------------------------------------------------------------------------------39
7. DISCUSIN -------------------------------------------------------------------------------41
8. CONCLUSIN ----------------------------------------------------------------------------42
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS -------------------------------------------------43
10. ANEXOS. -----------------------------------------------------------------------------------49
10.1. Medios de cultivo (cantidades). ------------------------------------------49

2
 INDICE DE FIGURAS

1. Pirmide de la enfermedad. ---------------------------------------------------------13

2. Aislamiento de levaduras de frutos y hojas. -------------------------------------26

3. Total, de levaduras aisladas de hojas. --------------------------------------------30

4. Total, de levaduras aisladas de frutos. --------------------------------------------31

5. Crecimiento del hongo en los medios. --------------------------------------------33

6. Inhibicin in vitro del hongo a T0. --------------------------------------------------34

7. Inhibicin in vitro del hongo a T48. ------------------------------------------------35

8. Inhibicin in vitro del hongo a T96. ------------------------------------------------36

9. Efecto del crecimiento in vitro del hongo por las levaduras. ----------------37

10. Efecto de las levaduras in vitro en el hongo. ------------------------------------38

11. Desarrollo del hongo in vivo. --------------------------------------------------------39

12. Ausencia de lesiones por levaduras. ---------------------------------------------40

3
 INDICE DE CUADROS

A. Levaduras de control biolgico ms analizadas. ---------------------------16

B. Muestras recolectadas. ------------------------------------------------------------25

C. Levaduras aisladas de frutos y hojas. -----------------------------------------31

D. Crecimiento del hongo en los medios de cultivo. ---------------------------32

4
 ABREVIATURAS

C Grados Celcius.

Cn0 Cero microlitros de Caldo nutritivo.

Cn10 Diez microlitros de Caldo nutritivo.

Cn20 Veinte micro litros de Caldo nutritivo.

CO2 Bixido de Carbono

grs Gramos.

D Das

Ha Hectreas.

Hrs Horas.

Primer mtodo de inoculacin de levaduras y C. gloeosporioides en

M1
pruebas in vivo.
Segundo mtodo de inoculacin de levaduras y C. gloeosporioides en
M2
pruebas in vivo.

mg L-1 Miligramos sobre litro.

min Minuto.

ml Mililitro.

mm Milmetro.

N Norte.

P1 Profundidad de 9 milmetros.

P2 Profundidad de 3 milmetros.

pH Potencial de Hidrgeno.

ppm Partes por milln.

5
rpm Revoluciones por minuto.

T0 Cero horas de crecimiento de las levaduras

T48 Cuarenta y ocho horas de crecimiento de las levaduras

T96 Noventa y seis horas de crecimiento de las levaduras

UFC ml-1 Unidades Formadoras de Colonia sobre mililitro.

l Microlitro.

W Oeste.

YMGA Agar, Extracto de Levadura, Extracto de Malta, Glucosa.

YPDA Agar, Extracto de Levadura, Peptona de Casena, Dextrosa.

YPGA Agar, Extracto de Levadura, Peptona de Casena, Glucosa.

PDA Agar Papa Dextrosa.

6
 GENERALIDADES DE LA EMPRESA

El Centro de Investigacin en Biotecnologa Aplicada del Instituto Politcnico

Nacional (CIBA-IPN, Tlaxcala) es un centro de investigacin y posgrado, enfocado
al desarrollo de productos y procesos basados en biotecnologa.

El CIBA busca generar mayor valor econmico, humano y social a las actividades
de produccin agrcola y procesamiento de productos y subproductos del campo,
as como abatir el deterioro ambiental.

7
 RESUMEN

En la actualidad, el control de enfermedades post-cosecha se lleva a cabo mediante

el uso de fungicidas qumicos, sin embargo, dada la creciente preocupacin por el
desarrollo de resistencia por parte de los patgenos, la presencia de residuos
qumicos en los productos, el impacto ambiental que se est generando, hay un
gran inters por parte de productores y comerciantes en utilizar productos alternos
a los fungicidas qumicos, que tengan estndares similares de efectividad y precio.
Una alternativa es el control biolgico, mediante el uso de microorganismos
antagonistas, como lo son las levaduras epifitas de hojas y frutos.

El objetivo de este trabajo fue aislar levaduras de la superficie de diferentes hojas y

frutos, probar su actividad antagnica in vitro e in vivo contra Colletotrichum
gloeosporioides.

En la primera etapa se realiz el aislamiento de mico flora levaduriforme epifita de

diferentes hojas y frutos. La prueba de antagonismo in vitro se realiz mediante
confrontacin en cultivos duales (antagonista-patgeno), las levaduras aisladas
contra C. gloeosporioides, utilizando cuatro diferentes medios de cultivo (PDA,
YPGA, YMGA y YPDA). En base a la formacin de halos de inhibicin, se
seleccionaron 4 cepas (ChF-L8, ChF-L10, CiF-L4 y CaH-L5), las levaduras que
inhibieron en un 100% el crecimiento radial de C. gloeosporioides, en los cuatro
medios de cultivo fueron las cepas denominadas como ChF-L8, ChF-L10, y CaH-
L5, y la cepa CiF-L4 en el medio PDA es donde ejerci mayor efecto de inhibicin
sobre C. gloeosporioides, aunque en el medio YPDA la inhibicin fue de un 83% y
en menor proporcin en los medios YPGA (66%) y YMGA (68%).

En el M2 se inoculo el antagonista y se incubo por 5 d, despus se inoculo el

patgeno, incubando por 24 d, las cepas ChF-L10 mostraron resultados similares
a los obtenidos M1, CiF-L4 tuvo menor crecimiento micelial de C. gloeosporioides
en la herida a diferencia del M1, sin embargo, la cepa CaH-L5 evidencio ser la mejor
al no permitir el crecimiento de C. gloeosporioides en comparacin con el M1 donde
se presentaron lesiones causadas por el patgeno y ChF-L8 el dimetro de la lesin
disminuyo de 1 a 3 cm. Las cepas denominadas como CaH-L5, CiF-L4 y ChF-L10
tuvieron mejores resultados cuando se inocularon 5 d antes que el patgeno y
confirman lo reportado en la literatura, adems de ratificar los resultados obtenidos
en las pruebas de confrontacin in vitro.

