PRCTICA N 3: CUANTIFICACIN DE LA PROTENA

1. INTRODUCCIN

El comportamiento acido-bsico de las protenas determina muchas de sus propiedades en

solucin. La solubilidad de una protena vara con el pH, la temperatura, fuerza inica y la
constante dielctrica del solvente. Uno de los mtodos ms utilizados consiste en aislar la protena
por tratamiento de la materia a pH alcalino, seguida por una precipitacin en su punto isoelctrico.

Las protenas se pueden contabilizar con el mtodo espectrofotomtrico de Biuret. El fundamento

de este mtodo es siguiente: El sulfato de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o
ms enlaces peptdico dando un complejo de coloracin violeta. La intensidad del color obtenida
es una medida del nmero de enlaces peptdicos presentes en la protena.

1.1. MTODO KJELDAHL

El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos mtodos. La
forma ms habitual es su cuantificacin de forma indirecta y aproximada, bien a partir del
contenido en nitrgeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno
o dos aminocidos particulares que conforman la protena, fciles de identificar y de cuantificar
por su reactividad qumica especfica. Este segundo procedimiento conlleva una mayor
inexactitud. Desde hace ms de 100 aos se est utilizando el mtodo Kjeldahl para la
determinacin del nitrgeno en una amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos,
forrajes, fertilizantes) para el clculo del contenido en protena. Tambin se utiliza el mtodo
Kjeldahl para la determinacin de nitrgeno en aguas residuales y suelos.

Es un mtodo oficial descrito en mltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y

distintas Directivas Comunitarias. La convencin general, sobreentendida, es que la totalidad del
nitrgeno de la muestra est en forma proteica, an cuando la realidad es que, segn la naturaleza
del producto, una fraccin considerable del nitrgeno procede de otros compuestos nitrogenados
(bases pricas y pirimidnicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina
protena bruta o protena total a la obtenida por este mtodo. Con este anlisis, sin embargo,
no se determina el nitrgeno ntrico, el cianhdrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el
nitrgeno de un ncleo cclico.

2. OBJETIVOS

Establecer el flujo para la obtencin de protenas a partir de leche fresca y conserva de

pescado.
Cuantificar las protenas por el mtodo espectrofotomtrico de Biuret.

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 Comprender los fundamentos del mtodo Kjeldahl para la determinacin del
contenido en protena de un alimento.

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. MUESTRA

Leche, conserva de pescado.

Protena pura por ejemplo. casena para el patrn: disolver 50 mg de protena en 5 ml. de
H2O.
Beakers.
Pipetas.
Matraz.
Placa Petri.
3.2. REACTIVOS

Reactivo de Biuret: disolver 3 gr de sulfato de cobre CuSO4 x 5 H2O y 9 gr de trtaro

sdico potsico en 500 ml. de hidrxido de sodio 0.2 mol/Lt. aada 5 gr de yoduro de
potasio y complete hasta 1 lt con hidrxido de sodio 0.2 mol/Lt.
NaOH 0.5N
NaOH 40 %
HCl 1 N
Medidor de pH
Centrifuga
cido sulfrico QP.
cido brico QP.
Rojo de metil QP.
Verde de bromocresol QP.
cido clorhdrico 0,1 N.
Etanol QP.
Catalizadores.
3.3. EQUIPOS

Equipo Kjeldahl
Estufa.
Balanza analtica.

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. OBTENCIN DE PROTENAS DE LECHE

Para la obtencin de la casena se trabajar con la muestra de la prctica anterior.

4.2. PRUEBA DE BIURET

Preparar un blanco de agua de 2 ml y tres tubos de patrn que contengan 4, 10 y 16 mg de
protena (0.4, 1.0 y 1.6 ml de la solucin de patrn) y aadir agua hasta completar 2 ml. De las
muestras obtenidas se diluyen adecuadamente y se toman un volumen de 2 ml para mediciones
espectrofotomtricas.
Aadir 8 ml. de reactivo de Biuret en todos los tubos y mezclar. Despus de 30 min. leer la
densidad ptica en 500 nm corrigiendo con el blanco.

