UNIVERSIDAD DE COLIMA

Facultad De Ciencias Qumicas

Anlisis Clnicos I

Practica #1:

Profesora: QFB. Edith Rodrguez Garay

Integrantes:
Oscar Abel Crdenas Garca
Abril Espaa Fonseca Len
Nancy Elizabeth Garca Diaz
Daniela Del Roco Gonzlez Ramrez
Juan Manuel Herrera Zamora
Fernando Osuna Lpez
Jennifer Ploneda Espndola

13- septiembre-2017
Resumen
En esta prctica se busc obtener o determinar el factor de calibracin para evaluar la
actividad enzimtica de una enzima de inters clnico, en este caso la fosfatasa alcalina con
el kit de spinreact, se llev a cabo el procedimiento que marcaba el inserto de spinreact para
estas valoraciones, se sabe que esta enzima se encuentra en diversos tejidos del organismo y
que su concentracin es alta en ciertos rganos, los valores de esta enzima se pueden ver
afectados de distintas maneras y es de importancia clnica valorarlos, los valores de referencia
de esta enzima van de 218-280 UI/L, comparando nuestros resultados obtenidos en la prctica
se observa un valor dentro de los valores de referencia.

Introduccin
En las pruebas enzimticas, la carencia o difcil acceso a estndares o calibradores
enzimticos, obliga al empleo de un factor de calibracin, el cual es proporcionado por el
fabricante del reactivo y aparecen en el inserto de los mismos. Antes de aplicar el factor en
el trabajo rutinario debe evaluarse empleando un suero valorado y realizar la modificacin
del mismo en base al valor de actividad enzimtica esperada. Del clculo correcto de dicho
factor depender la exactitud de los resultados. Este ajuste del factor lleva implcitas las
caractersticas del equipo empleado y de las condiciones de analticas y ambientales de cada
laboratorio.
En las mediciones de actividad enzimtica, se emplean mtodos cinticos, el delta de
absorvancia representa la aparicin del producto o la desaparicin del sustrato y es
directamente proporcional al tiempo, en este caso en factor de calibracin ser AEcal/Acal
(AEcal=actividad enzimtica del calibrador, Acal=delta de absorbancia del calibrador)

Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del
organismo, siendo particularmente alta su presencia en huesos, hgado, placenta, intestinos y
rin. Tiene importancia clnica tanto su aumento como su disminucin de los niveles en
plasma. (Wenger C. 1984)
Las causas ms probables de aumento del nivel de FAL: Enfermedad sea de Paget,
obstrucciones hepticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos y osteomalacia.
Causas ms probables de disminucin del nivel de FAL: Cretinismo y dficit de vitamina
C1,5,6. El diagnstico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y
de laboratorio. (Young DS, 2001).
Marco terico
Los estudios enzimticos se emplean en muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de
numerosas enfermedades, observando velocidades de reaccin anormales o bien observando
niveles enzimticos inadecuados en el plasma y otros tejidos.

La reaccin enzimtica se basa en la actuacin de la enzima sobre una sustancia, llamada

sustrato, catalizando su conversin en otra especfica, conocida como producto.
Normalmente algn elemento de los que intervienen en la reaccin absorbe luz a una longitud
de onda determinada, con lo que la reaccin puede seguirse por colorimetra o
espectrofotometra (Stryer L, 2003)

En esta prctica se desea obtener el factor de calibracin para evaluar la actividad enzimtica
de una enzima de inters clnico, ya que existe una carencia o es de difcil acceso la obtencin
de estndares o calibradores enzimticos.

Es por eso que generar un factor de calibracin es la mejor manera que se tiene para
estandarizar los mtodos y obtener un punto de referencia para unos resultados fiables.
(Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular)

En esta prctica se utilizar la fosfatasa alcalina. La cual es una enzima ampliamente

distribuida que hidroliza el enlace ster fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico
a pH bsico (pH ptimo entre 9 y 10) liberando fosfato inorgnico. Est presente en rin,
hgado, intestino y hueso. Las medidas de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el suero
indican la existencia de enfermedades seas degenerativas (raquitismo, osteomalacia,
hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daos hepticos. Los niveles normales
son de 44 a 147 UI/L (Unidades internaciones por litro). (X Fuentes 1998).

Desarrollo
1. Preparar Multicalibrador, muestras y suero control
2. Realizar cuidadosamente las determinaciones de una enzima, siguiendo las instrucciones
del fabricante. (Fosfatasa alcalina de spinreact)

Spinreact Fosfatasa Alcalina

1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda.405 nm
Cubeta..1 cm pas de luz
Temperatura constante.25C / 30C / 37C
2. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada o aire.
3. Pipetear en una cubeta:

RT (mL) 1,2
Muestra (L) 20

4. Mezclar, incubar 1 minuto.

5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronmetro y
leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (A/min).