En conclusin, se aisl y evalu levaduras con el fin de encontrar cepas con una
alta capacidad antagnica contra C. gloeosporioides capaces de inhibir el
crecimiento de un hongo fitopatogeno en frutos.

8
 ABSTRACT

Currently, control of postharvest diseases is carried out by using chemical

fungicides, however, given the growing concern about the development of resistance
by pathogens, chemical residues in products, environmental impact being
generated, there is great interest from producers and traders to use alternate
products to chemical fungicides, with similar standards of effectiveness and price.
An alternative is biological control using antagonistic microorganisms, such as
yeasts epiphytes leaves and fruits.

The aim of this work was to isolate yeast surface of different leaves and fruit, try their
antagonistic activity in vitro and in vivo against Colletotrichum gloeosporioides.

In the first stage the isolation of flora epiphytic yeast-mico different leaves and fruits
was performed. The antagonism in vitro test was performed using confrontation in
dual cultures (antagonist-pathogen), yeasts isolated against C. gloeosporioides,
using four different culture media (PDA YPGA, YMGA and YPDA). Based on the
formation of halos of inhibition, 4 strains (ChF-L8-L10 ChF Cif-L4-L5 and CaH),
yeasts inhibited by 100% radial growth of C. gloeosporioides, were selected in the
four means of culture were strains referred to as CHF-L8, ChF-L10, and CaH-L5,
and CIF-L4 strain on PDA medium is where exerted greater inhibitory effect on C.
gloeosporioides, although in the middle YPDA the inhibition was 83% and to a lesser
extent in YPGA (66%) and YMGA (68%) means.

Antagonist in M2 was inoculated and incubated for 5 d, then the pathogen,

incubating for 24 d was inoculated, the ChF-L10 strains showed similar results to
those obtained M1, CIF-L4 was less mycelial growth of C. gloeosporioides in wound
unlike the M1, however, the strain-L5 CaH be the best evidenced by not allowing the
growth of C. gloeosporioides compared to M1 where the pathogen injuries ChF-L8
and the diameter of the lesion appeared decreased from 1 to 3 cm. The strains
referred to as CaH-L5, L4 and CIF-ChF-L10 had better results when inoculated 5 d
before the pathogen and confirmed that reported in the literature, while ratifying the
results of in vitro tests confrontation.

In conclusion, we were isolated and evaluated yeast in order to find strains with high
antagonistic capacity against C. gloeosporioides. This is the first step in selecting
strains rationally to be used effectively in the biological control of C. gloeosporioides
causing anthracnose fruit post-harvest a crop of economic importance in our country.

9
 INTRODUCCIN

El uso de agentes qumicos en el control de hongos y pudriciones en algunas frutas

y hortalizas mediante la aplicacin postcosecha de fungicidas y pesticidas ha sido
una prctica comn en el control de hongos y pudriciones. Sin embargo, el uso de
estos compuestos qumicos se ha restringido debido a sus efectos carcingenos,
teratognicos, residuabilidad alta y aguda, periodo largo de degradacin,
contaminacin ambiental y otros efectos negativos en alimentos y humanos. Por
otro lado, se tienen numerosos reportes acerca de que debido a la aplicacin intensa
de productos sintticos se ha generado resistencia en los microorganismos
patgenos (Tripathi y Dubey, 2004).

Como modelo de estudio y de manera prctica, las levaduras son particularmente

convenientes para ser usadas en el biocontrol de hongos fitopatgenos
postcosecha, debido a que poseen diversas caractersticas en funcin de preservar
la vida del fruto, tales como: la rpida colonizacin en heridas de los frutos, la
competencia por nutrientes, la interaccin directa con las hifas y la produccin de
enzimas lticas degradadoras de pared celular (Lima et al., 1999). En los ltimos 15
aos el control biolgico mediante el uso de microorganismos como bacterias,
levaduras y hongos ha sido efectivo en el control de enfermedades pos cosecha
(Janisciewicz y Korsten, 2002).

La seleccin de microorganismos benficos se basa principalmente: 1) en la

habilidad de los antagonistas para colonizar rpidamente la superficie de la fruta y
las heridas y persistir en ellas en niveles efectivos, 2) en su capacidad para superar
al patgeno en la adquisicin de nutrientes y 3) en que sobreviva y se desarrolle
bajo una amplia gama de condiciones ambientales (Wisniewski y Wilson, 1992).

10
 MARCO TERICO

Control biolgico

Se define al Control biolgico o Biocontrol como la utilizacin de los

microorganismos que naturalmente se encuentran en las plantas, para reducir la
enfermedad causada por un patgeno (Fig. 1). Se supone que el control biolgico
de enfermedades causadas por patgenos en plantas se produce naturalmente,
principalmente en las superficies areas de la planta y puede ser una de las razones
principales por qu los cultivos estn protegidos en cierta medida durante su cultivo
(Droby et al., 1996).

Figura. 1. Pirmide de la enfermedad (Droby et al., 1996).

11
Antagonismo

El antagonismo se refiere a la interaccin que existe entre dos tipos de organismos

de forma que el crecimiento de uno se inhibe parcial o totalmente por la presencia
del otro. El antagonismo entre los microorganismos es un fenmeno omnipresente
donde participacin hongos (incluyendo levaduras) y bacterias que naturalmente
habitan en el suelo y las superficies de diversos rganos de la planta (Blakeman y
Fokkema, 1982).