4.3. PRUEBA DE KJELDALH

4.3.1. FUNDAMENTO Y ETAPAS DEL MTODO KEJLDAHL
El mtodo Kjeldahl mide el contenido en nitrgeno de una muestra. El contenido en protena se
puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporcin entre la protena y el nitrgeno para
el alimento especfico que est siendo analizando, tal y como explicaremos ms adelante.
Este mtodo puede ser dividido, bsicamente en 3 etapas: digestin o mineralizacin, destilacin y
valoracin. El procedimiento a seguir es diferente en funcin de si en la etapa de destilacin el
nitrgeno liberado es recogido sobre una disolucin de cido brico o sobre un exceso conocido
de cido clorhdrico o sulfrico patrn. Ello condicionar la forma de realizar la siguiente etapa
de valoracin, as como los reactivos empleados. En este artculo docente se explica el primer
procedimiento, cuando el nitrgeno se atrapa sobre cido brico.

ETAPA DE DIGESTIN
Un tratamiento con cido sulfrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullicin
convierte el nitrgeno orgnico en ion amonio, segn la ecuacin.

Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralizacin y se ponen 2

pastillas de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre, xido de
titanio o/y xido de selenio. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de
K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Despus se adicionan 12 mL de H2SO4 concentrado
Posteriormente se digiere a 400 C durante una hora. Se sabe que la digestin ha terminado
porque la disolucin adquiere un color verde esmeralda caracterstico.

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En esta etapa, el nitrgeno proteico es transformado en sulfato de amonio por accin del cido
sulfrico en caliente. En la actualidad, para llevar a cabo este proceso se utilizan digestores
automticos que son capaces de digerir un nmero determinado de muestras al mismo tiempo.

Sistema de digestin foss

ETAPA DE DESTILACIN
Se alcaliniza la muestra digerida y el nitrgeno se desprende en forma de amoniaco. El
amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de cido brico.

Procedimiento: Despus de enfriar se coloca el tubo de mineralizacin en el destilador

automtico al cual est programada para adicionar NaOH al 40 % y agua destilada adems de
inyectar vapor. Para alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el amoniaco de las sales
amnicas. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del
tubo durante la destilacin.
El destilado obtenido es agregado automticamente a un matraz que contiene el lquido receptor
elaborado por cido brico, rojo de metil y verde de bronocresol.

Equipo de destilacin FOSS

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ETAPA DE VALORACIN O TITULACIN
La cuantificacin del nitrgeno amoniacal se realiza por medio de una volumetra cido-base
del in borato formato, empleando cido clorhdrico o sulfrico y como indicador una
disolucin alcohlica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno. Los equivalentes de
cido consumidos corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados.

CLCULOS
De la valoracin se puede calcular el nmero de equivalentes de nitrgeno recogidos, y con ste
dato se obtiene el porcentaje de nitrgeno en la muestra. Para calcular el porcentaje de protena
basta con multiplicar por un factor de conversin el % de nitrgeno calculado. Este factor de
conversin est tabulado para cada grupo de alimentos. En la tabla 1 se recogen los factores
para algunos alimentos.

Tabla 1. Factor de conversin para obtener la tasa de protena bruta a partir del
nitrgeno total.

Fuente: Elaboracin propia en base a informacin secundaria.

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FRMULA PARA CALCULAR PORCENTAJE DE PROTENAS

( ) 14.007 100
% =

Dnde:
=
=
=
=

El resultado obtenido debe de ser multiplicado con el factor (k), de acuerdo al tipo de muestra
analizada.

5. RESULTADOS

Presentar los flujos de obtencin de las protenas de soya y leche. Hacer una propuesta para
aplicacin industrial.

Comparar el mtodo de Biuret con el mtodo de Kjeldahl.

6. BIBLIOGRAFA

Braverman, J.B.S. 1980. Introduccin a la bioqumica de los alimentos. 2. Ed. Z. Berk.

Editorial El Manual Moderno. Mxico, 358pp.
Egan, H., Kirk, R.S., Sawyer, R. 1988. Anlisis qumico de alimentos de Pearson. Ed.
C.E.C.S.A. Mxico, 586pp.
Pearson, D. 1976. Tcnicas de laboratorio para el anlisis de alimentos. Ed. Acribia. Espaa
331pp.
Watty, B. M. 1982. Qumica analtica. Ed. Alhambra Universidad. Mxico, 671pp.
AOAC International: Official Methods of Analysis. 17ed. Gaithersburg, USA, 2000.
Skoog, D.A.; West, D.M.: Qumica analtica. 4ed, McGraw-Hill, 1989, pg. 231.
Adrian, J.; Potus, J.; Poiffait, A.; Dauvillier, P.: Anlisis nutricional de los alimentos, Ed.
Acribia, 2000, pg. 41-43.
Nielsen, S.: Food Analysis, Ed. Kluwer Academic/Plenum Publ, 2003, pg. 131- 142.

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