Clculos

A/min x 3300 = U/L de FAL

Unidades: La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 mol
de substrato por minuto, en condiciones estndar. La concentracin se expresa en
unidades por litro (U/L).
Factores de conversin de temperaturas
Los resultados pueden transformarse a otras temperaturas multiplicando por:

Temperatura de Factor para convertir a:

medicion 25C 30C 37C
25C 1,00 1,22 2,64
30C 0,82 1,00 1,33
37C 0,61 0,75 1,00

Informe

1. Calcular la actividad del suero valorado empleando el factor que sugiere el fabricante
2. Calcular el nuevo factor (recordar que si el equipo est bien calibrado y tiene la
sensibilidad adecuada, el factor resultante deber ser semejante al del inserto del
reactivo).
3. Calcular la actividad enzimtica del suero problema y del control con el nuevo factor.
Resultados
Los resultados obtenidos durante la prctica fueron los siguientes:

TIEMPO CALIBRADOR CONTROL MUESTRA

1 minuto 0.677 0.595 0.553
2 minutos 0.780 0.649 0.589
3 minutos 0.884 0.698 0.624
4 minutos 0.988 0.748 0.660

CALIBRADOR CONTROL MUESTRA

1 0.103 0.052 0.036
2 0.104 0.049 0.035
3 0.104 0.050 0.036
PROMEDIO 0.1036 0.050 0.035

Factor= 473/0.1036 = 4,565.637

AE= F AM= 0.035

AE muestra= (4,565.637) (0.035) = 159.79 U/L = 160 U/L
AE control= (4,565.637) (0.050) = 228.25 U/L
AE calibrador = (4,565.637) (0.1036) = 472.99 = 473 U/L

Inserto
AE muestra= (3300) (0.035) = 115.5 U/L
AE control= (3300) (0.050)= 165 U/L
AE calibrador= (3300) (0.1036)= 341.88 = 342 U/L

Fosfatasa alcalina 249 (218 280)

Discusiones
Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del
organismo, siendo particularmente alta su presencia en huesos, hgado, placenta, intestinos y
rin. Tiene importancia clnica tanto su aumento como su disminucin de los niveles en
plasma. Los resultados obtenidos de la muestra se encuentran dentro de los valores de
referencia, cabe mencionar que estos valores pueden ser afectares por varios factores, por
ejemplo, ejercicio, periodos de crecimiento en nios y embarazo.
Nuestro valor del control queda dentro del valor de referencia indicado (218-280), por lo que
se comprueba que nuestros resultados son correctos. Algunos otros factores que podran
influir sera la cantidad de reactivo de trabajo que se emple, ya que la medicin por medio
de la pipeta se debe de realizar de manera que el menisco quede a la altura de la vista para
que la medicin no sea errnea; para la lectura en el espectrofotmetro la longitud de onda
debe ser la indicada en el inserto y realizar la lectura del blanco para calibrar de lo contrario
los resultados sern incorrectos. Las causas ms probables de aumento del nivel de FAL son
la enfermedad sea de Paget, obstrucciones hepticas, hepatitis, hepatotoxicidad por
medicamentos y osteomalacia. El diagnstico clnico debe realizarse teniendo en cuenta
todos los datos clnicos y de laboratorio.

Conclusiones
Las fosfatasas alcalinas son parte de los exmenes de chequeo habitual (perfil bioqumico,
pruebas hepticas). Su elevacin puede indicar una enfermedad heptica, pero tambin
pueden elevarse en otras enfermedades o incluso ser parte de fenmenos fisiolgicos como
crecimiento y embarazo.

Cuestionario
1. En las determinaciones enzimticas que sugiere un delta de absorbancia
igual a cero? cmo se procede cuando se presenta esta situacin durante el
anlisis de la actividad enzimtica de una muestra?
Que no existe actividad enzimtica, se tiene que revisar de manera detallada el procedimiento
del inserto de los reactivos, desde los volmenes que requiere, as como las condiciones en
las que se debe trabajar y verificar que los reactivos estn en buen estado, la temperatura de
incubacin, ya que esta modifica la actividad enzimtica, adems espectro debe estar
calibrado correctamente, de lo contrario las absorbancias estarn alteradas.
2.Cmo se clasifican los mtodos de ensayo de enzimas?

Mtodos de punto final:

Se ponen en contacto los reactivos (que aportan el sustrato) y la muestra biolgica (que aporta
la enzima) y tras un periodo de incubacin que supere el periodo de retardo se mide la
absorbancia. Al cabo de un tiempo establecido se detiee y se vuelve a medir la absorbancia.
No es frecuente este tipo de tcnica al presentar los inconvenientes de suponer que la reaccio
es lineal y cintica de orden cero, para que la velocidad no dependa de la concentracin de
sustrato, lo que no ocurre siempre.
Mtodos cinticos:
Consisten en medir la absorbancia varias veces con intervalos de minutos. Permite comprobar
que realmente ests en la zona lineal de la curva, zona ideal para la determinacin. Si detectan
desvos de la linealidad se puede despreciar alguna de las medidas finales de la absorbancia.
En los protocolos comerciales se indican los pasos a seguir en cada determinacin para que
el resultado sea fiable. En muchas reacciones enzimticas participan como cofactores los
complejos NAD-NADH o NADP-NADPH y en esta participacin se basan muchos mtodos
analticos.