Las levaduras como agentes de control biolgico

Las levaduras son organismos eucariotas unicelulares pertenecientes al reino de

los hongos (Fung), de forma esfrica u oval y que se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza. Tienen un nmero de cualidades que las hacen
convenientes para ser utilizadas como agentes de biocontrol de enfermedades
postcosecha como: colonizar y sobrevivir rpidamente en la superficie de la fruta,
incluso en condiciones adversas y por un largo perodo de tiempo; producen
polisacridos extracelulares que mejoran su capacidad de supervivencia y
restringen la colonizacin, el flujo de las seales de la germinacin, el crecimiento y
propagacin de patgenos; son muy eficientes en utilizar los pocos nutrientes
disponibles y proliferar rpidamente; y son menos afectados por los pesticidas las
cuales a su vez pueden utilizar uno o ms mecanismos de accin antagonista
(Sharma et al., 2009)

Se han reportado varios microorganismos antagonistas en condiciones de

laboratorio, que inhiben con eficacia el desarrollo de patgenos postcosecha en
diversas frutas y hortalizas, sin embargo, son pocos los antagonistas microbianos
que se han logrado comercializar. En cuanto a las levaduras solo hay un producto
desarrollado, el cual contiene la levadura Candida oleophila cepa 1182, llamado

12
Aspire que inhibe el desarrollo del moho azul, verde y gris, para el uso en ctricos,
peras y manzanas (Droby et al., 1998).

Propiedades de una levadura de control biolgico

Para seleccionar a las levaduras antagonistas se deben considerar las siguientes

caractersticas generales:

Capacidad para colonizar rpidamente la superficie de los frutos y de persistir

en ellas de manera efectiva.
Mayor habilidad que el patgeno para adquirir los nutrientes en el medio.
Capacidad de sobrevivencia bajo diferentes condiciones ambientales

Por otra parte, se deben considerar otras caractersticas especficas del

microorganismo antagonista:

Estabilidad gentica
Bajos requerimientos nutricionales
Capacidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas
Amplio espectro contra microorganismos patgenos de frutos y hortalizas
Capacidad de reproducirse en medios de crecimiento econmicos
Mantenimiento prolongado en la formulacin
Fcil aplicacin sin produccin de metabolitos secundarios que causen
daos a la salud humana
Resistencia y compatibilidad a fungicidas usados comercialmente
No patognico sobre el hospedador

Hay diversas levaduras con actividad antagnica, pero algunas de las ms

estudiadas son las que se muestran en la (Cuadro A).

13
 Cuadro A. Levaduras de control biolgico ms analizadas

Microorganismos Microorganismos Enfermedad

Antagonistas Fito patgenos
Colletotrichum
Bacillus licheniformis Antracnosis en mango
gloesporoides

Penicillium expansum y
Pseudomona cepacea Pudriciones en naranjas
Penicillium digitatum

Pseudomona cepacea Penicillium digitatum Moho verde en limn

Pseudomona cepacea,
Pseudomona syringae, Penicillium digitatum y
Pudricin de los ctricos
Debaromyces hansenii, Penicillium italicum
Aureobasidium pullulans

B. cinrea, P. expansum Pudriciones en naranjas,

Candida saitoana
y P. digitatum manzanas y limones

B. cinrea y P.
Candida oleophila Pudriciones en duraznos
expansum

Candida famata P. digitatum Pudriciones en naranja

Colletotrichum
Rhodotorula minuta Antracnosis en mango
gloesporoides

Moho verde de los

Verticillium lecanii P. digitatum
ctricos

14
Aislamiento de levaduras antagonistas

Janisiewicz y Korsten en el 2002 reportaron que la superficie del fruto (fructoplano)

es el mejor lugar para el aislamiento de microorganismos antagonistas los cuales
pueden suprimir el desarrollo de hongos fitopatgenos, tambin la superficie de las
hojas (filo plano) constituye otra fuente de aislamiento de antagonistas. El
aislamiento de los microorganismos antagonistas puede mejorarse usando la fruta
de los huertos no fumigados, donde las poblaciones naturales no han sido
perturbadas por el uso de fungicidas qumicos, as el conjunto de antagonistas
potenciales es mayor que en un huerto manejado qumicamente o fruto manejado
(Janisiewicz y Korsten, 2002).

Pruebas de confrontacin en placa

Las pruebas in vitro para determinar la capacidad antagnica de un microorganismo

con respecto a otro, no representan el grado de antagonismo, el modo de accin y
la posible utilizacin como agente de control biolgico en condiciones naturales,
pero refleja la capacidad y variabilidad gentica del antagonista y del patgeno para
resistir al antagonismo.

En cultivos duales (patgeno y antagonista) se puede evaluar el potencial

antagnico de distintos aislamientos de levaduras a travs de la formacin de halos
de inhibicin, la medicin del dimetro alcanzado por el patgeno (en hongos
solamente) combinado con el antagonista y a partir de ello seleccionar las cepas
con actividad antagnica (Spadaro et al., 2002) encontraron que, en pruebas in vitro
la levadura Metschnikowia pulcherrima (cepas GS37, GS88, GA102 y BIO126) tuve
efectos inhibitorios contra los patgenos Botrytis cinrea, Penicillium expansum,
Alternara spp. y Monilia spp. en 6 diferentes medios de cultivo. Por otra parte,
(Chanchaichaovivat et al., 2007) aislaron 225 colonias de levaduras de la superficie
de 11 diferentes frutas y verduras, realizaron pruebas in vitro para probar su
actividad antagnica contra Colletotrichum capsici, seleccionando las de mayor
capacidad antagnica y confirmaron su eficacia para reducir la incidencia de la

15
enfermedad a diferentes concentraciones de inoculo (antagonista) mediante
pruebas in vivo en chiles. Estos autores seleccionaron 4 cepas con alto potencial
para controlar la antracnosis causada por C. capsici, adems que determinaron que
la concentracin optima de inoculo para la reduccin de la enfermedad es de 5 X
108 clulas ml-1.

Evaluar la capacidad de aprovechar diferentes nutrientes en placa es un criterio

inicial de seleccin de gran utilidad para discriminar rpidamente un gran nmero
de cepas, sin embargo, no es la nica caracterstica de adaptacin fisiolgica que
ayuda a seleccionar cepas con capacidad antagnica.

Pruebas de confrontacin in vivo

Las pruebas in vivo de las levaduras antagonistas en frutos, demuestran la viabilidad

para inhibir el desarrollo del patgeno y por ende la o las lesiones causadas por el
mismo, al proliferar rpidamente, aprovechar los nutrientes disponibles y producir
polisacridos extracelulares que mejoran su capacidad de supervivencia, limiten la
colonizacin, el flujo de las seales de la germinacin, el crecimiento y propagacin
del patgeno; tambin los experimentos in vivo confirman los resultados obtenidos
en ensayos in vitro, sin embargo, estas pruebas no demuestran la posible utilizacin
como agentes de control biolgico en condiciones naturales.

En pruebas in vitro contra C. gloesporoides de 164 distintos microorganismos (75

bacterias, 67 levaduras y 22 hongos) aisladas de hojas y frutos de papaya.
Seleccionaron 10 levaduras que fueron las que inhibieron el crecimiento del
patgeno, corroborando los resultados obtenidos en pruebas in vivo en frutos de
papaya, en estos ensayos el aislamiento (CEN63) mostro los mejores resultados,
identificada como Cryptococcus magnus, sin embargo, observaron que cuanto
mayor es la concentracin y el tiempo de aplicacin del antagonista, hay un mayor
control de la enfermedad (Capdeville et al., 2007).

16
Mecanismo de accin

Resulta un poco complejo determinar con precisin los mecanismos que intervienen
en las interacciones entre los antagonistas y los patgenos sobre los frutos. En
general, las levaduras antagonistas no tienen un nico modo de accin y la
variabilidad de estos es una caracterstica a seleccionar en un antagonista. El
patgeno puede mostrar resistencia al antagonista, reducindose al actuar este
mismo por varios mecanismos. El riego de resistencia se reduce tambin mediante
el empleo de combinaciones de antagonistas. Se han descrito varios mecanismos
de accin de los antagonistas para controlar el desarrollo de patgenos sobre los
frutos. Ellos son: antibiosis, competencia por espacio o nutrientes, interacciones
directas con el patgeno (mico parasitismo, lisis enzimtica), e induccin de
resistencia descritos a continuacin (Cook y Baker, 1983).

Antibiosis
En el caso de la produccin de antibiticos se ha demostrado que las bacterias
Bacillus subtilisB-3 produce el compuesto llamado iturina que inhibe el
crecimiento radial y germinacin del hongo Monilinia frutcola, otra bacteria
importante es Pseudomona cepaciaLT-4-12 que sintetiza la pirrolnitrina y
controla a Penicillium expansum y Botrytis cinrea causantes de la pudricin
agria en limones y en frutas de hueso (manzana, pera, etc.), respectivamente.
Igualmente, Pseudomona syringae produce el compuesto nombrado
siringomicina que inhibe la germinacin de Penicillium digitatum y controla las
pudriciones ocasionadas por este hongo en varios ctricos (Bull et al., 1998).

Colonizacin e inoculo
La colonizacin solamente puede ocurrir a partir de cualquier residente en el
ambiente o por el transporte a travs del viento, agua, animales o humanos. Este
mecanismo de antagonismo se basa en la capacidad del antagonista para crecer
ms rpido que el patgeno. La colonizacin por microorganismo introducidos
artificialmente como agentes de biocontrol depende de factores tales como la

17
cantidad del inoculo del antagonista, condiciones de crecimiento favorables para
el antagonista y condiciones desfavorables para el patgeno (Campbell,1989).

Competencia por nutrientes

La competencia ocurre cuando dos o ms organismos requieren de los mismo
recursos o substratos, y el uso de estos por uno, reduce la cantidad disponible
para el otro: un organismo obtiene ms de los nutrientes y crece, mientras que
el otro le es insuficiente y muere. Esto sucede especficamente con las fuentes
de carbono y nitrgeno, as como tambin por el oxgeno, espacio y en el caso
de auttrofos por la luz (Campbell, 1989).

Parasitismo
Adems de la competencia por nutrientes y espacio, se ha observado que el
antagonista microbiano parasita directamente al agente patgeno. Por ejemplo,
en un estudio a nivel celular entre el antagonista C. saitoana y el patgeno B.
Cinerea, observaron que las clulas de esta levadura se adhirieron a las hifas
del patgeno, causando hinchamientos y ruptura de la pared celular en la
estructura de la hifa.

Produccin de enzimas lticas e induccin de resistencia.

Adems de los aspectos antes mencionados en el control biolgico, se ha
demostrado que la produccin de enzimas hidrolticas es una parte importante
dentro de los mecanismos de accin de los agentes antagonistas. Por ejemplo,
la levadura Pichia guilliermondii produce la enzima hidrolasa , 1-3 glucanasa
durante el proceso de adhesin a la hifa de B. cinerea. En otros estudios se
demostr que el antagonista Pseudomona anmala tuvo una produccin tres
veces mayor de la enzima exo-, 1-3 glucanasa en presencia de una suspensin
de esporas de B. cinerea. Asimismo, otra actividad enzimtica como la
produccin de quitinasa fue evidente en la relacin del antagonista
Aureobasidium pullulans, en algunas pudriciones postcosecha en manzanas y
uvas causadas por Penicillium expansum y B. cinerea. Por otro lado, la

18
produccin de las fitoalexinas escorpacona y escopoletina en naranjas se
increment en frutas tratadas con la levadura C. famata, reducindose a la vez
los niveles de infeccin causados por Penicillium digitatum (Arras, 1996).

Integracin del control biolgico con otros mtodos de control.

Con la finalidad de potenciar el efecto fungicida de los mtodos alternativos de
control de microorganismos postcosecha, se ha buscado la combinacin de
estos con el control biolgico. Por ejemplo, la aplicacin de Candida spp. con
2% de cloruro de calcio mejor el control de las pudriciones verde y azul en
manzanas. En toronjas, el cloruro de calcio por s solo no tuvo la misma
efectividad que cuando se aplic en combinacin con el antagonista Pichia
guilliermondii en el control de Penicillium digitatum. tambin se han probado en
el control de patgenos postcosecha como Penicillium digitatum en ctricos
dando resultados alentadores. En otro estudio reportaron que previa a la
aplicacin de la cepa antagonista, los tratamientos con calor redujeron en su
totalidad las pudriciones causadas por Penicillium expansum en manzanas y
peras. An ms el control de ste microorganismo patgeno fue efectivo cuando
los tratamientos con calor se aplicaron 24 h despus de la inoculacin con cepas
tolerantes al calor. Sin embargo, la aplicacin de luz ultravioleta (UV) en
combinacin con antagonistas no ha dado ningn resultado positivo, tal vez
debido a la estrecha longitud de onda con que los productos hortofrutcolas
pueden ser irradiados y por otro lado con la variabilidad en la induccin de
resistencia segn el estado de madurez del producto.