3. Cmo se
calcula la actividad enzimtica?
Se puede determinar la actividad enzimtica analizando:
La aparicin de algn producto
La desaparicin del sustrato
La variacin de un cofactor o de algn componente de la reaccin En definitiva, la actividad
de una enzima se mide mediante la determinacin de la cantidad de sustrato formado por
unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas (pH, T) y estrictamente
controladas. (Dr. CARMEN)
4. En qu unidades se expresa la actividad enzimtica?

La Comisin de Enzimas ha recomendado una nueva unidad internacional para la actividad

enzimtica el catal (abreviadamente cat), que se define como la cantidad de actividad
enzimtica que transforma 1 mol s-1 de sustrato. La nueva unidad se halla en correlacin con
las dimensiones de las constantes de velocidad en la cintica qumica, las cuales se basan en
el segundo, en lugar del minuto. Las actividades pueden expresarse tambin en microcatales
(ucat), nanocatales (ncat) o picocatales (pcat). Una unidad enzimtica antigua es, por tanto,
igual a 1/60 ucat o bien a 16.67 ncat. En la nueva convencin la actividad especfica se
expresa en catales por kilogramo de protena, equivalente a microcatales por miligramo de
protena, y la actividad molar en catales por mol de enzima. (Mathews, Van Holde, & Ahern,
2002).

5. Cules son los factores analticos que afectan la medicin de enzimas?

Explica.

- Efecto del pH

Las enzimas actan dentro de lmites estrechos de pH (pH ptimo de la reaccin). Por
ejemplo, la pepsina (enzima estomacal) tiene un pH ptimo de 2, al graficar su actividad
enzimtica para valores crecientes de pH, comenzando desde la zona cida, se obtiene una
curva en forma de campana. El mximo de la curva corresponde al pH ptimo en el cual la
enzima tiene su mxima actividad. En medios muy cidos o muy alcalinos, la enzima se
desnaturaliza y se inactiva. Otras enzimas en cambio tienen una actividad ptima a pH
alcalino como la tripsina (enzima intestinal) (Figura 1). (reservados, 2017)
 - Temperatura

La velocidad de las reacciones enzimticas aumenta, por lo general, con la temperatura,

dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La velocidad por lo general se
duplica por cada 10C de aumento trmico. La actividad enzimtica mxima se alcanza a una
temperatura ptima, luego la actividad decrece y finalmente cesa por completo a causa de la
desnaturalizacin progresiva de la enzima por accin de la temperatura. (reservados, 2017)

A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen porque decrece la

cintica molecular, pero la accin cataltica reaparece cuando la temperatura se eleva a
valores normales para la enzima. No olvidar que una enzima humana tpica posee su ptimo
a 37 C, en cambio otros organismos como, por ejemplo, las bacterias termfilas resistentes
a altas temperaturas tienen su ptimo de actividad cercano a los 80 C (Figura 2). (reservados,
2017)
 - Concentracin de sustrato

Principalmente, la velocidad de la reaccin o catlisis vara de acuerdo a la concentracin del

sustrato.

Al aumentar la concentracin de sustrato, la actividad enzimtica aumenta, hasta alcanzar la

velocidad mxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas tienen todos
sus sitios activos ocupados (Figura 4). (reservados, 2017)

6 Cmo se procede si la actividad enzimtica es demasiado elevada y el

consumo de sustrato ocurre antes que las mediciones hayan sido completadas?
Medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminucin de
sustrato ser mnima y sta podr considerarse, por tanto, casi constante. Este
comportamiento es caracterstico de la mayora de las enzimas, En el Sistema Internacional
se designa por U (unidad de actividad enzimtica) y corresponde a los moles de sustrato
consumidos en 1 min, o bien a los moles de producto formado en 1 min.
U mol S/min mol P/min

7.- Qu son los mtodos optimizados de anlisis de enzimas?

Los mtodos optimizados son aquellos que cuando se han efectuado modificaciones en el
mtodo usual de proceder y se han obtenido resultados que estn por encima de lo regular o
lo esperado. En este sentido, optimizar es realizar una mejor gestin de nuestros recursos en
funcin del objetivo que perseguimos.

8. Cules son los mtodos de ensayo de las isoenzimas de importancia clnica?

Mtodos a punto final
Mtodos cinticos

Bibliografa

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Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1094-1098
Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001
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Salve ML, Amich S, Prieto S, Casas A. (1994). Laboratorio Clnico. Madrid. Ed.
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Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert
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Fuentes. M. j. Castieiras. J. M. Queralto . (1998). bioqumica clnica y
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Mathews, C., Van Holde, K. E., & Ahern, K. G. (2002). THE CORNER OF ENZYMES.
 reservados, D. (2017). BLOG DE BIOLOGIA. Obtenido de
https://www.blogdebiologia.com/factores-que-afectan-la-actividad-enzimatica.html