19
 JUSTIFICACIN

Desde tiempos atrs la actividad agrcola se ha visto perjudicada por patgenos que
invaden los cultivos postcosecha, los cuales eran controlados con pesticidas e
insecticidas, pero estos son dainos hacia la salud humana al ser cancergenos,
teratognicos y tambin el uso de tales componentes qumicos generaba una
reaccin contradictoria hacia los comerciantes ya que los patgenos fueron
hacindose resistentes a dichos insecticidas, por ello se implement el control
biolgico mediante el uso de microorganismos antagonistas lo cual es una solucin
a estos problemas que se presentan actualmente.

Esta investigacin se hace con la finalidad de que se logren descubrir nuevos

microorganismos que funjan como antagonistas y ya no existan tantas perdidas
econmicas en cuestiones de conservacin de frutos, est basada ms que nada
en levaduras ya que estas poseen ciertas cualidades que las hacen mejores
candidatas a enfrentamientos con los patgenos y a su vez ayuden a controlar su
aparicin en los frutos despus de la cosecha, prolongando su vida de anaquel y
que estas lleguen en buenas condiciones para su venta.

20
 OBJETIVOS

Objetivo general:

Realizar pruebas de antagonismo con levaduras en hongos patgenos de los

frutos para mejorar el sector hortofrutcola postcosecha.

Objetivos especficos:

Aislar levaduras del filo plano de las hojas y del fructoplano de distintas
especies.

Hacer pruebas de confrontacin in vitro e in vivo entre la levadura y el hongo

fitopatgeno.

Identificar las levaduras con capacidad antagnica sobre hongos

fitopatgenos.

Demostrar los beneficios del control biolgico implementando levaduras

antagnicas en los cultivos postcosecha.

21
 METODOLOGIA

Todos los experimentos mustrales y analticos de dicho proyecto se realizaron en

los laboratorios del Centro de Investigacin de Biotecnologa Aplicada del Instituto
Politcnico Nacional (CIBA-IPN) ubicado en la Ex-Hacienda San Juan Molino
Carretera Estatal Tecuexcomac-Tepetitla Km 1.5, Tlaxcala, Mxico.

Colecta de las muestras.

Se realizaron diversos muestreos en distintas localidades cercanas al Centro de

Investigacin en Biotecnologa Aplicada (CIBA). Las muestras fueron tomadas de
algunos frutos y tambin de hojas de frutos, los cuales se presentan en la (Cuadro
B)

Cuadro B. Muestras recolectadas

Frutos Hojas de frutos

Pera
Ciruela Chicozapote
Durazno Ciruela
Capuln Manzana
Chabacano Naranja
Limn Guayaba
Manzana Mango
Aguacate

Aislamiento de levaduras de la superficie de hojas y frutas.

Los aislamientos de levaduras fueron obtenidos de la superficie de hojas (filo plano)

y de la superficie de frutos (fructoplano). Se realizaron 2 mtodos de aislamiento.

El primer mtodo fue el aislamiento de levaduras a partir de hojas, fue mediante el

procedimiento de Buck (2002), se tom la muestra de una hoja y se sumergi en
tubos de 50 ml con 25 ml de agua destilada estril y solucin de Tween 20 al 0.05%

22
durante 60 minutos, se vortexeo por 30 segundos (figura 2a), se tom una alcuota
de 100 l y se dispers en placas de Agar Papa Dextrosa (PDA) con Cloranfenicol
500 mg/L, incubndose a 29 1 C durante 48-72 hrs, se seleccionaron colonias
de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas, fueron purificadas por siembra en
medio YPGA hasta obtener cepas puras.

El segundo mtodo de aislamiento de levaduras a partir de frutos fue por medio del
procedimiento de Abraham et al. (2010) con algunas modificaciones, las seis
muestra de frutas fueron cortadas en 10 a 15 piezas con un peso total de 50 grs,
agregndolas en matraces Elenmeyer de 250 ml con 100 ml de agua destilada
estril y solucin de Tween 20 al 0.05%(figura 2b), los matraces se incubaron
durante 120 minutos a 29 1 C con agitacin constante (125 rpm), se realizaron
diluciones seriales de 10-1 a 10-4, de las diluciones 10-2 y 10-4 se tom una alcuota
de 200l y se dispers en placas de Agar Papa Dextrosa (PDA) con Cloranfenicol
500 mg/L, incubndose a 29 1 C durante 48-72 hrs, se seleccionaron colonias
de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas, fueron purificadas por siembra en
medio YPG hasta obtener cepas puras. Todas las cepas fueron mantenidas en
glicerol al 30% a -70 C.

a b
Figura 2. a) Aislamiento de levaduras a partir de hojas de pera, b) aislamiento de
levaduras a partir de frutos de guayaba y manzana.

23
Microorganismos utilizados

se utiliz un hongo fitopatgeno Colletotrichum gloeosporioides (CDBB-H-1340),

perteneciente a la Coleccin Nacional de Cepas Microbianas y Cultivos Celulares
del CINVESTAV IPN, el cual se reactiv en medio PDA.

Determinacin del antagonismo de levaduras in vitro

Se realiz una evaluacin preliminar de C. gloeosporioides en los medios utilizados

(YPDA; YMGA; YPGA y PDA pH 7.2, Anexo 1), donde la placa que contena C.
gloeosporioides se le hizo horadaciones cilndricas 4 mm de dimetro por 5 mm de
altura y se coloc en el centro de las placas (60X10 mm) con los diferentes medios
de cultivo, se incubaron a 29 1 C, se hicieron observaciones diariamente y se
midi el dimetro radial y determinar si los medios influan en su crecimiento.

La capacidad de las levaduras para ejercer un efecto antagnico fue determinada

usando cuatro diferentes medios de cultivo YPDA; YMGA; YPGA y PDA ( Anexo 1),
en los cuales se sembr 2 levaduras en cada uno de los dos puntos equidistantes
de la placa a una concentracin de 1X108 UFC/ml, donde se manejaron tres tiempos
de crecimiento de las levaduras: 0 (T0), 48 (T48) y 96 (T96) hrs a 29 1 C. Por otra
parte, se reactiv en PDA el hongo C. gloeosporioides, para la prueba de
antagonismo la placa que contena al hongo se le hizo horadaciones cilndricas
utilizando la base de una pipeta Pasteur de vidrio estril (4 mm de dimetro por 5mm
de altura), y se coloc en el centro de la placa petri que contena a las levaduras
con 0 (T0), 48 (T48) y 96 (T96) hrs de crecimiento, se incubaron a 29 1 C. A lo
largo de 7 das se observ si las levaduras eran o no capaces de ejercer un efecto
antagnico, al formar un halo de inhibicin, se compar con la colonia del hongo
que creca en los diferentes medios sin la presencia del antagonista. Las levaduras
de coleccin (Pichia guillermondii, Candida oelophila, Candida oelophila, Candida
saitoana y Candida sake), se llevaron a una concentracin de 1X108 UFC/ml, se
realiz el mismo procedimiento para determinar si ejercan un efecto antagnico a
C. gloeosporioides.

24
De las levaduras aisladas y que formaron un halo de inhibicin se seleccionaron y
se tomaron 25 l a una concentracin de 1X108 UFC/ml de cada una de las
levaduras y se dispersaron en placas (100X10 mm) que contenan los medios
utilizados (YPGA, YMGA, YPDA Y PDA), se incubaron a 29 1 C por cuatro das.
Por otra parte C. gloeosporioides se creci de forma individual, en PDA, se le hizo
horadaciones cilndricas 4mm de dimetro por 5mm de altura, y se coloc en el
centro de la placa petri que contena a las levaduras con cuatro das de crecimiento
en los diferentes medios. A lo largo de 10 das se observ si el fitopatgeno era o
no capaz de crecer sobre el antagonista, y se midi el radio final de la colonia del
hongo, comparndose el valor con el de una colonia que creca en los diferentes
medios sin la presencia del antagonista.

Cada prueba se hizo por lo menos por duplicado, y se reporta los valores obtenidos.

Determinacin del antagonismo de levaduras in vivo

Las levaduras que mostraron un efecto antagnico en las pruebas in vitro, se

llevaron a una concentracin de 1X108 UFC/ml. La cepa de C. gloeosporioides se
llev a una concentracin de 1x104 UFC/ml.

Evaluacin preliminar de C. gloeosporioides en frutos.

Para los bioensayos preliminares de C. gloeosporioides sobre frutos (in vivo) se

emplearon, 18 limones (C. aurantifolia), se lavaron con una solucin de hipoclorito
de sodio al 1.5% durante 1 min, se enjuagaron con agua destilada estril, se dejaron
secar en campana de flujo laminar por 10 min. En la zona ecuatorial de la superficie
de los frutos se hizo una perforacin con una navaja estril en forma de cubo (5 mm
por lado), manejando 2 diferentes tamaos de profundidad 9 mm (P1) y 3 mm (P2).
A los cuales se les agrego: 0 l (Cn0), 10 l (Cn10) y 20 l (Cn20) de caldo nutritivo
se dej secar, despus se inocularon 20 l de la suspensin del hongo (1x10 4
UFC/ml) en la herida, se dej secar, los frutos se colocaron en placas petri de vidrio

25
estriles, las cuales se pusieron en palanganas desinfectadas y se incubaron a 29
1 C, se realizaron observaciones diariamente, para determinar el tiempo de
infeccin de C. gloeosporioides

Accin antagnica de levaduras seleccionadas en frutos.

Para los bioensayos in vivo sobre frutos se emplearon 72 limones (C. aurantifolia),
se lavaron con una solucin de hipoclorito de sodio al 1.5% durante 1 min, se
enjuagaron con agua destilada estril, se dejaron secar en campana de flujo laminar
por 10 min. En la zona ecuatorial de la superficie de los frutos se hizo una
perforacin con una navaja estril en forma de cubo (5 mm por lado), con una
profundidad de 9 mm.

Se manejaron dos diferentes mtodos de inoculacin de las levaduras y el hongo

(C. gloeosporioides); en el primer mtodo (M1) se sigui el procedimiento propuesto
por Abraham et al. (2010) y Snchez et al. (2008) con algunas modificaciones, el
cual se describe brevemente a continuacin: en la herida se depositaron 20 l de
caldo nutritivo se dej secar, se agregaron 25 l de la suspensin de la levadura
(1X108 UFC/ml) y se dej secar durante 3 hrs, posteriormente se inocularon 20 l
de la suspensin del hongo (1x104 UFC/ml) en la herida, los frutos se colocaron en
placas petri de vidrio estriles, las cuales se pusieron en palanganas desinfectadas
y se incubaron a 29 1 C; se determin el dimetro de la lesin despus de 4,8,
12, 16, 20 y 24 das de incubacin.

En el segundo mtodo (M2), en la herida se depositaron 20 l de caldo nutritivo se

dej secar, posteriormente se inocularon 25 l de la suspensin de la levadura
(1X108 UFC/ml) y se dej secar, se incub durante 5 das a 29 1 C,
posteriormente se inocularon 20 l de la suspensin del hongo (1x10 4 UFC/ml) en
la herida, los frutos se colocaron en placas petri de vidrio estriles, las cuales se
pusieron en palanganas desinfectadas y se incubaron a 29 1 C; se determin el
dimetro de la lesin despus de 4,8, 12, 16, 20 y 24 das de incubacin.

26
 RESULTADOS

Aislamiento y purificacin de levaduras de la superficie de hojas y frutas

Un total de 33 levaduras se logr aislar, 14 levaduras fueron aisladas de hojas y 19

levaduras aisladas de frutos (Cuadro C), en las hojas de Capuln fue donde se logr
aislar ms levaduras (Figura 3), mientras que las hojas de chabacano y aguacate
no se logr aislar levaduras; en los frutos se aislaron 19 levaduras de las cuales 10
corresponden a l chicozapote, 8 a frutos de ciruela y una a frutos de capuln (se
colecto junto con las hojas) (figura 4), en los frutos: manzana, naranja, guayaba y
mango no se logr aislar levaduras solo algunas bacterias que no fueron inhibidas
con el cloranfenicol y algunos hongos.

5
No. de levaduras

0
Capuln Pera Durazno Ciruela Limn Manzana
Hojas de Frutos

Figura 3. Total, de levaduras aisladas de la superficie de hojas de diferentes

frutos.

27
 10
9
8
No. de levaduras

7
6
5
4
3
2
1
0
Chicozapote Ciruela Capuln
Frutos

Figura 4. Total, de levaduras aisladas de la superficie de diferentes frutos.

Cuadro C. Levaduras aisladas de la superficie de diferentes hojas y frutos

Levaduras aisladas de la superficie de Levaduras aisladas de la superficie de

frutos hojas
ChF-L1 CaH-L1
ChF-L2 CaH-L2
ChF-L3 CaH-L3
ChF-L4 CaH-L4
ChF-L5 CaH-L5
ChF-L6 CaH-L6
ChF-L7 CiH-L1
ChF-L8 CiH-L2
ChF-L9 DH-L1
ChF-L10 PH-L2
CiF-L1 PH-L3

28
 CiF-L2 RH-L1
CiF-L3 BgCO
CiF-L4 B7
CiF-L5
CiF-L6
CiF-L7
CiF-L8
CaF-L1

Influencia de los medios en el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides

Las pruebas preliminares demuestran que los medios no afectaron el crecimiento

de Colletotrichum gloeosporioides (Cuadro D; figura 5).

Cuadro D. Crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides en los cuatro

medios utilizados.

Das Medio YPDA Medio YPGA Medio PDA Medio YMGA

1 mm
1 1 mm 1 mm 1 mm
5 mm
2 5 mm 4 mm 4 mm
1.5 cm
3 1.5 cm 1.4 cm 1.4 cm
2.8 cm
4 2.8 cm 2.7 cm 2.7 cm
4.2 cm
5 4.2 cm 4.1 cm 4.1 cm

29
 YPDA YPGA

PDA YMGA

Figura 5. Crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides en los

cuatro medios utilizados.

Pruebas cuantitativas de antagonismo de levaduras in vitro

Las pruebas de evaluacin in vitro de las levaduras son importantes ya que nos dan
una visin ms clara acerca de que tan buen o mal antagonista puede resultar una
cepa. Son experimentos fcilmente controlables, y al final se tiene una perspectiva
ms acertada de la capacidad antagonista de un aislamiento.

Macroscpicamente se observa que los tiempos de crecimiento de las levaduras y

los cuatro medios utilizados (PDA, YPGA, YPDA y YMGA), influyeron de manera
significativa en la formacin de halos de inhibicin con respecto a C.
gloeosporioides.

30
 Los aislamientos elegidos fueron las levaduras denominadas ChF-L10, ChF-L8, Cif-
L4 y CaH-L5, ya que son las levaduras que fueron capaces de formaron halos de
inhibicin con respecto a C. gloeosporioides. Sin embargo, la cepa que siempre
mostro los mejores resultados tanto en los tres tiempos de crecimiento y en los
cuatro medios utilizados fue la cepa denominada CaH-L5, las cepas ChF-L10, ChF-
L8, Cif-L4, el mejor tiempo fue T96 ya que mostraron mayor inhibicin de C.
gloeosporioides en los medios PDA, YPGA y YMGA, (figuras 6, 7 Y 8).

Control + ChF-L10 ChF-L8 CiF-L4 CaH-L5

PDA

YPGA

YPDA

YMGA

Figura 6. Inhibicin in vitro de Colletotrichum gloeosporioides por las cepas

ChF-L10, ChF-L8, Cif-L4 y CaH-L5 en el tiempo cero hrs (T0) de crecimiento de
las levaduras.

31
 Control + ChF-L10 ChF-L8 CiF-L4 CaH-L5

PDA

YPGA

YPDA

YMGA

Figura 7. Inhibicin in vitro de Colletotrichum gloeosporioides por las cepas

ChF-L10, ChF-L8, Cif-L4 y CaH-L5 en el tiempo cuarenta y ocho hrs (T48) de
crecimiento de las levaduras.

32
 Control + ChF-L10 ChF-L8 CiF-L4 CaH-L5

PDA

YPGA

YPDA

YMGA

Figura 8. Inhibicin in vitro de Colletotrichum gloeosporioides por las cepas

ChF-L10, ChF-L8, Cif-L4 y CaH-L5 en el tiempo noventa y seis hrs (T96) de
crecimiento de las levaduras.

Las pruebas de inhibicin del crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides se

realizaron en cajas petri con los diferentes medios, inoculando las levaduras
seleccionadas, crecidas cuatro das, despus inoculando en el centro de la placa un
disco de 4 mm de dimetro de C. gloeosporioides y midindose el radio alcanzado
por la colonia a lo largo de 10 das. El porcentaje de inhibicin se calcul
determinando la diferencia en porcentaje del rea cubierta por C. gloeosporioides
en ausencia y en presencia de la levadura. As, un 0% es cuando la levadura no
afecta la tasa de crecimiento del hongo, mientras que un 100% de inhibicin significa

33
 que la levadura impide totalmente la extensin radial del hongo. Los resultados
cuantitativos se muestran en las (figuras 9 y 10).

Control + ChF-L10 ChF-L8 CiF-L4 CaH-L5

PDA

YPGA

YPDA

YMGA

Figura 9. Efecto en el crecimiento in vitro de C. gloeosporioides por las

levaduras ChF-L10, ChF-L8, Cif-L4 y CaH-L5.

34
 100

80

60
% Inhibicion
40

20
0

YMGA
YPDA
YPGA
Levaduras PDA Medios de cultivo

Figura 10. Efecto de las levaduras ChF-L10, ChF-L8, Cif-L4 y CaH-L5 en el

porcentaje de inhibicin in vitro de C. gloeosporioides.

A pesar de las de que las cuatro cepas de levaduras aisladas demostraron ser
efectivas en el control de C. gloeosporioides, como lo podemos observar en la
(figura 10), los aislamientos ChF-L10, ChF-L8 y CaH-L5 mostraron los mejores
resultados al inhibir al 100% en los cuatro medios, mientras que Cif-L4 el mejor
medio fue PDA donde inhibi al 100%, seguido del medio YPDA con un 83%, y en
menor proporcin en los medios YPGA y YMGA con un 66 y un 68%
respectivamente. Sin embargo, no es posible determinar qu mecanismos de accin
que se estn llevando acabo.

Evaluacin preliminar de C. gloeosporioides en frutos.

Las observaciones realizadas diariamente en el ensayo preliminar in vivo de C.

gloeosporioides en limones (C. aurantifolia), evidenciaron que a partir del da 16
despus de haber inoculado el patgeno e incubado a 29 1 C, en la herida de

35
los limones con la profundidad uno (P1) y 20 l de caldo nutritivo (Cn20) se hacen
notorios los sntomas de antracnosis, mientras que en los limones con la misma
profundidad, 0 y 10 l de caldo nutritivo respectivamente (Cn 0 y Cn10) y en la
profundidad dos (P2) con las diferentes concentraciones de caldo nutritivo (Cn0, Cn10
y Cn20) no se evidencian sntomas de antracnosis (figura 11). Por lo cual se
determina que en las pruebas de confrontacin de las levaduras seleccionadas
contra C. gloeosporioides en limones, las observaciones se realizaran cada cuatro
das, durante 24 das despus de haber inoculado el antagonista y el fitopatgeno.

Figura 11. Desarrollo de la lesin causada por C. gloeosporioides

in vivo en las diferentes profundidades (P1= 9 mm de profundidad
y P2= 3 mm de profundidad) adicionadas con 20 l de caldo
nutritivo (Cn 20) despus de 22 d de incubacin a 29 1.

Efecto de los antagonistas en el desarrollo de la antracnosis en frutos.

Las cepas denominadas como CaH-L5, CiF-L4 y ChF-L10 presentan una capacidad
considerable para reducir el progreso de la antracnosis en frutos, corroborando los
resultados obtenidos en las pruebas de confrontacin in vitro, aunque no es el caso
para la cepa ChF-L8, ya que en los ensayos in vitro inhibi al 100% el desarrollo del
patgeno y en los ensayos in vivo se observan los sntomas de antracnosis causada
por C. gloeosporioides.

36
Por ltimo, se confirm si las 4 cepas de levaduras causaban algn dao al fruto sin
la presencia del patgeno, en la (figura 12) se puede observar que ninguna de las
levaduras causo dao alguno en el fruto.

ChF-L8 ChF-L10 CiF-L4 CaH-L5

Figura 12. Ausencia de lesiones causadas por las cepas de levaduras ChF-
L8, ChF-L10, CiF-L4, CaH-L5 despus de 24 d de incubacin a 29 1.

37
 DISCUSIN

Los microorganismos para ser considerados como antagonistas deben tener las
siguientes caractersticas generales: a) capacidad para colonizar rpidamente la
superficie de los frutos y de persistir en ellas de manera efectiva, b) mayor habilidad
que el patgeno para adquirir los nutrientes, y c) capacidad de sobrevivencia bajo
diferentes condiciones ambientales (Wisniewski y Wilson, 1992). Las 4 levaduras
aisladas ChF-L8, ChF-L10, CiF-L4 y CaH-L5, 3 de fructoplano y 1 de filo plano
cumplieron con esas caractersticas.

El uso de antagonistas microbianos aplicados en la etapa postcosecha es factible

debido a que estn sujetos a menores cambios medio ambientales ya que el
almacenamiento controlado es prctica comn en el manejo postcosecha (Arras,
1996)

Las levaduras antagnicas no deben causarle dao alguno al hospedador

(Wisniewski, 1992). Como tal fue comprobado que estas levaduras no le
ocasionaron ningn dao al fruto cuando fue la confrontacin in vivo.

El uso de microorganismos antagonistas para controlar las enfermedades

postcosecha se plantea mediante dos enfoques importantes, que consisten en la
estimulacin y el manejo de los antagonistas presentes sobre la superficie del fruto,
y en la introduccin artificial de antagonistas contra los patgenos. ste ltimo, se
favorece bajo las condiciones actuales de almacenamiento controlado de los
productos (Wisniewski y Wilson, 1992). Son diversos los efectos benficos de los
microorganismos que durante aos han sido utilizados, en esta rea de estudio se
abren potencialmente las perspectivas del empleo de los microorganismos
antagonistas para controlar las enfermedades postcosecha.

38
 CONCLUSIN

Cabe sealar que, segn lo descrito por Wilson, las levaduras aisladas que
cumplieron con las caractersticas especificadas fueron ChF-L8, ChF-L10, CiF-L4 y
CaH-L5, pero tiene mucha importancia el tiempo de incubacin, ya que en los
diversos experimentos tenan diferentes tiempos de incubacin y se demostr que
tienen mayor eficacia cuando ya crecieron al menos 3 das antes de hacer la
confrontacin con el patgeno. Y se realizaron por duplicado o triplicado las
pruebas para comprobar que estas levaduras si fungen como antagnicas.

Las dems levaduras aisladas cumplieron con muy pocas de las necesidades para
ser antagnicas es por eso que no son consideradas como levaduras antagnicas.

El control biolgico constituye una tecnologa emergente y muy buena para

controlar las enfermedades postcosecha, y ahora implementando levaduras
antagnicas, tales enfermedades y problemticas se vern reducidas
implementando una nueva demanda econmica para la produccin hortofrutcola ya
que gastara menos en fungicidas que solo creaban resistencia ocasionando otra
problemtica, y para la poblacin en general, a la que le duraran ms sus frutos
sin producirse antracnosis ocasionada por hongos patgenos.

39
 REFERENCIAS

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45
 ANEXOS

Medios de Cultivo (cantidades utilizadas).

YPDA
1000 ml de agua
40 gr de dextrosa
16 gr de agar bacteriolgico
10 gr de extracto de levadura
20 gr de peptona de casena

YPGA
1000 ml de agua
40 gr de glucosa
16 gr de agar bacteriolgico
5 gr de extracto de levadura
5 gr de peptona de casena

YMGA
1000 ml de agua
20 gr de glucosa
16 gr de agar bacteriolgico
5 gr de extracto de levadura
3 gr de extracto de malta

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